Способ получения живой культуральной вакцины против вируса гриппа

Способ получения живой культуральной вакцины против вируса гриппа

Реферат

Область техники

Изобретение относится к технологии получения живой гриппозной вакцины и может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства вакцин и лечебно-профилактических препаратов.

Во всем мире для защиты населения от гриппа производятся и применяются инактивированные, субъединичные формы гриппозных вакцин, приготовленные на куриных эмбрионах, которые при правильном применении могут защитить от гриппа 80% вакцинированных. Однако высокая стоимость таких препаратов, а также сложность производства и применения инактивированных вакцин затрудняют их использование для массовой профилактики гриппа. Несмотря на то что инактивированные вакцины формируют более высокий уровень общего гуморального иммунитета, эти препараты практически не способны индуцировать местный секреторный иммунитет. Эффективность инактивированной гриппозной вакцины резко снижается даже при небольших изменениях антигенной структуры эпидемического штамма по сравнению с вакцинным.

В России широко применяется живая вакцина, стимулирующая при интраназальном применении развитие бессимптомной инфекции с формированием гуморального, секреторного и клеточного иммунитета и иммунологической памяти. Достаточно эффективные живые вакцины имеют определенные преимущества перед убитыми вакцинами по экономичности, простоте производства и применения, а также по большей широте иммунологического действия. С этими преимуществами связано усиление внимания в последнее время к разработке живой гриппозной вакцины и в США. Применяемые в настоящее время гриппозные вакцины нуждаются в ежегодной корректировке с учетом постоянно происходящих изменений в антигенном составе поверхностных гликопротеинов вируса. Каждый год возникает непрогнозируемая ситуация, когда за очень короткий отрезок времени необходимо произвести достаточное количество вакцины, обладающей адекватной эффективностью в отношении штаммов, которые вероятнее всего вызовут эпидемию гриппа.

Живая гриппозная вакцина индуцирует широкий спектр антител, способных нейтрализовать варианты с изменившейся антигенной специфичностью гемагглютинина. Кроме того, живая вакцина является более экономичной, т.к. требует примерно в 10 раз меньше куриных эмбрионов для производства. Применение в производстве вакцины культуры клеток позволяет сделать вакцину еще более экономичной, а использование бессывороточной питательной среды полностью исключит аллергические реакции вакцинированных на белки куриных яиц.

Предшествующий уровень техники

Известен способ получения инактивированной вирусной вакцины, включающий культивирование штаммов вируса гриппа в куриных эмбрионах в течение 72-96 часов, инкубацию эмбрионов в течение ночи в холодильнике, последующий сбор аллантоисной жидкости, инактивацию вируса, очистку с помощью фильтрации и/или центрифугирования (Requirements For Inactivated Influenza Vaccine, World Health Organization Technical Report Series, 384 (1966).

Недостатками данного способа являются содержание в вакцине определенных количеств белков куриных эмбрионов, которые вызывают неблагоприятные реакции у лиц с аллергией к этим белкам; изменение антигенной структуры вируса при культивировании в куриных эмбрионах за счет утраты определенных антигенных доменов; возможность контаминации посторонними вирусами; потребность (одномоментная) в большом количестве куриных эмбрионов при наработке вакцины. Для получения одной дозы вакцины требуется 1-2 куриных эмбриона, т.е. для наработки 1 млн доз гриппозной вакцины необходимо более 1 млн куриных эмбрионов. Кроме того, каждый куриный эмбрион представляет собой уникальную биологическую систему и тем самым предполагает наличие определенной нестабильности получаемого вакцинного препарата.

Известен другой способ получения живой вирусной вакцины (Фармакопейная статья Министерства здравоохранения России №42-3569-98 «Вакцина гриппозная аллантоисная живая интраназальная сухая для взрослых»), включающий заражение куриных эмбрионов вакцинными штаммами вируса гриппа, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, введение мясного пептона, розлив в ампулы, лиофилизацию и запайку. Готовый продукт представляет собой сухую пористую массу, обладающую запахом пептона.

Однако очистка от балластных примесей в технологии не предусмотрена, что отрицательно сказывается на аллергологической безопасности вакцины. Кроме того, наблюдается изменение антигенной структуры вируса гриппа при культивировании в куриных эмбрионах, и не исключена контаминация вакцины ретровирусами и др. вирусами птиц, присутствующими в эмбрионах.

Известен другой способ (US 5698433, B1, 16.12.1997) получения инактивированной вакцины против гриппа, включающий культивирование штаммов вируса гриппа на агрегатах первичных клеток куриных эмбрионов в присутствии трипсина в лабораторном спиннере или двухлитровом ферментере, сбор вируссодержащей жидкости, ультрафильтрацию, цетрифугирование, инактивацию вируса и введение гидроокиси алюминия в качестве адъюванта. Технология проста в исполнении, позволяет получать большие объемы вируссодержащей жидкости с высоким титром активности вируса (выход с клеток, полученных из 4 куриных эмбрионов, составляет 400-500 мл вируссодержащей жидкости в течение 96 ч или 100 мл антигена, что в 14 раз выше, чем на куриных эмбрионах). Получаемая вакцина не содержит примеси белков куриных яиц.

Однако указанный способ обладает рядом недостатков: используется первичная культура клеток, не обладающая стандартными свойствами и недостаточно охарактеризованная; возможна контаминация культуры клеток и вакцины посторонними вирусами, микоплазмами, прионами; используется культура клеток куриных эмбрионов, следовательно, возможно изменение антигенной структуры штаммов вируса гриппа, что имеет место при культивировании на куриных эмбрионах.

Помимо указанных недостатков во всех известных технологиях производства гриппозных вакцин, в том числе в описанных выше аналогах, используют продукты животного происхождения (сыворотка крови крупного рогатого скота, трипсин, желатоза или человеческий сывороточный альбумин в качестве стабилизатора), что может привести как к аллергизации иммунизируемых, так и возможному заражению посторонними вирусами, микоплазмами, прионами, содержащимися в продуктах животных.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения инактивированных и живых гриппозных вакцин (US 6344354, B1, 05.02.2002), включающий культивирование высокопродуктивных штаммов вируса гриппа на аттестованных перевиваемых линиях клеток (Vero, MDCK) в питательной среде Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки и трипсина в количестве (0,05-1,0 мкг/мл), отмывку клеток после образования монослоя, введение бычьего сывороточного альбумина, сбор вируссодержащей жидкости, очистку с помощью центрифугирования или хроматографии и последующее введение хемотерапевтических компонентов, адъювантов или полимеров (полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль).

Недостатками данного способа-прототипа являются монослойное культивирование клеток в культуральных флаконах, что не может обеспечить наработку больших объемов вируссодержащей жидкости; использование для культивирования клеток питательной среды Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки, а также введение на стадии наработки вируса бычьего сывороточного альбумина, что приводит к внесению в вакцину компонентов сырья животного происхождения, которые могут являться источником посторонних вирусов, микоплазм, прионов, а также вызывать дополнительную аллергизацию иммунизируемого организма.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом предлагаемого способа является получение в промышленных масштабах живой культуральной трехвалентной гриппозной вакцины на основе вакцинных холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А и В для интраназального и парентерального применения с более низким содержанием посторонних белковых компонентов животного происхождения, что снижает возможность аллергических реакций.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения живой гриппозной вакцины, включающем культивирование перевиваемых клеток MDCK в питательной среде, получение вируссодержащей субстанции путем культивирования вакцинных штаммов вируса гриппа в культуре клеток MDCK на этой же питательной среде, очистку вирусной субстанции от балластных примесей, введение в очищенную субстанцию стабилизирующих добавок и сушку готовой формы вакцины, согласно изобретению в качестве вирусных штаммов используют вакцинные холодоадаптированные реассортанты штаммов вирусов гриппа, в качестве питательной среды при культивировании клеток MDCK и штаммов вирусов гриппа на указанных клетках используют бессывороточную питательную среду с добавлением гидролизата сои в концентрации 0,01-10% и протеолитического фермента в количестве 0,25-50,0 мкг/мл до введения посевной дозы штаммов вирусов гриппа, а культивирование культур клеток MDCK и холодоадаптированных штаммов вируса гриппа в указанной культуре клеток осуществляют в суспензии на микроносителях, вносимых в бессывороточную питательную среду в концентрации 1-6 г/л.

В качестве культуры клеток MDCK используют культуру, заложенную на хранение при температуре жидкого азота в виде посевного и рабочего банков и аттестованную на отсутствие посторонних вирусов, отсутствие онкогенных потенций и видовую идентичность.

В качестве вакцинных холодоадаптированных реассортантов вируса гриппа используют вакцинные штаммы типа A/H3N2; A/H1N1 и типа В этого вируса.

Посевная доза перевиваемых клеток MDCK составляет 100-600 тыс. клеток на 1 мл среды, а посевная доза вакцинных штаммов вируса гриппа имеет множественность заражения 0,01-0,0001 ЭИД₅₀/кл.

В качестве протеолитического фермента используют протеолитический фермент растительного происхождения папаин, а в качестве микроносителя - Цитодекс 1.

Сбор вируссодержащей жидкости осуществляют после достижения специфической активности вируса гриппа не менее 8,0 lg ЭИД₅₀/мл, а удаление балластных примесей из вирусной субстанции осуществляют фильтрованием.

В качестве стабилизирующих добавок используют сахарозу и пептон из сои в конечной концентрации (5-10) и (3-8) мас.% соответственно.

Сушку вакцины осуществляют путем ее замораживания в течение 18 ч при температуре не выше минус 40°С с последующей лиофилизацией в течение 48 ч, причем перед запайкой ампулы с вирусной вакциной заполняют инертным газом, в частности аргоном.

Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины представляют собой реассортанты, получаемые в России на основе холодоадаптированных мутантов - доноров аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) и В/СССР/60/69. Эти доноры характеризуются холодоадаптированностью, т.е. способностью размножаться при пониженной температуре, температурочувствительностью и безвредностью для лабораторных животных и человека. Необходимым условием безвредности и генетической стабильности вакцинных штаммов считается наличие в составе их генома 5-6 мутантных генов, кодирующих внутренние белки донора аттенуации, при этом гены гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) всегда происходят от актуального эпидемического вируса.

Штамм А/47/Шандон/93/1(H1N1) получен при скрещивании холодоадаптированного мастер-штамма А/Ленинград/134/47/57(H2N2) с эпидемическим штаммом А/Шандон/93/1(Н1N1).

Штамм вируса гриппа А/47/Иоганнесбург/94/2(Н3N2) получен при скрещивании холодоадаптированного мастер-штамма А/Ленинград/134/47/57(H2N2) с эпидемическим штаммом A/Иоганнесбург/94/2(H3N2).

Штамм В/60/Петербург/95/20 получен при скрещивании холодоадаптированного мастер-штамма В/СССР/60/69 с эпидемическим штаммом В/Петербург/95/20.

Вакцинные штаммы вируса гриппа хранятся в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биопрепаратов (ГИСК) им. Л.А.Тарасевича, г.Москва.

Существенным преимуществом перевиваемых клеток является их стабильность, стандартность, возможность получения большого количества клеток-продуцентов в достаточно короткие сроки, долговременное использование клеток, относительно низкая стоимость вакцинных препаратов. Клеточные линии, аттестованные в соответствии с требованиями ВОЗ, свободны от контаминирующих агентов, в то время как куриные эмбрионы нередко содержат ретровирусы и некоторые другие агенты. При выращивании вирусов гриппа на перевиваемых линиях клеток, которые можно культивировать при использовании бессывороточных сред, исключается возможность аллергических реакций на вакцину у лиц с аллергией к компонентам клеток куриных эмбрионов и компонентам сыворотки, что также особенно важно при изготовлении живых гриппозных вакцин, которые не проходят такой тщательной очистки, как инактивированные гриппозные вакцины. Кроме того, гемагглютинин штаммов вируса гриппа человека, выделенных и культивируемых в куриных эмбрионах, может терять один из антигенных доменов, в то время как при выделении и культивировании вируса гриппа на линии клеток MDCK все антигенные домены сохраняются, и гемагглютинин таких изолятов антигенно полностью идентичен гемагглютинину вируса гриппа, размножающемуся в организме человека. Имеются также данные о том, что вакцины, приготовленные на клетках MDCK или Vero, лучше защищают вакцинированных животных от заражения вирулентными штаммами вируса гриппа, а также индуцируют более кросс-реактивные антитела, чем вакцины, полученные на куриных эмбрионах, которые больше стимулируют антитела, специфические к гомологичному антигену (Alymova I., Kodihalli S., Govorkova E. et al. Immunogenicity and protective efficacy in mice of influenza virus В vaccines grown in mammalian).

Среди клеточных линий, потенциально пригодных для производства гриппозных вакцин, исследовались, главным образом, линия клеток MDCK, происходящая из клеток почек собаки, и линия клеток Vero, полученная из клеток почки африканской зеленой мартышки. В сравнительных опытах (Merten О., Managuerra J., Hannoun С. et al. Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. In: Novel Strategies in Design and Production of Vaccines. Eds. Cohen S., Shafferman A., Plenum Press, N.-Y., 1996, pp. 141-150) было показано, что клетки MDCK продуцируют одинаковое количество клеток в 2 раза быстрее, чем клетки Vero, и в 7 раз быстрее, чем клетки ВНК. Что касается продукции гемагглютинина, то общее количество оказалось примерно одинаковым в клетках MDCK и Vero, однако в клетках MDCK это количество образуется на 6-й день после заражения, а в клетках Vero - на 14-й.

Гидролизат сои получают путем частичного гидролиза соевого изолята Maisol (Германия) в 0,1 нормальном растворе соляной кислоты при двух избыточных атмосферах в автоклаве. Гидролизат из сои в указанных концентрациях является дополнительным питательным компонентом для культур клеток MDCK.

Папаин - растительный протеолитический фермент класса гидролаз - проявляет широкую субстратную специфичность и производится фирмой ICN, США. Папаин обеспечивает в питательной среде в указанных концентрациях гарантированное проникновение вируса гриппа в клетки MDCK в процессе их инфицирования указанным вирусом.

Микроносители обеспечивают в указанных концентрациях более высокую наработку клеток и вируса и больший выход вируссодержащего материала. В процессе экспериментальных исследований подобраны именно микроносители Цитодекс 1 фирмы Sigma размером 1 мм, на поверхности которых формируются устойчивые монослои клеток MDCK, которые способны продуцировать вирус гриппа, не теряя своих физиологических функций.

Бессывороточная питательная среда MDSS2 производится фирмой Axcevir, Франция.

Варианты осуществления изобретения

Ниже приведены примеры конкретного выполнения способа получения живой культуральной гриппозной вакцины.

Пример №1. Аттестация культуры клеток MDCK

Для работы используют культуру клеток MDCK из посевного и рабочего банков. Аттестацию культуры клеток MDCK проводят в соответствии с требованиями ВОЗ к перевиваемым линиям клеток.

Исследована цитоморфология культуры в нативных и фиксированных препаратах в световом микроскопе. Показано, что культура клеток MDCK состоит из эпителиоподобных клеток. Ядра округлые с хроматиновой зернистостью. Ядрышки округлые, от одного до нескольких в ядре. Цитоплазма зернистая. Имеются гигантские и многоядерные клетки, количество которых увеличивается в процессе культивирования. Клетки образуют монослой на 2 сутки культивирования, в то же время отмечается пик митотической активности, патологические митозы не наблюдаются.

При проведении контроля культуральной жидкости методом посева на тиогликолевую среду установлено, что посевной и рабочий банки клеток MDCK обладают стерильностью.

Методом прямого посева культуральной жидкости посевного и рабочего банков клеток MDCK на селективные питательные среды и методом окраски ДНК интеркалирующими флюорохромами микоплазма не обнаружена. Для системы ПЦР-анализа использовали две пары праймеров (GPO-1 и MGSO- для первого цикла; GPO-2 и MGSO- для второго цикла), которые позволяют выявить все известные виды микоплазм. Методом ПЦР-анализа микоплазма не обнаружена.

Проведен контроль на выявление посторонних вирусов в культуре клеток, на куриных эмбрионах и на животных. При контроле посевного и рабочего банков на культуре клеток исследовали состояние монослоя интактных клеток посевного и рабочего банка в течение 14 суток. Цитопатического действия (ЦПД) не обнаружено. По истечении этого срока пробы культуральной жидкости исследовали в реакции гемагглютинации, а монослой в реакции гемадсорбции с эритроцитами морских свинок. Реакции отрицательные. Пробы культуральной жидкости исследовали в трех видах клеточных культур: MDCK (гомологичной), Л-68 (диплоидная культура), Vero, в течение 14 суток. ЦПД не обнаружено. По истечении этого срока пробы культуральной жидкости исследовали в реакции гемагглютинации, а монослой - в реакции гемадсорбции с эритроцитами морской свинки. Реакции отрицательные. В посевном и рабочем банках линии MDCK цитопатогенных, гемадсорбирующих и гемагглютинирующих вирусов не обнаружено.

При контроле посевного и рабочего банков на куриных эмбрионах исследуемый материал в количестве 10⁶ клеток вводили в желточный мешок, аллантоисную полость и на хорионаллантоисную оболочку куриных эмбрионов (по 10 эмбрионов на точку), эмбрионы инкубировали в течение 7-10 сут, после чего определяли жизнеспособность эмбрионов и ставили реакцию гемагглютинации с аллантоисной жидкостью. В посевном и рабочем банках линии MDCK посторонних вирусов не обнаружено.

При контроле посевного и рабочего банков на лабораторных животных исследуемый материал внутримышечно вводили мышам-сосункам в возрасте 24 ч (28 голов мышей-сосунков, 10⁷ клеток на группу), взрослым мышам (10 голов, 10⁷ клеток на группу мышей), морским свинкам (5 голов, 10⁷ клеток на группу), кроликам (5 голов, 10⁷ клеток на группу животных), за животными проводили наблюдение в течение 28 дней, после чего проводили автоназию и осмотр внутренних органов. Все животные в эксперименте были живы, изменений внутренних органов не отмечено. Посторонних вирусов в посевном и рабочем банках клеток MDCK не обнаружено.

Онкогенные потенции клеток посевного и рабочего банков определяли в системе in vivo. При контроле использовали метод гетеротрансплантации клеток иммуносупрессивным животным в сравнительных опытах с эталонной клеточной линией Hela, вызывающей прогрессирующий рост опухолей. За животными наблюдали в течение 21 суток. При этом все животные были живы, при макроскопическом исследовании на наличие опухоли в лимфатических узлах, печени, почках, легких и в месте введения клеток патологические изменения не выявлены. При контроле в системе in vivo установлено, что клетки MDCK посевного и рабочего банков онкогенными потенциями не обладают.

Проведен контроль видовой идентичности клеток линии MDCK методом кариологического анализа и методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения изоферментов. При кариологическом анализе клеток линии MDCK установлено, что кариотип представляет собой производную от нормального кариотипа собаки, Canis familiaris, 2n=78. Клетки MDCK характеризуются присутствием нормальных (не перестроенных) аутосом, по некоторым аутосомам отмечена трисомия (пары 29, 30, 38). Одна из Х хромосом также не перестроена. Кроме того, клетки MDCK характеризуются присутствием маркерных хромосом, образованных в результате разнообразных транслокаций участков хромосом (предположительно X, 3, 4, 21, 23, 24, 28). Очевидных полиплоидов не отмечено. Клетки посевного и рабочего банков MDCK имеют достаточно стабильный кариотип, характеризующийся четкими морфологическими признаками. Проведен анализ электрофоретической подвижности изофермента Г-6-ФДГ. Клетки MDCK посевного и рабочего банков имеют Г-6-ФДГ, характерные для клеток собаки.

Пример №2. Приготовление субстанции живой культуральной гриппозной вакцины (ЖГВ)

Культуральный сосуд 1- или 10-литрового ферментера заполняют бессывороточной питательной средой. Аттестованную культуру клеток MDCK (в соответствии с примером 1) берут из банка коллекции культур клеток ГНЦ ВБ «Вектор» и вносят ее в указанный культуральный сосуд из расчета 100-600 тыс. клеток на мл питательной среды. Дополнительно в культуральный сосуд вносят микроноситель Цитодекс I в концентрации 1-6 г/л. Осаждение клеток на микроносителе проводят 12 часов при температуре 35-37°С (объем заполнения культурального сосуда - 25-30%). Режим посадки клеток: 5 мин перемешивание, 10 мин перерыв. Заданные параметры культивирования: частота вращения перемешивающего устройства 50-80 об/мин, аэрация поверхностная со скоростью продува от 0 до 10 л/ч. Водородный показатель рН поддерживают в пределах от 6,9 до 7,2 с помощью дозированной подачи 7,5%-ного раствора углекислого натрия. Температура культивирования 35-37°С. Перфузию питательной среды начинают при концентрации клеток 600-900 тыс./мл. Скорость перфузии зависит от концентрации клеток. Время культивирования клеток - 96-144 часов. После наработки клеток удаляют 50% среды, в суспензию вносят один из вакцинных холодоадаптированных реассортантов вируса гриппа, например А/47/Иоганнесбург/94/2 (H3N2), с множественностью заражения 0,01-0,0001 ЭИД₅₀/кл, и поддерживающую бессывороточную питательную среду, содержащую протеолитический фермент папаин в количестве 0,25-50,0 мкг/мл или трипсин в количестве 2,0-20,0 мкг/мл и гидролизат сои в концентрации 0,01-10%. Далее культивируют вирус при температуре (34±1)°С. При появлении цитопатического действия вируса на клетки (2-5 суток) осуществляют сбор вируссодержащей жидкости со специфической активностью не менее 8,0 lg ЭИД₅₀/мл, которую освобождают фильтрованием от клеточного детрита. В вируссодержащую суспензию добавляют стерильный раствор стабилизатора (сахароза и пептон из сои в конечной концентрации 10% и 5% соответственно) для получения жидкого полуфабриката штамма А/47/Иоганнесбург/94/2 (H3N2) живой гриппозной вакцины (ЖГВ).

Таким же образом, параллельно или последовательно, нарабатывают жидкий полуфабрикат вакцинных штаммов холодоадаптированных реассортантов вируса гриппа А/47/Шандон/93/1 (H1N1) и В/60/Петербург/95/20.

Примечание: ЭИД - эмбриональная инфекционная доза.

Пример №3. Получение готовой формы ЖГВ

Для получения трехвалентной вакцины перед розливом жидкие полуфабрикаты, полученные из вируссодержащей жидкости вакцинных штаммов А/47/Иоганнесбург/94/2 (H3N2), А/47/Шандон/93/1 (H1N1) и В/60/Петербург/95/20 вируса гриппа, объединяют в равных пропорциях. Для получения моновакцины используют жидкий полуфабрикат одного из выше приведенных штаммов вируса гриппа. Полученную жидкую форму вакцины разливают в ампулы по 0,6 мл в каждую и замораживают при температуре не выше минус 40°С в течение 18 ч. Продукт лиофильно высушивают в течение 48 ч в стерильных условиях. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном) и запаивают.

Пример №4. Определение специфической активности препаратов живой гриппозной вакцины

Специфическую активность вируссодержащего материала определяют в моновакцинах до сведения в трехвалентную вакцину, полученных одновременно с тривакциной, путем титрования на куриных эмбрионах по методике, изложенной в Методических указаниях «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям». МУК 4.1/4.2.588-96. Специфическая активность вакцины после лиофилизации составляет не менее 6,0-6,5 lg ЭИД₅₀/0,2мл.

Пример №5. Изучение динамики размножения вируса гриппа при разной множественности заражения на примере штамма А/47/Шандон/93/1 (H1N1) вируса гриппа

Культуру клеток MDCK заражают штаммом А/47/Шандон/93/1 (H1N1) вируса гриппа при разной множественности заражения (0,001; 0,005, 0,0005 и 0,0001 ЭИД₅₀/кл) и культивируют в среде Игла MEM или в бессывороточной среде в присутствии 1-6 мкг/мл трипсина. При множественности заражения 0,005 и 0,001 ЭИД₅₀/кл максимальный титр вируса при использовании среды Игла MEM (при использовании в составе ростовой среды для посадки клеток 5% фетальной сыворотки) достигается уже на 2-3 сутки, а в случае бессывороточной среды - только на 3-4 сутки, но титры были выше на 1-1,5 lg (Таблица 1). Уменьшение множественности до 0,0005 ЭИД₅₀/кл приводит к сдвигу максимальных титров еще на 1 сутки (для штамма А/47/Шандон/93/1 (H1N1) при использовании сыворотки для посадки клеток максимальный титр был на 4-е сутки и составлял 10^10,5 ЭИД₅₀/мл, при использовании бессывороточной среды - на 5-е сутки, титр равен 10^9,5 ЭИД₅₀/мл). Дальнейшее уменьшение множественности инфекции не способствует увеличению инфекционных титров в течение 5 суток эксперимента.

Таблица 1
Динамика накопления вируса гриппа А/47/Шандон/93/1 (H1N1) в культуре клеток MDCK при разной множественности заражения
Множественность заражения (ЭИД50/кл)	Дни учета	Титр вируса в lg ЭИД50/мл
Среда +5% фетальной сыворотки	Бессывороточная среда
0,005	1	4,5	4,5
2	7,5	7,5
3	8,0	8,5
4	8,0	9,5
5	7,7	7,5
0,001	1	2,5	0
2	7,5	5,5
3	7,5	6,5
4	75	8,5
5	7,5	8,5
0,0005	4	10,5	9,0
5	8,0	9,5
0,0001	4	8,3	8,0

Пример №6. Изучение стабильности ts^- ₄₀ и са⁺ ₂₅ генетических признаков

У всех трех холодоадаптированных штаммов вируса гриппа изучали стабильность ts^- ₄₀ (неспособность размножаться при 40°С) и са⁺ ₂₅ (способность к размножению при 25°С) генетических признаков в течение 5 пассажей в монослойных культурах клеток MDCK при 34°С в присутствии 1-6 мкг/мл трипсина. Проверку этих признаков осуществляли путем параллельного титрования на куриных эмбрионах штаммов вируса гриппа после каждого из пяти пассажей на культуре клеток MDCK. Варианты, полученные после 5 пассажей в клетках MDCK, сохраняли высокую репродуктивность в куриных эмбрионах при оптимальной температуре (34°С), а также бляшкообразующую способность в системе клеток MDCK, свойственную исходным штаммам. Все три штамма на всех пассажах, включая пятый, сохранили способность размножаться при 25°С, т.е. са⁺ ₂₅ признак, и не размножались при 40°С, т.е. сохранили ts^- ₄₀ признак (Таблица 2).

Таблица 2
Сохранение са- и ts-фенотипа реассортантов вируса гриппа в течение 5 последовательных пассажей в культуре клеток MDCK
Штамм вируса гриппа	Номер пассажа	Репродукция вируса в lg ЭИД/мл при
А/47/Шандон/93/1 (H1N1)	40°С	34°С	25°С
1	1,0	9,0	5,0
2	1,0	9,5	5,0
3	<1,0	9,3	4,5
4	1,0	9,5	5,0
5	1,5	10,5	5,5
Аллантоисный вирус	<1,0	9,5	5,5
А/47/Иоганнесбург/94/2 H3N2	1	<1,0	8,8	4,5
2	<1,0	8,5	4,0
3	<1,0	8,5	4,3
4	<1,0	8,3	4,0
5	<1,0	8,7	4,8
Аллантоисный вирус	<1,0	8,7	4,5
В/60/Петербург/95/20	1	<1,0	7,5	3,8
2	<1,0	7,3	3,5
3	<1,0	7,3	3,2
4	<1,0	7,3	3,3
5	<1,0	7,5	3,5
Аллантоисный вирус	<1,0	7,4	3,6

Пример №7. Изучение влияния фермента папаина на культивирование холодоадаптированных вакцинных штаммов вируса гриппа

С целью замены компонентов животного происхождения в технологии получения живой гриппозной вакцины на препараты растительного происхождения проведены исследования по использованию фермента папаин растительного происхождения при наработке штаммов вируса гриппа. Для этого в поддерживающую среду, используемую при культивировании штаммов вируса гриппа, добавляют папаин. Данные приведены в таблице 3.

Таблица 3
Динамика накопления вируса гриппа A/H1N1 в культуре клеток MDCK в присутствии папаина
Концентрация папаина, мкг/мл	Титр вируса в lg ЭИД50/мл
3 сутки	4 сутки
0,25	7,7	7,5
0,5	7,4	7,5
1,0	7,7	6,7
2,0	7,5	7,7
2,5	8,5	8,0
4,0	7,8	7,7
5,0	7,7	7,3
7,5	7,5	6,5
10,0	7,4	6,3
15,0	7,3	7,5
20,0	7,7	6,7
30,0	6,5	6,7
40,0	6,7	6,7
50,0	6,7	6,5
Без папаина (контроль)	6,5	6,7

Анализ таблицы 3 показывает, что при концентрации папаина в поддерживающей среде, равной 0,25-20,0 мкг/мл, титр вируса гриппа на 3-4 сутки культивирования составлял 7,3- 8,5 lg ЭИД₅₀/мл, в то время как в контрольном эксперименте (без введения фермента в поддерживающую среду) титр вируса гриппа был равен 6,5-6,7 lg ЭИД₅₀/мл, что подтверждает эффективность действия указанного фермента.

1. Способ получения живой культуральной вакцины против вируса гриппа, включающий культивирование перевиваемых клеток MDCK в питательной среде, получение вируссодержащей субстанции путем культивирования вакцинных штаммов вируса гриппа в культуре клеток MDCK на этой же питательной среде, очистку вирусной субстанции от балластных примесей, введение в очищенную субстанцию стабилизирующих добавок и сушку готовой формы вакцины, отличающийся тем, что посевная доза перевиваемых клеток MDCK составляет 100-600 тыс. клеток на 1 мл среды, в качестве вирусных штаммов используют вакцинные холодоадаптированные реассортанты штаммов вирусов гриппа с посевной дозой, имеющей множественность заражения 0,01-0,0001 ЭИД₅₀/_КЛ, в качестве питательной среды при культивировании клеток MDCK и штаммов вирусов гриппа на указанных клетках используют бессывороточную питательную среду с добавлением гидролизата сои в концентрации 0,01-10% и протеолитического фермента в количестве 0,25-50,0 мкг/мл до введения посевной дозы штаммов вируса гриппа, а культивирование культур клеток MDCK и холодоадаптированных штаммов вируса гриппа в указанной культуре клеток проводят в суспензии на микроносителях, вносимых в бессывороточную питательную среду в концентрации 1-6 г/л, сбор вируссодержащей жидкости осуществляют после достижения специфической активности вируса гриппа не менее 8,0 lg ЭИД₅₀/мл, а в качестве стабилизирующих добавок, вводимых в очищенную субстанцию перед сушкой, используют сахарозу и пептон из сои в конечной концентрации (5-10) и (3-8) мас.% соответственно.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток MDCK используют культуру, заложенную на хранение при температуре жидкого азота в виде посевного и рабочего банков и аттестованную на отсутствие посторонних вирусов, онкогенную потенцию и видовую идентичность.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве вакцинных холодоадаптированных реассортантов вируса гриппа используют вакцинные штаммы типа A/H3N2; A/H1N1 и типа В этого вируса.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента используют протеолитический фермент растительного происхождения папаин.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микроносителя используют Цитодекс 1.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что удаление балластных примесей из вирусной субстанции осуществляют фильтрованием.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что сушку вакцины осуществляют путем ее замораживания в течение 18 ч при температуре не выше минус 40°С с последующей лиофилизацией в течение 48 ч, причем перед запайкой ампулы с вирусной вакциной заполняют инертным газом, в частности аргоном.