Антиген поливалентный корпускулярный для изготовления лечебных и профилактических биопрепаратов против бруцеллеза

Антиген поливалентный корпускулярный для изготовления лечебных и профилактических биопрепаратов против бруцеллеза

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для изготовления лечебных и профилактических биопрепаратов против бруцеллеза у людей.

Известна вакцина для специфической профилактики бруцеллеза у людей, приготовленная с использованием вакцинного штамма Br. abortus 19 ВА (Вершилова П.А., Федер М.Л., Полякова A.M. Прививка людей против бруцеллеза живой вакциной // Труды АМН СССР. - Москва. - 1952. - № 2. - С.231-235). За годы, прошедшие после начала выпуска указанного вакцинного препарата, накоплен богатый опыт ее применения. Показано, что заболеваемость среди привитых людей, работающих с больными животными, не превышает 8% (Отчет о НИР/НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Руководитель: П.А.Вершилова. - Тема № 39, 1986). В то же время напряженность иммунитета, обусловленная данной вакциной, с течением времени значительно снижается. Это определяет сравнительно невысокий ее защитный эффект. Так, согласно данным литературы (Справочник по иммунопрофилактике инфекционных заболеваний в Советской Армии и Военно-морском флоте на мирное время. - М., 1991), максимум эффективности препарата сохраняется лишь в течение первых полутора-двух месяцев после иммунизации. П.А.Вершилова указывает (Вершилова П.А., Курдина Д.С. Изучение напряженности перекрестного иммунитета при бруцеллезе // Журн. микробиол. - 1963. - № 8. - С.34-36), что через 1, 4 и 12 месяцев после прививки уровень заболеваемости составляет 17,3%, 32,7% и 50,0% соответственно. Через 1 год после иммунизации положительные серологические и аллергические реакции обнаруживаются лишь у 25-50% привитых (Смирнов С.М., Тивугабылов М.К., Шмутер М.Ф. О накожной иммунизации людей против бруцеллеза вакциной из штамма Br. abortus 19 // Журн. микробиол. - 1961. - № 1. - С.51-54). Выраженные сенсибилизирующие свойства вакцины способствуют появлению как специфической, так и неспецифической сенсибилизации организма. В опытах на лабораторных животных выявлено, что после второй ревакцинации развиваются дистрофические и дегенеративные изменения в органах, к тому же вакцина вместо стимулирующего влияния на иммунную систему приводит к ее супрессии, связанная с истощением ретикуло-эндотелиальной системы (Грекова Н.А. Влияние многократных ревакцинаций против бруцеллеза на состояние организма животных // ЖМЭИ. - 1968. - № 2. - С.131-140). Вакцина не может быть использована вместе с антибиотиками в случае необходимости экстренной профилактики.

Наиболее близким к заявленному изобретению аналогом является состав на основе очищенного антигена, выделенного из штаммов вида Br. abortus (№ 19 или 19 ВА или 99), или вида Br. melitensis (№ 565 или 16М) в S-форме (Драновская Е.А., Самойленко И.И. Способ получения антигена для профилактики бруцеллеза. Авт. свид. SU № 957471). Антиген получают путем обработки микробной биомассы бруцелл органическим растворителем с последующим гидролизом уксусной кислотой и лиофилизацией. Вакцинный препарат, состоящий из указанного антигена, предназначался как для профилактики бруцеллеза, так и для лечения больных людей (Драновская Е.А., Драновская Т.Н. Вакцина для профилактики и лечения бруцеллеза. Патент РФ № 2076493, заявка № 94023720). Недостатком указанной химической вакцины является ограниченная эффективность, срок длительности создаваемого иммунитета не превышал трех месяцев (Сравнительное изучение безвредности, реактогенности и антигенной активности бруцеллезной химической и живой вакцин в условиях контролируемого эпидемиологического опыта / Сумароков А.А., Каринская Г.А., Драновская Е.Е. и др. // ЖМЭИ. - 1984. - № 2. - С.58-63). Наряду с этим отмечалось появление местных реакций средней степени и болезненность в области инъекций у привитых (Изучение безвредности и реактогенности экспериментально-производственных серий бруцеллезной химической вакцины при различных методах ее аппликации / Ельшина Г.А., Сумароков А.А., Анисимова Т.И. и др.// ЖМЭИ. - 1991. - № 9. - С.50-53).Попытка усовершенствовать способ получения антигена за счет воздействия на него ионизирующим излучением, также не привела к значительному повышению протективных свойств вакцины. К тому же известно, что облучение может негативно отразиться на предмете воздействия, снижая его иммунобиологическую активность.

Возможным решением проблемы специфической профилактики и лечения бруцеллеза представляется разработка инактивированных вакцин на основе убитых вирулентных культур бруцелл, в которых сохраняется все разнообразие антигенных компонентов микробной клетки. В то же время известно, что в чистом виде убитые культуры быстро элиминируются из организма и при однократном введении не способны формировать стойкий напряженный иммунитет. Однако данный недостаток удается устранить при адекватном подборе компонентного состава, применением адьювантов и носителей, выбором эффективной дозы и схемы иммунизации. К тому же одним из достоинств убитых вакцин считается возможность их одновременного применения с антибиотиками для экстренной профилактики и лечения бруцеллеза, их легче дозировать, они более стандартны и стабильны.

Задачей изобретения является получение бруцеллезного антигена, пригодного для приготовления высокоиммуногенных вакцин, предназначенных как для лечения больных бруцеллезом людей с целью гипосенсибилизации и иммуномодуляции, так и для профилактики бруцеллеза.

Поставленная задача решается тем, что бруцеллезный антиген поливалентный корпускулярный в своем составе содержит смесь инактивированных нагреванием клеток возбудителя бруцеллеза вирулентных штаммов № 21, 145 Br. melitensis и 544 Br. abortus в соотношении 1:1:1.

Выращивание бруцелл осуществляют на мясо-пептонном агаре (МПА) или среде «Альбими», модифицированных введением стимулятора роста гемофильных микробов. Накопление микробов проводят по двум схемам. Первая из них включает в себя последовательное выращивание бактерий на плотной питательной среде, скошенной в пробирках и матрацах. Во втором случае бруцеллы дополнительно культивируют в жидкой питательной среде, состоящей из сернокислотного гидролизата рыбо-костной муки в течение 48 часов в 20-литровых стеклянных бутылях или в аппаратах-культиваторах в условиях аэрации.

В агаровых культурах с каждого матраца и во всех глубинных культурах оценивают: присутствие посторонней микрофлоры в мазках, окрашенных по Граму, и высевах на «голодный» агар; наличие диссоциации в пробе с раствором трипафлавина; оптическую концентрацию микробов.

Исходя из результатов определения концентрации микробов по стандарту мутности, суспензию разводят физиологическим раствором хлористого натрия до концентрации 30...40·10⁹ клеток в 1 см³. После этого осуществляют термоинактивацию микробной взвеси культур каждого штамма при температуре 60°С и добавляют 5,0% раствор дважды перегнанного фенола до конечной его концентрации в суспензии 0,5%. Затем микробную взвесь помещают в термостат и выдерживают 48 ч при температуре (36-38)°С.

Эффективность инактивации культур оценивают по показателям общей и специфической стерильности, специфической безопасности.

Антиген, полученный, указанным выше способом, с добавлением консерванта - раствора фенола до конечной концентрации 0,25% в готовой форме препарата предлагается использовать для приготовления вакцины лечебной бруцеллезной жидкой (вакцина № 1), предназначенной для проведения специфического лечения различных форм бруцеллеза у людей. С этой целью маточные взвеси культур штаммов № 21, 145 Br. melitensis и штамма № 544 Br. abortus смешивают в соотношении 1:1:1 и разводят физиологическим раствором до 1·10⁹ м.к. в 1 мл, содержащим дважды перегнанный фенол, до конечной его концентрации 0,25%. Готовую вакцинную взвесь разливают в ампулы и запаивают.

В то же время возможно изготовление вакцины бруцеллезной адсорбированной инактивированной жидкой для иммунизации людей (вакцина № 2), состоящей из указанных выше инактивированных микробных клеток, адъюванта и консерванта, с концентрацией 4,5-5,5·10⁹ микробных клеток в 1 см³ при следующем соотношении компонентов, об.%:

инактивированные нагреванием клетки вирулентных микробов штаммов № 21, 145 Br. melitensis и 544 Br. abortus в соотношении 1:1:1 с концентрацией 30-40·10⁹ микробных клеток в 1 см³ - 12,5-16,7;

раствор фенола 5%-ный - 4,5-5,5;

гидроокись алюминия (до содержания ионов алюминия 0,07-0,12) - 16,3-28,0;

физиологический раствор хлорида натрия - до 100,0.

Готовую вакцину расфасовывают во флаконы. Каждую серию вакцины проверяют на общую и специфическую стерильность, токсичность для белых мышей, специфическую безопасность.

Используемые для приготовления бруцеллезного антигена штаммы отвечают требованиям производства инактивированных биопрепаратов, депонированы в коллекции НИИ микробиологии МО РФ, г.Киров под номерами: 21, 145, 544 и имеют следующие паспортные характеристики и иммунобиологические свойства.

Штамм № 21 Br. melitensis выделен от больного человека в Дагестанской республике, штамм № 145 Br. melitensis также выделен от больного человека в Чимкентской области, штамм № 544 Br. abortus является международным референтным. Указанные штаммы бруцелл относятся к 1 биотипу своего вида, находятся в стабильной S-форме, обладают типичными культуральными и биохимическими свойствами.

Бруцеллы мелкие (0,3-0,6×0,6-2,5) мкм, грамотрицательные, неподвижные коккобактерии.

Культуральные и биохимические свойства.

Оптимальная температура роста - 37°С. Оптимальная величина рН среды культивирования - 6,8-7,2. При выращивании на плотной питательной среде дают характерный для S-форм рост. На плотной питательной среде образуют бесцветные, выпуклые, круглые с гладкой поверхностью колонии; в жидкой питательной среде дают равномерное помутнение.

Штаммы находятся в стабильной S-форме. Микробные колонии (S-форма) не окрашиваются раствором кристаллического фиолетового или приобретают светло-желтый цвет. При постановке пробы с 0,2% раствором трипафлавина на стекле бактериальные клетки остаются равномерно взвешенными в жидкости.

Агглютинабельные свойства.

Штаммы обладают типоспецифической агглютинабельностью: Br. melitensis агглютинируются М-сывороткой, и не агглютинируются А монорецепторной сывороткой, Br. abortus агглютинируются А - сывороткой, и не агглютинируются М монорецепторной сывороткой.

Антигенные свойства.

При введении кроликам 20×10⁹-ной взвеси убитых нагреванием бруцелл титр агглютининов в сыворотке кроликов 1:800. Культуры штаммов агглютинируются до титра СОП сыворотки диагностической бруцеллезной кроличьей агглютинирующей (при титре ее не менее 1600).

Вирулентность культур штаммов.

При подкожном введении штаммов морским свинкам с последующим бактериологическим исследованием селезенки ИД₅₀ для штамма 145 Br. melitensis составила от 2 до 12 микробных клеток, для штамма 21 Br. melitensis от 7 до 13, для штамма 544 Br. abortus от 4 до 16 (р≥0,05).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Антиген поливалентный корпускулярный используется для приготовления вакцины № 1, предназначенной для специфического лечения бруцеллеза у людей.

В предварительных опытах на морских свинках массой 250-300 г, зараженных подкожно вирулентной культурой штамма 16М Br. melitensis в дозе 10 ИД₅₀, проводилась монотерапия вакциной. Лечение было начато через 50 дней после заражения. Вакцину вводили подкожно в нарастающих дозах 40-80-200-400-2000-4000 тыс. м.к., эквивалентных человеко-дозе, с интервалом 72 часа. Расчетное количество препарата вводили в объеме 1,0 см³ в паховую область животного, противоположную месту заражения.

В течение опыта контролировали специфические показатели: титры агглютининов в сыворотке крови при постановке РА, опсонофагоцитарные число и индекс, наличие и выраженность аллергической реакции при постановке пробы Бюрне, высеваемость микробов возбудителя бруцеллеза из органов лабораторных животных. Результаты исследований показали интенсивный подъем титра антител в сыворотке животных после четырех инъекций препарата, который на порядок был выше по сравнению с таковым в группе не леченых животных. У большинства морских свинок после проведения вакцинотерапии отмечено нарастание активности фагоцитов, фагоцитарный показатель составил 52-68.

В то же время отмечено 7-10-кратное уменьшение интенсивности аллергической реакции по окончании лечения. Шестикратная инъекция препарата практически полностью снимает высокую аллергическую перестройку организма, являющуюся ведущим фактором в патогенезе этого заболевания, в сравнении, в группе не леченых животных проба Бюрне была ярко выражена и составила 0,8-1,4 см. Проведение курса монотерапии вакциной в 43 процентах случаев привело к выздоровлению. Данный результат исследования оказался несомненно положительным, поскольку, не включая антибактериальные средства, удалось добиться элиминации возбудителя из организма почти половины больных животных.

Пример 2

В предварительных опытах на морских свинках массой 250-300 г, зараженных подкожно вирулентной культурой штамма 16М Br. melitensis в дозе 10 ИД₅₀, проводилось комплексное лечение лечебной бруцеллезной вакциной, используя высокоэффективные в отношении бруцелл антибиотики - пефлоксацин или доксициклин. Пефлоксацин вводился в суточной дозе равной 0,024 г per os, доксициклин в суточной дозе равной 0,004 г per os ежедневно в течение 20 суток, лечебная бруцеллезная вакцина в нарастающих дозах (40-80-200-400-2000-4000 тыс. м.к.), эквивалентных человеко-дозе, с интервалом в 72 часа.

В течение опыта у морских свинок контролировали показатели, описанные в примере № 1.

Результаты опытов показали, что проведение как комплексной терапии, так и монотерапии бруцеллезной вакциной приводит к интенсивному стимулированию гуморального и клеточного звеньев иммунитета. В сравнении, при антибиотикотерапии титры агглютининов в сыворотке животных в большинстве случаев уступали контрольным и составили в среднем 30 ME, что обусловлено локализацией инфекции, а возможно, и иммунодепрессивным действием антибактериальных препаратов.

Проведение комплексного лечения вакциной вновь подтвердило высокое десенсибилизирующее действие препарата, поскольку вакцинотерапия способствовала многократному уменьшению кожной аллергической реакции. В сравнении, введение одного пефлоксацина или доксициклина лишь на 30% уменьшило интенсивность аллергической реакции, по сравнению с контрольной группой. Включение вакцины в комплексное лечение совместно с пефлоксацином или доксициклином позволило добиться излечения 83 и 87 процентов больных бруцеллезом лабораторных животных, соответственно, что в 1,5-2,0 раза превысило данный показатель по сравнению с монотерапией вакциной и более чем на 20% монотерапию антибиотиками.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что вакцина, активно стимулируя гуморальный и клеточный иммунитеты, значительно уменьшает значимость ведущей причины поздних осложнений при бруцеллезной инфекции - сенсибилизацию и тем самым способствует выведению возбудителя из макроорганизма, т.е. фактически полностью снимает главный симптомокомплекс бруцеллезной инфекции.

Пример 3

Антиген поливалентный корпускулярный используется для приготовления вакцины № 2, предназначенной для профилактики бруцеллезной инфекции.

Иммуногенные свойства экспериментальных образцов вакцины оценивали на морских свинках массой 300-400 г. Препарат вводили подкожно в паховую область по 1 см³. Через 30 и 90 суток иммунизированных морских свинок заражали вирулентной культурой штамма 16М Br. melitensis. Одновременно инфицировали группу неиммунизированных морских свинок (контроль).

Через 30 суток у животных забирали кровь для РА, проводили аллергическую пробу и усыпляли эфиром. При бактериологическом обследовании делали высевы на питательные среды (МПБ и МПА) из паховых, подчелюстных, парааортальных, шейных лимфоузлов, печени, селезенки, костного мозга. Посевы инкубировали при температуре (36-38)°C и контролировали визуально через 4-6 суток и через 14 суток. Результаты исследований представлены в таблицах 1, 2.

Анализ данных, представленных в таблице 1, показывает, что при введении вакцины в дозах от 1,25 до 10,0 млрд. через 30 суток после иммунизации наблюдается одинаковый уровень защиты морских свинок от заражения культур высоковирулентного штамма 16М Br. melitensis, равный 73-77%. При этом обращает на себя внимание факт наличия близкого по величине уровня агглютининов у всех групп иммунизированных животных.

В то же время проведение аналогичных исследований через 3 месяца после иммунизации морских свинок показало, что уровень защиты при введении 2,5 млрд. клеток снижается до 55% (таблица 2), тогда как при введении 5,0 млрд. клеток он сохраняется на уровне 78%, а при дозе - 10,0 млрд. повышается до 88%.

В ходе проведенных экспериментов было выявлено, что через 30 суток после иммунизации у инфицированных морских свинок титр агглютининов составлял в среднем по всем группам 244 ME, что статистически достоверно ниже, чем у не заболевших животных - 450 ME (Р≥0,05). В противоположность указанному факту через 120 суток после вакцинации титр агглютининов, равный 600 ME у заболевших животных, превышал таковой у оставшихся здоровыми морских свинок - 67 ME.

Таким образом, использование предлагаемого бруцеллезного антигена, состоящего из инактивированных вирулентных штаммов № 21, 145 Br. melitensis и 544 Br. abortus в отношении 1:1:1, адьюванта и консерванта для приготовления вакцины инактивированной адсорбированной в дозе 5 млрд. м.к., позволяет добиться более 70% защиты животных от заражения вирулентной культурой возбудителя бруцеллеза спустя 3 месяца после иммунизации. Полученные данные позволяют сделать вывод о возможности дальнейшего использования данного препарата в качестве профилактической вакцины.

Таблица 1Результаты определения эффективности вакцины для морских свинок на 30 сутки после иммунизации
Доза вакцины, млрд. м.к. см3	Количество животных, взятых в опыт	Количество заболевших животных	Процент защиты	Средний по группе титр агглютининов в РА на 30 сутки после заражения, ME, х (хmin...хmax)
1,25	13	3	77	460 (320...1280)
2,5	11	4	73	460 (320...640)
5,0	13	3	77	430 (320...1280)
Контроль	15	15	0	80 (40...120)
Примечание - животные заражены подкожно культурой штамма 16М Br. melitensis в дозе 105 живых микробов.

Таблица 2Результаты определения эффективности вакцины для морских свинок на 90 сутки после иммунизации
Доза вакцины, млрд. м.к. см3	Количество животных, взятых в опыт	Количество заболевших животных	Процент защиты	Средний по группе титр агглютининов в РА на 30 сутки после заражения, ME, х (хmin...хmax)
2,5	11	5	55	60 (20...160)
5,0	9	2	78	80 (20...160)
10,0	8	1	88	80 (20...160)
Контроль	15	15	0	40 (20...80)
Примечания: 1. Животные заражены подкожно культурой штамма 16М Br. melitensis в дозе 120 живых микробов.2. У всех заболевших животных определена положительная аллергическая реакция на внутрикожное введение бруцеллина.

Антиген поливалентный корпускулярный для изготовления лечебных и профилактических препаратов против бруцеллеза, содержащий смесь инактивированных нагреванием при температуре 60°С в течение 1 ч клеток вирулентных штаммов №№21, 145 Br. melitensis и 544 Br. abortus в соотношении 1:1:1.