Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща

Способ определения состояния метаболических процессов в ткани суставного хряща

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано в качестве диагностического биохимического теста, способного охарактеризовать структуру и характер метаболических процессов в суставном хряще для выбора тактики комплексного лечения суставов.

Известные способы лабораторной диагностики, заключающиеся в исследовании синовиальной жидкости, позволяют определить нозологическую форму воспалительного заболевания сустава (Энциклопедия клинических лабораторных тестов // Под ред. Тиц Н., Москва. 1997). Эти исследования не дают представления о метаболических процессах в хрящевой ткани в данный период времени.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ исследования метаболизма протеогликанов (ПГ) суставного хряща в зависимости от возраста и степени развития дегенеративных процессов авторов Yoshiyuki Y. et al. (Adv. Drug. Deliv. Rev. 2005. Vol.57. P.973-993). Но ни у этих авторов, ни в доступной литературе нет сведений о четких биохимических критериях, характеризующих уровень метаболических процессов в ткани и необходимых для определения начальной стадии дегенеративного процесса, когда еще сохраняется способность ткани к регенерации и при соответствующей медикаментозной и физиотерапевтической поддержке могут активизироваться репаративные процессы.

Предлагаемый способ базируется на установленных закономерностях изменения метаболизма одного из основных компонентов межклеточного матрикса хряща - молекул протеогликанов, а именно их углеводного компонента - гликозаминогликанов (ГАГ). Определение количества и качественного состава ГАГ позволяет получить представление о характере преобладающих процессов в хряще в данный момент - глубине процессов дегенерации и деструкции, а также об имеющемся в ткани потенциале регенерации.

Задача изобретения: предложить биохимические критерии диагностики, характеризующие потенциальные возможности репаративных процессов в хрящевой ткани.

Способ позволяет диагностировать стадии патологических процессов в суставе до их рентгенологического проявления и обосновать оптимальную схему лечения пораженного сустава, определяя необходимый комплекс лечебных воздействий. Экономический эффект заключается в возможности, в ряде случаев, отказаться от оперативного вмешательства и сократить расходы, связанные с пребыванием в стационаре на хирургической койке. Социальный эффект связан с сохранением работоспособности, снижением инвалидизации при данной патологии и улучшением качества жизни пациента без снижения физической активности.

Технический результат достигается за счет исследования количества химических составных частей ГАГ в синовиальной жидкости (СЖ), а именно - определения количества уроновых кислот, галактозы и сульфатированных ГАГ (С-ГАГ). Основными компонентами СЖ, которые определяют ее функциональную полноценность, являются гиалуроновая (ГК) кислота и хондроитинсульфат (ХС). Снижение количества уроновых кислот - структурных единиц этих веществ - свидетельствует о нарушении синтеза основных компонентов СЖ. Увеличение в синовиальной жидкости количества С-ГАГ (отражает общее количество ГАГ) и галактозы (химический компонент кератансульфата (КС)), которых в СЖ здорового сустава содержится ограниченное количество, связано с активно протекающими в ткани сустава дегенеративными и деструктивными процессами. Повышенное содержание этих веществ в СЖ отражает активные деструктивные процессы в тканях сустава. Следующий важный показатель - содержание галактозы в СЖ. Снижение или увеличение этого показателя, также как и вариации количества С-ГАГ, отражает поступление ГАГ из тканей в СЖ. Увеличение количества этого углевода на фоне снижения количества уроновых кислот свидетельствует об активных деструктивных процессах в тканях сустава. Гораздо интереснее вариации отношения количества уроновых кислот и галактозы в СЖ. В 90% случаев сталкиваются с уменьшением этого соотношения, что связано с изменением соотношения ХС/КС в процессе развития дегенеративных процессов в суставе. Чем выше стадия дегенерации, тем ниже это соотношение. При соотношении уроновых кислот и галактозы ниже 0,6 процесс дегенеративных изменений в ткани становится стойким.

Поставленная задача решается за счет того, что исследуют количество гликозаминогликанов и при содержании сульфатированных ГАГ выше 140 мкг/мл и галактозы выше 3,5 мг/мл диагностируют наличие активного деструктивного процесса; при уровне С-ГАГ ниже 80 мкг/мл и галактозы ниже 1,0 мг/мл диагностируют наличие дегенеративных изменений в хрящевой ткани, при этом дальнейшее снижение уровня этих показателей свидетельствует о нарастании степени дегенерации; снижение отношения уроновых кислот к галактозе ниже 0,6 - развитии стойких дегенеративных изменений.

Способ осуществляется следующим образом

Выделение ГАГ.

Для выделения ГАГ из синовиальной жидкости использован универсальный метод разрушения избытка белков папаином (Шараев П.Н., Пишков В.П., Соловьева Н.И. и др. Метод определения гликозаминогликанов в биологических жидкостях // Лаб. дело. 1987. №5. С.330-332). К 0,5-1,0 мл синовиальной жидкости добавляется 1,0 мл физиологического раствора и 0,2 мл 0,1М ацетатного буфера рН 5,8 с 0,01М цистеином и 0,01М ЭДТА с 3 мг папаина. Полное расщепление белков происходит в течение 18 часов при 65°С. Для удаления белков из раствора к нему добавляют 0,12 мл 100% ТХУ, оставляют на 30 мин в холодильнике, а затем раствор центрифугируют при 10000 об/мин 10 мин (осадок можно отделить фильтрованием через мелкопористый фильтр). ГАГ остаются в надосадочной жидкости. Эту жидкость отбирают, нейтрализуют 1,0 н NaOH (0,1 мл) и добавляют 6 мл этанола, содержащего 4% ацетат калия, тщательно перемешивают и оставляют при -18°С на 12 часов для осаждения ГАГ. Осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Осадок подсушивают, переворачивая пробирку и давая стечь избытку этанола, и растворяют в 200-500 мкл воды.

Уроновые кислоты определяют карбазоловым методом Bitter Т., Muir H.M. (A modified uronic acid carbozole reaction // Ann. Biochem. 1962, Vol.4, P.330-334). К 10 мкл исходного раствора добавляют 190 мкл воды+200 мкл спиртового раствора карбазола (1,25 г карбазола в 1,0 л этилового 96° этанола), хорошо встряхивают, добавляют 2,0 мл тетрабората натрия в серной кислоте (9,5 г тетрабората натрия в 1,0 л концентрированной серной кислоте марки «ОСЧ»). Смесь нагревают на кипящей водяной бане 8 мин, охлаждают и экстинцию раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 535 нм против контрольного раствора (200 мкл воды+200 мкл раствора карбазола+2,0 мл раствора тетрабората натрия в серной кислоте). В качестве стандарта используют уроновые кислоты (концентрация в пробе от 10 до 30 мкг). Результаты рассчитывают в мкг уроновых кислот на 1 мл синовиальной жидкости.

Сульфатированныв ГАГ определяют методом окрашивания ДММГ (J.G.N.Jong, R.A.Wevers, C.Laarakkers, J.H.M.Poorthuis // Clin. Chem. 1989. Vol.35. P.1472-1477). 2,1 мг диметилметилена голубого (ДММГ) растворяют в 200 мл 55 мМ муравьиной кислоты (конечный рН раствора 3,3). Раствор хранят при комнатной температуре. К 10 мкл раствора ГАГ добавляют 90 мкл воды и 2,5 мл раствора красителя. Окраска развивается немедленно и устойчива в течение 3 мин, ее интенсивность измеряют на спектрофотометре при длине волны 520 нм. В качестве стандарта используют хондроитинсульфат «С» (концентрация в пробе от 2 до 30 мкг). Результаты выражаются в мг хондроитинсульфата «С» на милилитр синовиальной жидкости.

Для определения содержания галактозы использован метод Roe J.H. (J. Biol. Chem. 1955. Vol.215. P.335-343). К 50 мкл исходного раствора ГАГ добавляют 450 мкл воды и 3,0 мл раствора антрона в 66% серной кислоте (0,05% антрон - 500 мг, 1% тиомочевина - 10 гр, 1 литр 66% серной кислоты). Раствор встряхивают и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. Затем охлаждают и измеряют экстинцию на спектрофотометре при длине волны 620 нм против контрольной смеси, в которой 500 мкл пробы заменены таким же объемом воды.

Снижение количества уроновых кислот ниже уровня в 1,0 мг/мл свидетельствует о нарушении синтеза основных компонентов СЖ - гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата (пределы нормальных значений 1,0-5,5 мг уроновых кислот /мл). Увеличение в синовиальной жидкости количества сульфатированных ГАГ (которых в СЖ здорового сустава содержится ограниченное количество) связано с активно протекающими в ткани сустава дегенеративными и деструктивными процессами. Нормальный уровень С-ГАГ в СЖ составил 80,0-140,0 мкг хондроитинсульфата - «С»/мл. Следующий важный показатель - содержание галактозы в ПГ СЖ. Нормальный уровень этого углевода, входящего в состав кератансульфата, составил 1,0-3,0 мг/мл СЖ. Увеличение количества этого углевода на фоне снижения количества уроновых кислот отражает активные деструктивные процессы в тканях сустава. Гораздо интереснее вариации отношения количества уроновых кислот и галактозы в СЖ: в нормальных условиях это соотношение составляет 0,7-1,0. Чем выше стадия дегенерации, тем ниже это соотношение.

Активность и направленность метаболических процессов в хрящевой ткани определяется по количеству ГАГ в синовиальной жидкости. При содержании С-ГАГ выше 140 мкг/мл и галактозы выше 3,5 мг/мл диагностируется наличие активного деструктивного процесса. При уровне С-ГАГ ниже 80 мкг/мл и галактозы ниже 1,0 мг/мл диагностируется наличие дегенеративных изменений в хрящевой ткани. Дальнейшее снижение уровня этих показателей свидетельствует о нарастании степени дегенерации, а снижение отношения уроновых кислот к галактозе ниже 0,6 свидетельствует о развитии стойких дегенеративных изменений.

Больная К., 53 года, история болезни №6105а, находилась на лечении с диагнозом: Застарелое повреждение медиального мениска на фоне деформирующего артроза левого коленного сустава до рентгенологической стадии. В анамнезе: травма коленного сустава 6 месяцев назад, периодические боли при физической нагрузке. Лечение не проводилось. Больной выполнена артроскопия коленного сустава, на которой из полости сустава получена вязкая синовиальная жидкость соломенного цвета в объеме около 5 мл, при ревизии полости сустава покровный хрящ гладкий, ровный с участками хондромаляции 1 степени в рабочей зоне, синовиальная оболочка розового цвета, гладкая. Больной взят анализ синовиальной жидкости.

	Количество в мкг/мл
Гексуроновые к-ты	970,8
Галактоза	3620,3
С-ГАГ	241,8
Отношение гексуроновые кислоты/галактоза=0,27

Высокий уровень галактозы и С-ГАГ указывает на активные деструктивные процессы в суставных тканях. Низкое отношение гексуроновая кислота/галактоза (0,27) указывает на одновременно протекающие дегенеративные изменения.

Больной К., 70 лет, история болезни №77690/06, находился на лечении с диагнозом: правосторонний идиопатический коксартроз III ст. Комбинированная контрактура правого тазобедренного сустава. В анамнезе: Боли в тазобедренном суставе в течение 15 лет, проводилось неоднократное консервативное лечение без видимого положительного эффекта. Больному проведено клинико-рентгенологическое обследование, на основании которого определены показания к оперативному лечению. 27.03.2006 года больному выполнено эндопротезирование правого тазобедренного сустава. Интраоперационно из полости сустава получена жидкая синовиальная жидкость соломенного цвета в объеме около 10 мл, при ревизии полости сустава головка бедра уплощена, деформирована, покровный хрящ на рабочей зоне отсутствует, в нерабочей зоне уплотнен, истончен. Синовиальная оболочка бледная, утолщена. Больному взят анализ синовиальной жидкости и фрагмент покровного хряща.

	Количество в мкг/мл
Гексуроновые к-ты	149,8
Галактоза	624,8
С-ГАГ	34,2
Отношение гексуроновые кислоты/галактоза=0,24

Низкие показатели всех аналитических тестов синовиальной жидкости и низкое отношение гексуроновые кислоты/галактоза (0,24) указывают на стойкие дегенеративные изменения в суставных тканях.

Больная Л., 63 года, история болезни №6611а, находилась на лечении с диагнозом: Правосторонний посттравматический гонартроз II ст. Повреждение медиального мениска правого коленного сустава. В анамнезе: Боли в правом коленном суставе возникли после удара в коленный сустав около 5 лет назад. Проводилось консервативное лечение. Около 3 месяцев назад после повторной травмы боли в суставе усилились. Больной проведено клинико-рентгенологическое обследование, на основании которого определены показания к оперативному лечению. 14.11.2006 года больной выполнена артроскопия, ревизия полости правого коленного сустава, резекция поврежденной части медиального мениска, дебрайтмент. Интраоперационно из полости сустава получена синовиальная жидкость соломенного цвета в объеме около 10 мл, при ревизии полости сустава суставной хрящ на рабочей зоне внутреннего мыщелка бедра отсутствует, на наружном мыщелке бедра хондромаляция 2 ст. Синовиальная оболочка розовая, без разрастаний. Больной сделан анализ синовиальной жидкости и фрагмента покровного хряща.

	Количество в мкг/мл
Гексуроновые к-ты	387,7
Галактоза	268,2
С-ГАГ	30,6
Отношение гексуроновые кислоты/галактоза=1,44

Низкое содержание галактозы и сульфатированных ГАГ свидетельствует о наличии дегенеративных изменений в тканях, но высокое отношение гексуроновые кислоты/галактоза указывает на достаточно активные анаболические процессы в тканях сустава.

Способ определение состояния ткани суставного хряща путем исследования синовиальной жидкости, отличающийся тем, что определяют содержание уроновых кислот, галактозы и сульфатированных гликозаминогликанов (С-ГАГ), и при содержании С-ГАГ выше 140 мкг хондроитинсульфата "С"/мл и галактозы выше 3,5 мг/мл определяют наличие активного деструктивного процесса; при уровне С-ГАГ ниже 80 мкг хондроитинсульфата "С"/мл и галактозы ниже 1,0 мг/мл определяют наличие дегенеративных изменений в хрящевой ткани, при этом при дальнейшем снижении уровня этих показателей судят о нарастании степени дегенерации; при снижении отношения уроновых кислот к галактозе ниже 0,6 судят о развитии стойких дегенеративных изменений.