Способ определения антител к капсульному полисахариду haemophilus influenzae типа b
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и касается способа определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b. Сущность изобретения заключается в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae, инкубируют, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 2 табл., 1 ил.
Реферат
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки поствакцинального иммунитета при вакцинации существующими (АКТ-ХИБ) и разрабатываемыми форсифицированными вакцинами.
Haemophilus influenzae типа b (Hib) является наиболее частой причиной бактериальных менингитов, поражающих детей до 6-летнего возраста, особенно детей от 3 до 12 месяцев. При инфицировании этим видом бактерий у человека формируется иммунный ответ к трем основным антигенам: капсульному полисахариду, белкам наружной мембраны и липоолигосахаридам. Капсульный полисахарид - полирибозилрибитолфосфат (ПРФ) - является основой современных вакцинных препаратов. Для формирования Т-клеточного иммунитета его конъюгируют с различными бактериальными белками, такими как столбнячный и дифтерийный анатоксины и др. Для профилактики заболеваний, вызываемых Hib, за рубежом созданы вакцинирующие препараты. Одна из таких вакцин «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), представляющая собой конъюгат ПРФ со столбнячным анатоксином, сертифицирована и разрешена к применению на территории России. Доказана ее высокая эффективность и безопасность. Разрабатываются подобные вакцины и в нашей стране. Для оценки эффективности разрабатываемых отечественных форсифицированных вакцин необходимы тесты, регистрирующие уровень поствакцинального иммунитета.
Известен способ выявления антител к олигосахариду капсульного полисахарида Hib с помощью ИФА. В качестве иммуносорбента используют 96-луночный полистироловый планшет, на котором сорбирован олигосахарид, конъюгированный с альбумином человека [Clin. And Diagn. Labor. Immunol., 1996, Jan., p.84-88]. Анализируемые образцы сывороток титруют с 1:50 в фосфатно-солевом буфере с добавлением твина и ЭДТА. После инкубации и отмывания вносят моноклональный конъюгат. Полученное соединение антиген-антитело-конъюгат проявляют субстратной смесью с последующей детекцией на спектрофотометре. Для калибровочной кривой используют аффинноочищенные антитела.
Однако при использовании иммуносорбента, содержащего альбумин человека, есть вероятность определения аутоантител к нему в анализируемых пробах.
Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности определения антител к капсульному полисахариду H.influenzae за счет использования высокоочищенного полисахарида, не требующего конъюгации, а также за счет использования поликлонального конъюгата, представляющего собой кроличьи антитела против иммуноглобулинов G (H+L) человека, меченные пероксидазой, и калибровочных проб, представляющих собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib.
Для достижения указанного технического результата способ определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b заключается в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. Ед./мл, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 минут, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 минут в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах.
Наличие гуморального иммунитета может быть оценено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе метода лежит иммуносорбент, представляющий собой стрипированный 96-луночный планшет, сорбированный высокоочищенным капсульным полисахаридом Hib, принадлежность которого к ПРФ доказана с помощью ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии и химического анализа, а специфическая активность - в различных серологических тестах.
При выполнении анализа образцы сывороток и калибровочные пробы вносят в лунки иммуносорбента в рабочем разведении. После инкубации и отмывки во все лунки иммуносорбента вносят конъюгат в рабочем разведении. Проявка реакции осуществляется субстратной смесью, содержащей тетраметилбензидин (ТМБ) и перекись водорода.
Калибровочные пробы - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. На их основе строится график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах (см. чертеж).
По калибровочному графику определяют относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых сыворотках крови человека.
Используемые реагенты:
(1) иммуносорбент - планшет полистирольный разборный, состоящий из 128-луночных стрипов, сорбированных капсульным полисахаридом Hib, - 1 шт.;
(2) калибровочные пробы (8) - сыворотки с относительным содержанием IgG антител к ПРФ Hib: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 усл. ед./мл. Каждая проба содержит 0,2 мл раствора, во флаконе;
(3) отрицательный контроль (К-) - сыворотка крови человека, содержащая <0,5 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;
(4) положительный контроль (К+) - сыворотка крови человека, содержащая >2,0 усл. ед./мл, жидкая - 1 фл., 0,1 мл;
(5) конъюгат (КГ) - антитела кроличьи против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, жидкий, концентрированный - 1 фл., 0,2 мл;
(6) субстратная смесь, содержащая тетраметилбензидин (ТМБ) - 1 фл., 12 мл;
(7) промывающий и разводящий фосфатно-солевой буферный раствор, десятикратный концентрат с детергентом (ФСБ-Д)к - 1 фл., 50 мл;
(8) стоп-реагент - 0,9 М H2SO4.
Приготовление растворов для проведения анализа:
1) (ФСБ-Д)к перед применением разводят дистиллированной водой в 10 раз. Полученный раствор ФСБ-Д хранят не более 3 недель при 4-8°С. Раствор предназначен для отмывки планшета от непрореагировавших компонентов, разведения сывороток и конъюгата;
2) контроли (К+ и К-), а также анализируемые сыворотки перед проведением анализа разводят раствором ФСБ-Д до соотношения 1:100 (10 мкл на 1000 мкл ФСБ-Д.) Рабочее разведение сывороток хранению не подлежит;
3) рабочее разведение конъюгата готовят непосредственно перед использованием, разводя исходный раствор до соотношения 1:200 ФСБ-Д (50 мкл на 10 мл ФСБ-Д).
Последовательность операций
Отмывка иммуносорбента. Во все лунки планшета вносят ФСБ-Д в объеме не менее 0,2 мл. Выдерживают планшет при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Содержимое лунок удаляют вытряхиванием. Отмывку повторяют еще 3 раза.
Внесение образцов. В лунки первого ряда планшета последовательно вносят калибровочные пробы №№1-8. Далее последовательно вносят рабочие растворы (1:100) контролей (К+ и К-) в дублях и анализируемые сыворотки. Объем вносимых проб - 100 мкл.
Инкубация. Выдерживают планшет с растворами сывороток в течение 30 мин при 18-22°С.
Отмывка от избытка антител. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и трехкратно отмывают раствором ФСБ-Д, как указано в п.1.
Внесение рабочего раствора конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора КГ.
Инкубация. Как в п.3.
Отмывка от избытка КГ. Как в п.1.
Внесение субстратного раствора ТМБ. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ.
Инкубация. 15-20 мин в темноте при температуре 18-22°С.
В каждую лунку вносят по 50 мкл стоп-реагента.
Учет результатов
Вывести спектрофотометр на нулевой уровень («blank») по воздуху.
Измерить оптическую плотность в лунках планшета при 450 нм в течение 10 минут после остановки реакции.
Построить график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах.
По калибровочному графику определить относительное количество IgG антител к ПРФ Hib в анализируемых пробах.
Пример исследования сывороток детей в возрасте до 3 лет, подвергшихся иммунизации вакциной «АКТ-ХИБ» (Авентис Пастер, Франция), на наличие антител к капсульному полисахариду Hib
№№ п/п | ОП 450 нм | Усл. ед./мл | ||
до иммунизации | через месяц после иммунизации | до иммунизации | через месяц после иммунизации | |
1 | 0,76 | 0,65 | 1,3 | 1,04° |
2 | 0,83 | 0,94 | 1,6 | 1,9* |
3 | 1,02 | 0,55 | 2,3 | 0,8° |
4 | 0,71 | 1,36 | 1,2 | 5,2** |
5 | 0,61 | 0,36 | 0,9 | 0,4° |
6 | 0,55 | 0,56 | 0,8 | 0,8- |
7 | 0,94 | 0,99 | 1,9 | 2,0* |
8 | 0,93 | 1,05 | 1,8 | 2,4* |
9 | 0,27 | 0,70 | 0,3 | 1,2** |
10 | 0,70 | 1,25 | 1,2 | 3,9* |
11 | 0,52 | 0,56 | 0,7 | 0,8* |
12 | 0,65 | 0,86 | 1,0 | 1,6* |
13 | 0,33 | 0,52 | 0,4 | 0,7* |
14 | 0,28 | 1,48 | 0,3 | 6,7** |
15 | 0,34 | 0,75 | 0,4 | 1,3* |
16 | 1,32 | 1,73 | 4,7 | 14,8** |
17 | 0,84 | 1,79 | 1,6 | 17,9** |
Из 17 детей у 13 (*) уровень IgG AT после вакцинации вырос (из них - в 4 и более раз - только у 5 человек (**)). У 3 детей произошло понижение уровня AT после вакцинации (°), а у одного уровень AT не изменился (-).
Пример определения антител капсульному полисахариду в сыворотках вакцинированных детей с помощью набора «Fuller Laboratories» и предложенного способа.
№№ сыворотки | Набор «Fuller» | Предложенный способ | ||
до вакцинациим кг/мл | после вакцинациим кг/мл | до вакцинации усл.ед./мл | после вакцинации усл.ед./мл | |
1 | 0,7 | 21,1 | 1,58 | 1,87 |
2 | 0,5 | 22,4 | 1,2 | 5,17 |
3 | 0,5 | 21,9 | 0,27 | 1,09 |
4 | 0,4 | 21,8 | 1,17 | 3,87 |
5 | 0,4 | 22,6 | 0,28 | 6,68 |
6 | 0,2 | 11,4 | 0,38 | 1,32 |
7 | 1,7 | 22,2 | 4,71 | 14,75 |
8 | 1,6 | 22,4 | 1,6 | 17,88 |
Способ определения антител к капсульному полисахариду Haemophilus influenzae типа b, заключающийся в том, что на твердый носитель с сорбированным на нем высокоочищенным капсульным полисахаридом Haemophilus influenzae типа b наносят рабочие разведения исследуемой и контрольной сывороток, а также калибровочные пробы, представляющие собой сыворотки с относительным содержанием IgG антител к капсульному полисахариду - полирибозилрибитолфосфату Haemophilus influenzae: 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25 и 0 условных единиц/мл, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 мин, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 мин в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител, строят график зависимости оптической плотности от условного количества антител в калибровочных пробах и по графику зависимости определяют количество антител в условных единицах в исследуемых пробах.