Полинуклеотид, кодирующий хромо- или флуоресцирующий мутантный полипептид, вектор экспрессии, клетка, способ получения хромо- или флуоресцирующего полипептида, набор для получения хромо- или флуоресцирующего полипептида, применение полипептида и применение полинуклеотида

Полинуклеотид, кодирующий хромо- или флуоресцирующий мутантный полипептид, вектор экспрессии, клетка, способ получения хромо- или флуоресцирующего полипептида, набор для получения хромо- или флуоресцирующего полипептида, применение полипептида и применение полинуклеотида

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В соответствии с § 119 статьи 35 закона США, в настоящей заявке испрашивается приоритет по дате подачи предварительной патентной заявки США № 60/341723, поданной 21 июня 2001 и описание которой включено в настоящую заявку в виде ссылки.

Правительство США может пользоваться правом владения данным изобретением в соответствии с грантом номер 9875939.

ВВЕДЕНИЕ

Область изобретения

Областью настоящего изобретения являются флуоресцирующие белки.

Основа создания изобретения

Мечение является инструментом для маркировки представляющего интерес белка, клетки или организма и играет существенную роль во многих применениях в области биохимии, молекулярной биологии и медицинской диагностики. Создано обширное разнообразие различных меток, включая радиоактивные метки, хромометки, флуоресцентные метки, хемилюминесцентные метки и т.д. Тем не менее ощущается не прекращающийся интерес к созданию новых меток. Особый интерес представляет собой развитие новых белковых меток, включая хромопротеины и/или флуоресцирующие белковые метки.

Новым разрабатываемым в настоящее время важным классом белков являются флуоресцирующие белки рифовых кораллов, как описано у Matz, M.V., et al. (1999) Nature Biotechnol., 17:969-973. Несмотря на то что эти флуоресцирующие белки обладают многими положительными свойствами, особый к ним интерес связан с развитием вариантов флуоресцирующих белков этого очень важного класса, которые обладали бы дополнительными ценными свойствами, например быстрым созреванием. Настоящее изобретение связано с удовлетворением такой потребности.

Релевантная литература

Интерес в этой связи представляют патенты США, включающие в себя патенты под следующими номерами: 6066476; 6020192; 5985577; 5976796; 5968750; 5968738; 5958713; 5919445; 5874304 и 5491084. Представляющие интерес Международные патентные публикации включают в себя публикации WO 00/46233; WO 99/49019 и DE 19718640A. Интересны также публикации Anderluh et al., Biochemical and Biophysical Research Communications (1996) 220:437-442; Dove et al., Biological Bulletin (1995) 189:288-297; Fradkov et al., FEBS Lett. (2000) 479 (3):127-30; Gurskaya et al., FEBS Lett., (2001) 507 (1):16-20; Gurskaya et al., BMC Biochem. (2001) 2:6; Lukyanov, K., et al. (2000) J. Biol. Chemistry 275 (34):25879-25882; Macek et al., Eur. J. Biochem. (1995) 234:329-335; Martynov et al., J. Biol. Chem. (2001) 276:21012-6; Matz, M. V., et al. (1999) Nature Biotechnol., 17:969-973; Terskikh et al., Science (2000) 290:1585-8; Tsien, Annual Rev. of Biochemistry (1998) 67:509-544; Tsien, Nat. Biotech. (1999) 17:956-957; Ward et al., J.Biol. Chem. (1979) 254:781-788; Wiedermann et al., Jarhrestagung der Deutschen Gesellschact fur Tropenokologie-gto. Ulm. 17-19.02. 1999. Poster P-4.20; Yarbrough et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2001) 98:462-7.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Композиции нуклеиновых кислот, кодирующие быстросозревающие флуоресцирующие белки, а также их неагрегирующие варианты (и их мутанты) и кодируемые ими белки, составляют существо настоящего изобретения. Белки, о которых идет речь, являются флуоресцирующими белками, причем это их свойство возникает в результате взаимодействия двух или более остатков белковой молекулы. Белки, о которых идет речь, дополнительно характеризуются тем, что, в определенных воплощениях они обнаруживаются в составе белков дикого типа или представляют собой мутанты белков дикого типа, которые получены либо из небиолюминесцентных видов Cnidaria, например, Anthozoa (коралловые полипы), либо получены из видов Anthozoa non-Pennatulacea (коралловые полипы, не являющиеся пеннатулярией). В определенных воплощениях белки, о которых идет речь, представляют собой мутанты флуоресцирующего белка "red" Discosoma sp. дикого типа, продаваемого под коммерческим названием "DsRed". Также интерес представляют белки, которые по существу подобны описанным выше специфическим белкам, или их мутанты. Изобретение связано также с фрагментами нуклеиновых кислот и кодируемыми ими пептидами, а также антителами против белков, о которых идет речь, и трансгенными клетками и организмами. Композиции таких белков и нуклеиновых кислот имеют множество разнообразных применений. Наконец, изобретение связано также и с наборами для таких применений, например, таких, которые включают в себя композиции нуклеиновых кислот согласно изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА:

Фигура 1. Нормализованное колебание и спектры эмиссии (испускания, излучения) представителей вариантов DsRed. (A) Мутирующий остаток N42 изменяет спектральные свойства DsRed. Спектры показаны для DsRed1 и вариантов N42H и N42Q. Все три белка были полностью зрелыми. (B) Спектры оптимизированных вариантов DsRed.T3 и DsRed.T4.

Фигура 2. Кинетика созревания вариантов DsRed. В логарифмической фазе роста культуры E. coli обрабатывали индуктором изопропил-P-D-тиогалактопиранозидом (IPTG) в течение 30 мин для генерации пульса экспрессии для каждого из вариантов. Затем инициировали чейз (во время 0 на графиках) путем добавления ингибиторов белкового синтеза и продолжали инкубирование при 37°C. В указанных временных точках отбирали аликвоты культур, которые впоследствии анализировали методом проточной цитометрии на предмет определения средней интенсивности красной флуоресценции на клетку. Базовую флуоресценцию (пунктирная линия) измеряли, используя клетки, несущие пустую плазмиду pQE81. На двух этих графиках наносились (A) грубые значения флуоресценции, или (B) значения, полученные путем вычитания флуоресценции, имевшейся во время 0 и нормализованной к максимальному сигналу в 100% для каждого из вариантов DsRed. Слабое отклонение в поздних временных точках средних значений флуоресценции для DsRed.T3 и DsRed.T4, возможно, отражает клеточный лизис. В контрольной культуре ингибиторы белкового синтеза добавлялись к клеткам, несущим плазмиду, экспрессирующую DsRed.T3; как и ожидалось, эти клетки оставались нефлуоресцирующими (данные не показаны). Методом иммуноблоттинга было показано, что в течение чейз-периода количество белка DsRed2, DsRed.T3, и DsRed.T4 в культуре оставалось в основном постоянным, в то время как количество белка DsRed1 прогрессивно уменьшалось приблизительно до половины его первоначального уровня (данные не показаны).

Фигура 3. Одновременная визуализация DsRed.T4 и EGFP у дрожжей. DsRed.T4 был нацелен на митохондриальный матрикс Saccharomyces cerevisiae путем слияния с предпоследовательностью Cox4p. Слитый белок pCox4-DsRed.T4 был продуцирован в штамме, который содержал Sec7p-eGFP, маркер цистерн аппарата Гольджи. Клетки из логарифмической фазы роста культуры были визуализованы либо с помощью набора фильтров Texas Red (красный), либо с помощью набора фильтров EGFP (зеленый). Кроме того, клетки были визуализованы с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной (DIC) микроскопии. Как показано на картинке слияния, сигналы DsRed.T4 и EGFP легко разделяются. Масштаб отрезка - 2 мкм.

Фигура 4. Уменьшение результирующего заряда вблизи N-конца DsRed уменьшает агрегацию белка. (A) Неденатурирующий SDS-PAGE очищенного DsRed1 (WT), варианта цикла 1 (R1), варианта цикла 3 (R3), варианта цикла 4 (R4), DsRed.T1 (T1), DsRed.T3 (T3) и DsRed.T4 (T4). 1 мкг каждого очищенного варианта DsRed смешивали на льду с образцом буфера, содержащего SDS, и немедленно подвергали электрофорезу при 4°C в 10% полиакриламидном геле, а затем окрашивали Coomassie Blue. WT* и T4*: Дополнительные аликвоты DsRed1 и DsRed.T4 были денатурированы в результате кипячения перед электрофорезом. МВ: предварительно окрашенные стандартные белки широкого диапазона молекулярных весов (Bio-Rad). (B) Для измерения растворимостей флуоресцирующих белков в E. coli клетки, несущие экспрессирующие векторы на основе pREP4 плюс pQE31, кодирующие DsRed1, DsRed2, вариант цикла 3, вариант цикла 4 или EGFP, выращивали до значения оптической плотности OD₆₀₀ порядка 0,5, индуцированной IPTG в течение 7 ч, затем лизировали с помощью B-PER II и центрифугировали в течение 20 мин при 27000×g. Эквивалентные количества фракций осадка и супернатанта подвергали SDS-PAGE, а затем - иммуноблоттингу в присутствии анти-гексагистидинового моноклонального антитела (Qiagen). Связанное антитело определяли с помощью набора ECL-Plus (Amersham) и установки Molecular Dynamics Storm 860 phosphorimager. Для каждого флуоресцирующего белка анализировали серийные разведения из бактериального экстракта, а для системы детектирования выбирали образец внутри линейной области. Затем количественно определяли процентное содержание каждого белка во фракции супернатанта. На диаграмме представлены средние значения по результатам двух отдельных экспериментов; значения, полученные для каждого флуоресцирующего белка в двух экспериментах, отличались друг от друга не более чем на 10%.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В соответствии с настоящим изобретением, могут быть использованы общепринятые для специалистов технологии молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК. Такие технологии полностью представлены в литературе. См., например, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); "Transcription and Translation" (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed. (1986)); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, (1986)); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

"Вектор" представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг или космид, к которому может быть прикреплен другой сегмент ДНК, так чтобы вызвать репликацию прикрепленного сегмента.

Термин "молекула ДНК" относится к полимерной форме дезоксирибонуклеотидов (аденина, гуанина, тимина или цитозина), находящейся либо в одноцепочечной форме, либо в виде двухцепочечной спирали. Этот термин относится только к первичной и вторичной структуре молекулы, не ограничивая ее никакими конкретными формами третичной структуры. Таким образом, этот термин включает в себя двухцепочечную ДНК, обнаруживаемую помимо прочего и в составе линейных молекул ДНК (например, рестрикционные фрагменты), вирусов, плазмид и хромосом.

"Кодирующей последовательностью" ДНК считается последовательность ДНК, которая транскрибируется и транслируется в полипептид in vivo, когда она находится под контролем соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются инициирующим кодоном на 5'(амино) конце и терминирующим кодоном трансляции на 3'(карбоксильном) конце. Кодирующая последовательность может включать в себя, не ограничиваясь этим, прокариотические последовательности, кДНК из эукариотических мРНК, геномные последовательности ДНК из эукариотических ДНК (например, ДНК млекопитающих) и искусственные последовательности ДНК. Сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции может быть локализована на 3'-конце кодирующей последовательности.

Здесь термин "гибридизация" относится к процессу ассоциации двух цепей нуклеиновых кислот с образованием антипараллельного дуплекса, стабилизированного гидрофобными взаимодействиями между остатками противопоставленных цепей нуклеиновой кислоты.

Термин "олигонуклеотид" относится к короткой (менее 100 оснований в длину) молекуле нуклеиновой кислоты.

Здесь под "регуляторными последовательностями ДНК" подразумеваются последовательности, осуществляющие контроль процессов транскрипции и трансляции, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы и тому подобное, которые обеспечивают и/или регулируют экспрессию кодирующей последовательности в хозяйской клетке.

"Промоторной последовательностью" является регуляторная область ДНК, способная к связыванию РНК-полимеразы в клетке и инициирующая транскрипцию в прямом направлении в кодирующей последовательности. В целях, связанных с настоящим изобретением, промоторная последовательность связывается на своем 3'-конце с сайтом инициации транскрипции и простирается в обратном направлении (в направлении к 5'-концу) для включения минимального количества оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях, определяемых над фоном. В рамках промоторной последовательности будет находиться сайт инициации транскрипции, так же как и белок-связывающие домены, ответственные за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы часто, но не всегда будут содержать "TATA"-боксы и "CAT"-боксы. Различные промоторы, включая индуцибельные промоторы, могут быть использованы в качестве драйвера для различных векторов согласно изобретению.

Здесь термины "рестрикционные эндонуклеазы" и "ферменты рестрикции" относятся к бактериальным ферментам, каждый из которых разрезает двойную спираль ДНК в строго специфической нуклеотидной последовательности или вблизи нее.

Говорят, что клетка подверглась "трансформации" или была "трансфицирована" экзогенной или гетерологичной ДНК, если такая ДНК была введена внутрь клетки. Трансформирующая ДНК может быть или может не быть интегрирована (ковалентно связана) в клеточный геном. Например, в клетках прокариот, дрожжей и млекопитающих трансформирующая ДНК может быть сохранена на эписомном элементе, таком как плазмида. Что касается эукариотических клеток, стабильно трансформированной клеткой является такая клетка, в которой трансформирующая ДНК интегрировалась в хромосому, так что при хромосомной репликации она передается дочерним клеткам. Такая стабильность демонстрируется возможностью получения из эукариотической клетки клеточных линий или клонов, состоящих из популяции дочерних клеток, содержащих трансформирующую ДНК. "Клон" представляет собой популяцию клеток, полученных из одной клетки или общего предшественника в результате митоза. "Клеточная линия" представляет собой клон первоначальной клетки, который способен к стабильному росту in vitro на протяжении многих поколений.

Термин "гетерологичная" область ДНК-конструкта представляет собой идентифицируемый сегмент ДНК в составе более крупной молекулы ДНК, который в природе в ассоциации с этой более крупной молекулой ДНК не встречается. Таким образом, если гетерологичная область кодирует ген млекопитающего, этот ген, как правило, бывает фланкирован ДНК, которая не фланкирует геномную ДНК млекопитающего в геноме того организма, из которого она получена. В качестве другого примера гетерологичная ДНК включает в себя кодирующую последовательность в конструкте, где части генов из двух различных источников объединяются таким образом, чтобы в результате продуцировался слитый белок. Согласно используемому здесь определению аллельные вариации или природно возникающие мутационные явления не приводят к образованию гетерологичной области ДНК.

Здесь термин "репортерный ген" относится к кодирующей последовательности, которая прикреплена к гетерологичному промотору или энхансерным элементам и продукт которой может быть с легкостью определен и подвергнут количественной оценке, когда этот конструкт вводят в ткани или клетки.

Предпочтительно, чтобы описываемые здесь аминокислоты были представлены в виде "L"-изомера. Аминокислотные последовательности приводятся в однобуквенной кодировке (A: аланин; C: цистеин; D: аспарагиновая кислота; E: глутаминовая кислота; F: фенилаланин; G: глицин; H: гистидин; I: изолейцин; K: лизин; L: лейцин; M: метионин; N: аспарагин; P: пролин; Q: глутамин; R: аргинин; S: серин; T: треонин; V: валин; W: триптофан; Y: тирозин; X: любой остаток). NH₂ относится к свободной аминогруппе, присутствующей на амино-конце полипептида. COOH относится к свободной карбокси-группе, присутствующей на карбокси-конце полипептида. Придерживаясь стандартной полипептидной номенклатуре, использовали представления, описанные в публикации J. Biol. Chem., 243 (1969), 3552-59.

Термином "иммунологически активный" определяется способность природного, рекомбинантного или искусственного хромо/флуоресцирующего белка или любого его олигопептида индуцировать специфический иммунный ответ у соответствующих животных или со стороны соответствующих клеток и связываться со специфическими антителами. Здесь под термином "антигенная аминокислотная последовательность" подразумевается аминокислотная последовательность, которая либо сама по себе, либо в ассоциации с молекулой-носителем может вызвать антительный ответ у млекопитающего. Термин "специфическое связывание" в контексте связывания антигена с антителом является термином, хорошо понимаемым в данной области и относящимся к связыванию антитела с антигеном, против которого это антитело было выработано, но не с другими неродственными антигенами.

Под термином "изолированный" здесь подразумевается обозначение полинуклеотида, полипептида, антитела или клетки-хозяина, которые находятся в среде, отличной от той, в которой указанные полинуклеотид, полипептид, антитело или клетка-хозяин встречаются в природе.

Биолюминесценция (BL) определяется как излучение живыми организмами света, который хорошо виден в темноте и действует на визуальное поведение животных (см., например, Harvey, E. N. (1952). Bioluminescence. New York: Academic Press; Hastings, J. W. (1995). Bioluminescence. In: Cell Physiology (ed. by N. Speralakis). pp.651-681. New York: Academic Press.; Wilson, T. and Hastings, J. W. (1998). Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol 14, 197-230). Под биолюминесценцией не подразумевается так называемое сверхслабое излучение света, которое с помощью чувствительного люминометрического оборудования может быть обнаружено фактически во всех живых структурах (Murphy, M. E. and Sies, H. (1990). Visible-range low-level chemiluminescence in biological systems. Meth. Enzymol. 186, 595-610; Radotic, K, Radenovic, C, Jeremic, M. (1998.) Spontaneous ultra-weak bioluminescence in plants: origin, mechanisms and properties. Gen Physiol Biophys 17, 289-308), и слабое излучение света, которое, наиболее вероятно, не играет какой-либо экологической роли, такое как свечение растущих бамбуковых побегов (Totsune, H., Nakano, M., Inaba, H. (1993). Chemiluminescence from bamboo shoot cut. Biochem. Biophys. Res Comm. 194, 1025-1029) или излучение света в процессе оплодотворения яиц животных (Klebanoff, S. J., Froeder, C. A., Eddy, E. M., Shapiro, B.M. (1979). Metabolic similarities between fertilization and phagocytosis. Conservation of peroxidatic mechanism. J. Exp. Med. 149, 938-953; Schomer, B. and Epel, D. (1998). Redox changes during fertilization and maturation of marine invertebrate eggs. Dev Biol 203, 1-11).

ОПИСАНИЕ ОСОБЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

В данном изобретении представлены композиции нуклеиновой кислоты, кодирующей быстросозревающие флуоресцирующие белки, а также их неагрегирующие варианты (и их мутанты), и кодируемые ею белки. Белки, о которых идет речь, являются флуоресцирующими белками, причем это их свойство возникает в результате взаимодействия двух или более остатков белковой молекулы. Белки согласно изобретению дополнительно характеризуются тем, что в определенных воплощениях они обнаруживаются в составе белков дикого типа или представляют собой мутанты белков дикого типа, которые получены либо из небиолюминесцирующих видов Cnidaria, например Anthozoa, либо получены из видов Anthozoa non-Pennatulacea. В определенных воплощениях белки согласно изобретению представляют собой мутанты флуоресцирующего белка «red» Discosoma sp. дикого типа. Представляют интерес также белки, которые по существу подобны описанным выше специфическим белкам, или их мутанты. Изобретение связано также с фрагментами нуклеиновых кислот и кодируемыми ими пептидами, а также антителами против белков согласно изобретению и трансгенными клетками и организмами. Композиции белков и нуклеиновых кислот согласно изобретению имеют множество разнообразных применений. Наконец, изобретение связано также и с наборами для использования при таких применениях, которые включают в себя, например, композиции нуклеиновых кислот, о которых идет речь.

Прежде чем приступить к дальнейшему описанию объекта изобретения, следует пояснить, что изобретение не ограничивается частными воплощениями настоящего изобретения, описанными ниже, поскольку могут быть созданы варианты частных воплощений, которые также охватываются объемом, защищаемым прилагаемой формулой изобретения. Следует пояснить также и то, что используемая терминология нужна для описания конкретных воплощений, а не для ограничения объема, охватываемого данным изобретением. Наоборот, объем, охватываемый настоящим изобретением, будет определяться прилагаемой формулой изобретения.

В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа подразумевают также и множественное число, если только в контексте прямо не оговорено иное.

Если не определено иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно вкладывают в него специалисты в данной области, к которым и обращено настоящее изобретение.

Когда речь идет об области значений, подразумевается, если в контексте специально не указано обратное, что каждое входящее в эту область значение между верхним и нижним пределами этой области, вплоть до десятой доли нижнего предельного значения, и любое другое заявленное или входящее в эту заявленную область значение охватывается настоящим изобретением. Верхний и нижний пределы этих более малых областей могут независимо быть включены в эти более малые области и также охватываются настоящим изобретением, становясь предметом любого специфически исключенного предела в заявленной области. Когда заявленная область включает в себя одно или более из предельных значений, области, исключающие какое-либо одно или оба из этих включенных предельных значений, также охватываются настоящим изобретением.

Если не указано иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно вкладывают в него специалисты в данной области, к которым и обращено настоящее изобретение. Несмотря на то что в осуществлении данного изобретения или для его проверки могут быть использованы любые методы, устройства и материалы, сходные с таковыми, описываемыми здесь, или эквивалентные им, тем не менее предпочтительные методы, устройства и материалы будут здесь описаны.

Все публикации, указанные здесь, включены в настоящее описание путем цитирования с целью описания и раскрытия клеточных линий, векторов, методологий и других компонентов изобретения, которые описаны в публикациях, которые могут быть использованы в связи с описываемым здесь изобретением.

В дальнейшем, описывая настоящее изобретение, в первую очередь будут описаны композиции нуклеиновых кислот согласно изобретению, затем будут обсуждаться белковые композиции, антительные композиции и трансгенные клетки/организмы. Далее следует обзор репрезентативных методов, в которых нашли применение белки согласно изобретению.

КОМПОЗИЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Как было сказано выше, настоящее изобретение обеспечивает композиции нуклеиновых кислот, кодирующие быстросозревающие хромо/флуоропротеины и их мутанты, а также фрагменты и гомологи этих белков. Под быстросозревающим хромо/флуоропротеином подразумевается белок, который является окрашенным и/или флуоресцирующим, например он может проявлять флуоресценцию в низкой, средней или высокой степени при облучении светом с длиной волны возбуждения. Более того, поскольку белок является быстросозревающим, он приобретает свои конечные свойства хромо/флуоресцирующих белков приблизительно менее чем за 72 часа, иногда менее чем за 48 часов, а иногда и менее чем за 24 часа. В определенных воплощениях белок может достичь зрелого состояния за период менее 20 часов, например 18 часов, 16 часов, 14 часов, 12 часов, 10 часов, 8 часов и т.д.

Во всяком случае, представляющими интерес белками согласно изобретению являются такие белки, свойство окрашивания у которых, например, хромо- и/или флуоресцентное свойство, является таким свойством, которое появляется при взаимодействии двух или более остатков белка, но не возникает на основе какого-то одного остатка белка, более конкретно, одной боковой цепи одного остатка белка. Как таковые флуоресцирующие белки согласно изобретению не включают в себя белки, которые проявляют флуоресцентные свойства только из-за тех остатков, которые сами по себе действуют как внутренние флуоресцирующие агенты, например, триптофан, тирозин и фенилаланин. Как таковые флуоресцирующие белки согласно изобретению являются флуоресцирующими белками, флуоресцентное свойство которых возникает на основе некоторой структуры в белке, которая отличается от структуры указанных выше отдельных остатков, например оно возникает при взаимодействии двух или более остатков.

Под композицией нуклеиновой кислоты подразумевается композиция, содержащая последовательность ДНК, имеющая открытую рамку считывания, которая кодирует хромо/флуорополипептиды согласно изобретению, например хромо/флуоропротеиновый ген, и может при определенных условиях экспрессироваться в виде хромо/флуоропротеина согласно изобретению. Кроме того, настоящим изобретением охватываются также нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу подобны или идентичны нуклеиновым кислотам согласно изобретению. Таким образом, настоящее изобретение связано с генами и кодируемыми ими последовательностями, которые кодируют белки согласно изобретению, а также их гомологи. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению, когда они возникают естественным путем, находятся в непривычном для них окружении (например, они могут быть изолированы, могут присутствовать в повышенной концентрации и т.д.) по сравнению с их природным окружением, например организмом, из которого они получены.

Дополнительно эти нуклеиновые кислоты характеризуются тем, что когда они кодируют белки, либо происходящие от белков, либо являющиеся мутантами белков, которые происходят от (1) небиолюминесцентных видов, часто небиолюминесцентного вида Cnidaria sp., например небиолюминесцентного вида Anthozoa sp.; или (2) от видов Anthozoa sp., которые не принадлежат виду Pennatulacea sp., например, такие, которые не являются морскими перьями. Как таковые нуклеиновые кислоты могут кодировать белки, которые происходят из белков или являются мутантами белков, которые происходят от биолюминесцентных видов Anthozoan sp., при условии, что эти виды не являются Pennatulacea sp., например, что они не являются видами Renilla или Ptilosarca sp. Особый интерес в определенных воплощения представляют собой быстросозревающие мутанты следующих специфических белков дикого типа (или их мутантов): (1) amFP485, cFP484, zFP506, zFP540, drFP585, dsFP484, asFP600, dgFP512, dmFP592, как описано в заявке с серийным номером № 10/006922, описание которой включено в настоящее описание в виде ссылки; (2) hcFP640, как описано в заявке с серийным номером № 09/976673, описание которой включено в настоящее описание в виде ссылки; (3) CgCP, как описано в заявке с серийным номером № 60/255533, описание которой включено в настоящее описание в виде ссылки; и (4) hcriGFP, zoanRFP, scubGFP1, scubGFP2, rfloRFP, rfloGFP, mcavRFP, mcavGFP, cgigGFP, afraGFP, rfloGFP2, mcavGFP2, mannFP, как описано в заявке с серийным номером № 60/332980, описание которой включено в настоящее описание в виде ссылки.

В определенных воплощениях белки, кодируемые нуклеиновыми кислотами согласно изобретению, представляют собой мутанты (drFP585) флуоресцирующего белка "red" дикого типа Discosoma sp., причем кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность этого белка описаны в заявке с серийным номером № 10/006922, описание которой включено в настоящее описание в виде ссылки. DsRED дикого типа кодируется нуклеиновой кислотой, имеющей следующую последовательность:

и имеет аминокислотную последовательность:

Представители быстросозревающих мутантов "DsRed" включают в себя, не ограничиваясь ими, точковые мутации в положении 42 относительно стартового остатка, например N42H, N42Q и т.д.; точковые мутации в положении 41 относительно стартового остатка, например, H41L, H41T и т.д.; точковые мутации в положении 44 относительно стартового остатка, например, V44A, и т.д.; точковые мутации в положении 21 относительно стартового остатка, например, T21 S, и т.д.

Одной из последовательностей-представителей последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая кодирует мутант DsRed.T1, описанный ниже более подробно, включает в себя следующую последовательность:

в которой выделенный/подчеркнутый кодон ATG является стартовым кодоном, а выделенный/подчеркнутый кодон TAG является стоп-кодоном.

Как было сказано ранее, помимо описанных выше быстросозревающих мутантов DsRed, представляют интерес также и быстросозревающие мутанты других видов. Таким мутанты или варианты имеют точковые мутации наподобие тех, которые были описаны выше, в аналогичных или соответствующих положениях в их последовательности относительно специфических положений, идентифицированных в указанных выше представителях мутантов DsRed. Аналогичные или соответствующие положения для образования точковых мутаций в последовательности данного белка легко определяются путем выравнивания прилагаемой специфической последовательности мутантов DsRed и последовательностей белка дикого типа из представляющих интерес видов с зеленым флуоресцирующим белком Aquoria victoria с помощью описанной ниже методики, а также, как показано на Фигуре 1, приведенной у Matz et al., Nature Biotechnology (1999) 969-973. Специфические представители быстросозревающих мутантов других видов включают в себя, не ограничиваясь ими, следующие (где нумерация следующих точковых мутаций соответствует нумерации "GFP", иллюстрируемой на Фигуре 1, приведенной у Matz et al., выше): (1) быстросозревающие мутанты dsFP483, имеющие одну или более точковых мутаций, выбранных из N42, например Q или H, V44, например, A, T21, например быстросозревающие мутанты zFP506, имеющие одну или более точковых мутаций, выбранных из K41, например L или T, I44, например, A, C21, например S; быстросозревающие мутанты aFP538, имеющие одну или более точковых мутаций, выбранных из K41, например Lor T, 144, например A, C21, например S; быстросозревающие мутанты amFP483, имеющие одну или более точковых мутаций, выбранных из C21, например S; и быстросозревающие мутанты cFP484, имеющие одну или более точковых мутаций, выбранных из N21, например S, L44, например A; и т.д.

Помимо описанных выше специфических композиций нуклеиновых кислот, представляют интерес также и гомологи приведенных выше последовательностей. Что касается гомологов нуклеиновых кислот согласно изобретению, источником гомологичных генов могут быть любые виды растений или животных или последовательность может быть полностью или частично синтетической. В определенных воплощениях сходство последовательностей между гомологами приблизительно составляет по меньшей мере 20%, иногда приблизительно составляет по меньшей мере 25%, и может составлять 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% или выше, включая 75%, 80%, 85%, 90% и 95% или выше. Сходство последовательностей рассчитывается на основе эталонной (ссылочной) последовательности, которая может представлять собой субпоследовательность более длинной последовательности, такую как консервативный мотив, кодирующая область, фланкирующая область и т.д. Обычно эталонная последовательность составляет в длину по меньшей мере приблизительно 18 нуклеотидов (н.), чаще - по меньшей мере приблизительно 30 н. в длину, а может достигать в длину и полноразмерной последовательности, которая предназначена для сравнения. Алгоритмы, используемые для анализа последовательностей, такие как BLAST, известны в данной области и описаны у Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10 (с использованием параметров по умолчанию, например, параметров w=4 и T=17). Представленные здесь последовательности являются существенными для узнавания родственных и гомологичных нуклеиновых кислот в поисковой базе данных.

Особый интерес в определенных воплощениях представляют нуклеиновые кислоты, имеющие по существу такую же длину, что и нуклеиновые кислоты, идентифицируемые как SEQ ID NO: 01 или 02, где под «по существу такой же длиной» подразумевается то, что какое бы то ни было различие в длине не должно превосходить приблизительно 20 числовых %, обычно не выше, чем приблизительно 10 числовых %, а еще чаще - не выше, чем приблизительно 5 числовых %; и имеют последовательность, идентичную любой из этих последовательностей по меньшей мере приблизительно на 90%, обычно по меньшей мере приблизительно на 95%, а чаще - по меньшей мере приблизительно на 99% относительно полной длины нуклеиновой кислоты. Во многих воплощениях нуклеиновые кислоты имеют последовательность, которая по существу подобна (например, та же самая) или идентична последовательности SEQ ID NO: 01 или 02. Под по существу подобной последовательностью подразумевается то, что идентичность последовательности обычно будет составлять приблизительно по меньшей мере 60%, обычно по меньшей мере приблизительно 75%, а чаще - приблизительно по меньшей мере 80, 85, 90, или даже 95%.

Предусмотрены также нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки, кодируемые описанными выше нуклеиновыми кислотами, но отличаются от описанных выше нуклеиновых кислот в связи с вырожденностью генетического кода.

Предусмотрены также нуклеиновые кислоты, которые в жестких условиях гибридизуются с описанной выше нуклеиновой кислотой: примером жестких условий гибридизации является гибридизация при 50°C или выше и 0,1×SSC (15 мМ хлорид натрия/1,5 мМ цитрат натрия). Другим примером жестких условий гибридизации является инкубация в течение ночи при 42°C в растворе, содержащем 50% формамида, 5×SSC (150 мМ хлорид натрия/15 мМ трицитрат натрия), 50 мМ фосфата натрия (pH 7,6), 5 × раствор Денхардта, 10% декстрансульфата и 20 мкг/мл денатурированной, расщепленной ДНК спермы лосося, после чего следует промывание фильтров в 0,1×SSC приблизительно при 65°C. Жесткие условия гибридизации представляют собой такие условия гибридизации, которые являются по меньшей мере столь же жесткими, как описанные выше условия, причем условия можно считать "по меньшей мере такими же жесткими" в том случае, если они по меньшей мере приблизительно на 80% столь же жесткие, обычно по меньшей мере приблизительно на 90% столь же жесткие, насколько жесткими являются описанные выше жесткие условия. Другие жесткие условия гибридизации также известны специалистам в данной области, и эти условия также могут быть использованы для идентификации нуклеиновых кислот конкретно данного воплощения настоящего изобретения.

Предусмотрены также нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные белки согласно изобретению. Мутантные нуклеиновые кислоты могут быть получены в результате неспецифического мутагенеза или направленного мутагенеза с использованием хорошо известных специалистам технологий, которые стали уже рутинными в данной области. В некоторых воплощениях хромопротеины или флуоресцирующие белки, кодируемые нуклеиновыми кислотами, кодирующими гомологи или мутанты, имеют такие же флуоресцентные свойства, что и флуоресцирующие белки дикого типа. В других воплощениях гомологичные или мутантные нуклеиновые кислоты кодируют хромопротеины или флуоресцирующие белки с измененными спектральными свойствами, что описано здесь более подробно.

Одной из категорий мутантов, которые представляют особый интерес, являются неагрегирующие мутанты. Во многих воплощениях неагрегирующие мутанты отличаются от последовательности дикого типа тем, что мутация у них локализована на N-конце, что вызывает модуляцию зарядов, появляющихся на боковых группах N-концевых остатков, например, для реверсии или нейтрализации заряда, таким способом, который можно было бы считать удовлетворительным для продуцирования неагрегирующего мутанта природно возникающего белка или мутанта, причем конкретный белок считается неагрегирующим, если его относят к неагрегирующим белкам на основании анализа, описанного в патентной заявке США под серийным номером № 10/081864, описание которой включено в настоящее описание посредством ссылки, и опубликованного в публикации PCT под номером WO 02/068459.

В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты такого воплощения кодируют неагрегирующие полипептиды, которые in vivo проявляют пониженные агрегационные свойства. "Пониженная агрегация in vivo" относится к пониженной агрегации в клетке. В некоторых воплощениях неагрегирующий полипептид способен к агрегации, которая составляет менее чем приблизительно 90%, менее чем приблизительно 80%, менее чем приблизительно 70%, менее чем приблизительно 60%, менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 25%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 10% или менее чем приблизительно 5% по отношению к степени агрегации, реализуемой его соответствующим аналогом в тех же самых условиях in vivo, например, в другой эукариотической клетке из той же самой линии, в идентичной прокариотической клетке или же в эукариотической клетке или клеточной популяции того же самого типа клеток. Обычно