Способ введения молекул glp-1

Способ введения молекул glp-1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композиции, применяемой для перорального введения, которая включает соединение глюкагонподобный пептид 1 (GLP-1) и определенные средства для доставки. Пероральное введение композиции может использоваться для лечения диабета 2 типа, а также множества других состояний.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

За последние несколько десятилетий были предприняты многочисленные попытки усовершенствовать лечение сахарного диабета. Примерно 90% людей с диабетом 2 типа, который известен как инсулиннезависимый сахарный диабет (ИНЗСД). При диабете 2 типа в целом сохраняется способность организма вырабатывать инсулин, но инсулин не может эффективно использоваться клетками организма. В основном это связано с тем, что количество инсулина, продуцируемого в ответ на повышение уровня сахара в крови, недостаточно для того, чтобы позволять клеткам эффективно поглощать глюкозу и таким образом снижать уровень сахара в крови.

Множество данных, полученных в доклинических и клинических испытаниях, позволяет считать, что соединения глюкагонподобного пептида-1 (GLP-1) представляют собой очень перспективное средство для лечения диабета 2 типа и ряда других состояний. GLP-1 индуцирует различные биологические эффекты, такие как стимуляция секреции инсулина, ингибирование секреции глюкагона, подавление опорожнения желудка, повышение утилизации глюкозы и индуцирование потери веса. Кроме того, данные доклинических исследований позволяют полагать, что GLP-1 может также действовать в плане предотвращения разрушения β-клеток, что происходит при прогрессировании заболевания. Возможно, наиболее важной характеристикой GLP-1 является его способность стимулировать секрецию инсулина без риска развития гипогликемии, которая имеет место при лечении инсулином или некоторых типов пероральных препаратов, действие которых направлено на повышение экспрессии инсулина.

Однако развитие препаратов на основе GLP-1 представляет чрезвычайную трудность. В основном это связано с нестабильностью пептида в процессе производства в композициях, имеющих вид растворов, и in vivo. Было опубликовано единственное клиническое исследование, в котором использовали GLP-1 соединение для лечения гипергликемии или других состояний с использованием такой композиции на основе соединений GLP-1, которая может быть доставлена путем подкожной инъекции, путем непрерывной подкожной инфузии или путем непрерывного внутривенного введения. Многие пациенты с диабетом 2 типа или пациенты, желающие снизить вес, не хотят проходить курс лечения, который включает несколько инъекций в день. Таким образом, существует потребность в разработке препаратов на основе соединений GLP-1, которые могли бы доставляться альтернативными неинвазивными способами, такими как пероральная доставка.

К сожалению, имеются многочисленные барьеры на пути эффективной пероральной доставки пептидов. Высокое содержание кислоты и широкое распространение пищеварительных ферментов в желудочно-кишечном тракте зачастую приводит к разложению белков и пептидов до того, как они достигнут места всасывания. Кроме того, многие пептиды не могут эффективно пройти через клетки слизистого эпителия в тонком кишечнике для того, чтобы попасть в кровоток. И, наконец, многие лекарственные средства становятся нерастворимыми при низком pH, имеющем место в желудочно-кишечном тракте, и таким образом, они не могут подвергнуться эффективному всасыванию.

Тот факт, что соединения GLP-1 относительно нестабильны в композициях растворов и представляют собой раствор лишь при соблюдении очень узкого диапазона условий, а также обладают относительно коротким периодом полувыведения in vivo, при введении в виде композиции раствора, дает основания полагать, что указанные соединения могут быть эффективно доставлены пероральным способом. Таким образом, представляется удивительным тот факт, что соединения GLP-1 могут быть введены в состав такой композиции, из которой биологически активные молекулы могут всасываться в кровоток после перорального введения.

Настоящее изобретение относится к использования молекул специфического средства для доставки, которое взаимодействует с соединениями GLP-1 нековалентным образом, позволяя соединениям проходить через слизистую кишечника, все еще сохраняя при этом терапевтическую активность. Хотя средства для доставки, используемые в настоящем изобретении, были раскрыты в серии патентов США (см. патенты США NoNo.: 5541155, 5693338, 5976569, 5643957, 5955503, 6100298, 5650386, 5866536, 5965121, 5989539, 6001347, 6071510, 5820881 и 6242495, см. также WO 02/02509, WO 01/51454, WO 01/44199, WO 01/32130, WO 00/59863, WO 00/50386, WO 00/47188 и WO 00/40203), пероральное введение композиций, включающих соединения GLP-1 в сочетании с указанными средствами для доставки, не было раскрыто и не могло быть предположено. Кроме того, многочисленные факторы влияют на способность конкретного класса соединений эффективно доставляться в сочетании с одним или более классами средств для доставки. Так, например, конформация пептида, поверхностный заряд молекулы в определенных условиях композиции, профиль растворимости, стабильность введенного в композицию компонента, чувствительность к расщеплению протеазой и стабильность in vivo- все влияет на способность соединений к пероральной доставке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к разработке новых композиций, включающих соединения GLP-1 и средства доставки, которые могут вводиться перорально. Настоящее изобретение относится к композиции, которая может быть введена перорально, включающей соединение GLP-1 и определенное средство для доставки. Соединение GLP-1 может представлять собой нативный GLP-1, фрагменты GLP-1, аналоги GLP-1, производные нативного GLP-1, фрагментов или аналогов GLP-1, а также эксендин-3 и эксендин-4. Средство для доставки выбирают из средств для доставки, описанных в патентах США NoNo.: 5541155, 5693338, 5976569, 5643957, 5955503, 6100298, 5650386, 5866536, 5965121, 5989539, 6001347, 6071510, 5820881 и 6242495, а также в WO 02/02509, WO 01/51454, WO 01/44199, WO 01/32130, WO 00/59863, WO 00/50386, WO 00/47188 и WO 00/40203.

Предпочтительные соединения GLP-1 представляют собой аналоги или производные аналогов, имеющие модификации в одном или более из указанных положений: 8, 12, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 и 37, и характеризуются повышенной эффективностью в сравнении с Val⁸-GLP-1(7-37)OH. Предпочтительные соединения GLP-1 также раскрыты в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14. Более предпочтительные соединения GLP-1 описаны как соединения SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14.

Предпочтительные средства для доставки приведены в Таблице 1. Более предпочтительные средства для доставки представляют собой средства для доставки, соответствующие номерам соединений в таблице 1, выбранных из группы, состоящей из 1, 2, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 51, 52 и 54.

Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции рецептора GLP-1 у субъекта, при необходимости такой стимуляции, включающему стадию введения субъекту эффективного количества пероральной композиции, описанной в настоящем изобретении. Субъекты, нуждающиеся в стимуляции рецептора GLP-1, включают субъекты с инсулин независимым диабетом и с ожирением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Трехбуквенный код аминокислот, используемый в настоящем описании, соответствует перечню, приведенному в Таблице 3 в Приложении С, в Приложении 2 административной инструкции PCT и соответствует пункту 37 C.F.R. § 1.822 (d)(1)(2000).

Для целей настоящего изобретения в том виде, как оно раскрыто и описано, приведенные в нем термины и сокращения определяются, как указано ниже.

Термин «композиция» в контексте настоящего описания относится к сочетанию соединения GLP-1 и определенного средства для доставки, которое может вводиться перорально, так что соединение GLP-1 проходит через кишечник в системный кровоток и сохраняет способность связываться с рецептором GLP-1 и инициировать цепь сигнальной трансдукции, приводящей к появлению инсулинотропной активности. Композиция может необязательно включать другие средства, при условии, что GLP-1 сохраняет способность связываться с рецептором GLP-1.

Термин «пероральный» в контексте настоящего описания относится к доставке соединений через рот, при которой соединение проходит через желудок, тонкий кишечник или толстый кишечник, попадая в системный кровоток.

Термин «соединение GLP-1» в контексте настоящего описания включает природные полипептиды GLP-1 (GLP-1(7-37)OH и (GLP-1(7-36)NH₂), фрагменты GLP-1, аналоги GLP-1, GLP-1 производные природных GLP-1 полипептидов, фрагментов GLP-1 или аналогов GLP-1, эксендин-3 и эксендин-4, которые обладают способностью связываться с рецептором GLP-1 и инициировать цепь сигнальной трансдукции, приводящей к появлению инсулинотропной активности.

Термин «инсулинотропная активность» в контексте настоящего описания относится к способности стимулировать секрецию инсулина в ответ на повышенный уровень глюкозы, что вызывает повышение поглощения глюкозы клетками и снижение уровня глюкозы в плазме. Инсулинотропная активность может быть определена, например, с использованием способа, описанного в примере 1. Молекула GLP-1 обладает инсулинотропной активностью, если островковые клетки секретируют инсулин в присутствии молекулы GLP-1 на уровне выше фонового.

Термин «ДПП IV-резистентный» в контексте настоящего описания относится к молекулам GLP-1, которые обладают улучшенной метаболической стабильностью и повышенной биологической активностью. Так, например, ДПП IV-резистентность может быть определена с использованием способа, описанного в примере 2. GLP-1-молекула представляет собой ДПП IV-резистентную молекулу, если в присутствии ДПП IV молекула GLP-1 обладает усиленной метаболической стабильностью, превышающей стабильность нативной GLP-1. ДПП IV-резистентные молекулы GLP-1 могут включать изменения аминокислотного состава в сайте распознавания ДПП IV (положение 8) или ДПП IV-резистентные пептиды могут иметь присоединенную группу, которая ограничивает доступность ДПП IV к сайту распознавания, или могут работать оба механизма.

«Фрагмент GLP-1» представляет собой полипептид, полученный после усечения молекулы путем удаления одной или более аминокислот от N-конца и/или С-конца из GLP-1(7-37)OH или его аналога или производного. Используемая для описания GLP-1(7-37)OH номенклатура также применима к фрагментам GLP-1. Например, GLP-1(9-36)OH обозначает фрагмент GLP-1, полученный при вырезании двух аминокислот с N-конца и одной аминокислоты с С-конца. Аминокислоты во фрагменте обозначаются теми же номерами, что и соответствующие аминокислоты в GLP-1(7-37)OH. Так, например, N-концевая глютаминовая кислота в GLP-1(9-37)OH находится в положении 9, положение 12 занято фенилаланином и положение 22 занято глицином, как и в GLP-1(7-37)OH. В случае GLP-1(7-36)OH глицин в положении 37 в GLP-1(7-37)OH удален.

«Аналог GLP-1» характеризуется достаточным уровнем гомологии с GLP-1(7-37)OH или фрагментом GLP-1(7-37)OH, так что указанный аналог обладает инсулинотропной активностью. Предпочтительно, аналог GLP-1 имеет аминокислотную последовательность GLP-1(7-37)OH или его фрагмент, модифицированную таким образом, что одна, две, три, четыре или пять аминокислот отличаются от аминокислот в соответствующих положениях в GLP-1(7-37)OH или во фрагменте GLP-1(7-37)OH. В номенклатуре, используемой для обозначения соединений GLP-1, замещающая аминокислота и ее положение указываются перед исходной структурой. Так, например, Glu²²-GLP-1(7-37)OH обозначает соединение GLP-1, в котором глицин, в норме находящийся в положении 22 в GLP-1(7-37)OH, замещен глютаминовой кислотой; Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH обозначает соединение GLP-1, в котором аланин, в норме находящийся в положении 8, и глицин в норме, находящийся в положении 22 в GLP-1(7-37)OH, заменены валином и глютаминовой кислотой соответственно.

Молекулы GLP-1 также включают полипептиды, в которых одна или более аминокислот добавлены к N-концу и/или С-концу (GLP-1(7-37)OH или к его фрагментам или аналогам. Предпочтительно, чтобы молекулы GLP-1 указанного типа включали примерно до тридцати девяти аминокислот. Аминокислоты в «удлиненной» молекуле GLP-1 обозначаются теми же номерами, что и соответствующая аминокислота в GLP-1(7-37)OH. Так, например, для молекулы GLP-1, получаемой при добавлении двух аминокислот к N-концу GLP-1(7-37)OH, N-концевая аминокислота расположена в положении 5; и в случае молекулы GLP-1, полученной при добавлении одной аминокислоты к С-концу GLP-1(7-37)OH, С-концевая аминокислота расположена в положении 38. Таким образом, положение 12 занято фенилаланином и положение 22 занято глицином в обоих из указанных «удлиненных» соединениях GLP-1, как и в случае GLP-1(7-37)OH. Предпочтительно, аминокислоты 1-6 в удлиненной молекуле GLP-1 одинаковы или включают консервативное замещение аминокислоты в соответствующем положении GLP-1(7-37)OH. Аминокислоты GLP-1 38-45 в удлиненной молекуле GLP-1 предпочтительно одинаковы или включают консервативное замещение аминокислоты в соответствующем положении глюкагона или эксендина-4.

Термин «производное GLP-1» относится к молекуле, имеющей аминокислотную последовательность GLP-1, фрагмента GLP-1 или аналога GLP-1, но включающей дополнительно химическую модификацию одной или более группах боковых аминокислот, атомов α-углерода, концевой аминогруппы или концевой карбоксильной группы. Химическая модификация включает, не ограничиваясь приведенным перечнем, добавление химических фрагментов, создание новых связей и удаление химических фрагментов. Модификации групп боковых аминокислот включают, не ограничиваясь приведенным списком, ацилирование ε-аминогрупп лизина, N-алкилирование аргинина, гистидина или лизина, алкилирование карбоновых групп глютаминовой или аспарагиновой кислот, и деаминирование глютамина или аспарагина. Модификации концевой аминогруппы включает, не ограничиваясь приведенным списком, модификацию дезамино-группы, N-низшего алкила, N-ди-низшего алкила и N-ацила. Модификации концевой карбоксигруппы включают, не ограничиваясь приведенным списком, модификацию амида, низшего алкиламида, диалкиламида и низшего сложного алкильного эфира. Низший алкил представляет собой С₁-С₄ алкил. Кроме того, одна или более боковых групп или концевых групп могут быть защищены защитными группами, известными специалистам в области белковой химии; α-углерод аминокислоты может быть моно- или ди-метилированным.

Для целей настоящего изобретения используют тест in vitro на выявление сигнального GLP-1 рецептора, позволяющий определить, проявляет ли удлиненный GLP-1 пептид инсулинотропную активность in vivo. Удлиненные GLP-1 пептиды, описанные в настоящем изобретении, обладают эффективностью in vitro, которая составляет не менее чем одна десятая от эффективности in vitro ДПП IV-резистентного аналога GLP-1, известного как Val⁸-GLP-1(7-37)OH. Более предпочтительно, удлиненные GLP-1 пептиды по настоящему изобретению являются столь же эффективными или более эффективными, чем Val⁸-GLP-1(7-37)OH.

Термин "эффективность in vitro» в контексте настоящего описания обозначает меру способности пептида активировать рецептор GLP-1 в клеточном тесте. Эффективность in vitro выражается в виде показателя ЭК₅₀, который представляет собой эффективную концентрацию соединения, которая приводит к достижению 50% активности в однократном эксперименте по определению зависимости доза-реакция. Для целей настоящего описания эффективность in vitro определяют с помощью флюоресцентного теста, в котором используют клетки HEK-293 Aurora CRE-BLAM, которые стабильно экспрессируют человеческий рецептор GLP-1. Указанные клетки включают стабильно интегрированный в них ДНК-вектор, содержащий реагирующий на цАМФ элемент (GRE), который направляет экспрессию гена β-лактамазы (BLAM). Взаимодействие агониста GLP-1 с рецептором инициирует сигнал, который приводит к активации элемента, реагирующего на цАМФ, и к последующей экспрессии β-лактамазы. Субстрат β-лактамазы CCF2/AM, который вызывает флюоресценцию при расщеплении β-лактамазы (Aurora Biosciences Corp.), может быть затем добавлен к клеткам, который подвергались воздействию определенного количества агониста GLP-1, для измерения агонистской эффективности GLP-1. Тест описан также Злокарником с соавт. (Zlokarnik, et al., (1998) Science 279:84-88), см. также пример 1. Значения параметров ЭК₅₀ для соединений, перечисленных в примере 1, определяют с помощью описанного выше теста на β-лактамазу (BLAM-теста) путем построения кривой зависимости доза-реакция с использованием разбавлений в диапазоне от 0,00003 наномоля до 30 наномоля. Относительные значения эффективности in vitro устанавливают, сравнивая с данными для Val⁸-GLP-1(7-37)OH как контроля и полагая значение контроля, равным 1.

Термин «средство для доставки» относится к молекулам, описанным в патентах США No. 5541155, 5693338, 5976569, 5643957, 5955503, 6100298, 5650386, 5866536, 5965121, 5989539, 6001347, 6071510, 5820881 и 6242495, а также в WO 02/02509, WO 01/51454, WO 01/44199, WO 01/32130, WO 00/59863, WO 00/50386, WO 00/47188 и WO 00/40203. Средства для доставки обычно получают из аминокислот и используют в пероральных композициях согласно настоящему изобретению. Полученные аминокислоты могут также иметь вид полиаминокислот и пептидов. Аминокислота представляет собой любую карбоновую кислоту, содержащую по меньшей мере одну свободную аминогруппу, и включает природные и синтетические аминокислоты. Полиаминокислоты представляют собой либо пептиды, либо две или более аминокислот, соединенных связью, образованной другими группами, которые могут быть соединены, например, сложноэфирной и ангидридной связью. Пептиды представляют собой две или более аминокислот, соединенных пептидной связью. Пептиды могут варьировать по длине, охватывая широкий диапазон от дипептидов из двух аминокислот до полипептидов, включающих несколько сотен аминокислот. Предпочтительные пептиды включают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и пентапептиды.

Кроме того, средства для доставки по настоящему изобретению могут быть необязательно представлены солевой формой. Примеры солей включают натриевые соли, соли хлористоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, сульфат, фосфат, хлорид, бромид, иодид, ацетат, пропионат, соль бромистоводородной кислоты, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония и карбонат калия.

Различные пероральные композиции по настоящему изобретению могут необязательно включать фармацевтически приемлемый буфер. Примеры фармацевтически приемлемых буферов включают фосфатные буферы, такие как двуосновной фосфат натрия, ТРИС, глицилглицин, малеат, ацетат натрия, цитрат натрия, тартрат натрия, или аминокислоту, такую как глицин, гистидин, лизин или аргинин. Другие фармацевтически приемлемые буферы также известны в данной области техники. Предпочтительно, буфер выбирают из группы, состоящей из фосфата, ТРИС, малеата и глицина. Еще более предпочтительным буфером является ТРИС.

Предпочтительная концентрация ТРИС буфера составляет от 1 мМ до 100 мМ. Еще более предпочтительная концентрация составляет от примерно 10 мМ до примерно 50 мМ и наиболее предпочтительная концентрация буфера составляет 20 мМ.

Значение pH в пероральной композиции доводят до достижения стабильности и приемлемого для перорального введения состояния. Предпочтительно, pH доводят до значения от примерно 7,0 до примерно 9,0, более предпочтительно, pH составляет от примерно 7,4 до примерно 8,4. Еще более предпочтительно, pH составляет от примерно 7,8 до примерно 8,4. Наиболее предпочтительно, pH имеет значение от 7,8 до 8,1.

Различные пероральные композиции по настоящему изобретению могут необязательно включать средство, способствующее суспендированию. Некоторые средства для доставки требуют наличия средства для суспендирования в связи со свойственными им характеристиками растворимости. Примером средства, способствующего суспендированию, является гидроксипропилметилцеллюлоза. Предпочтительно, конечная концентрация гидроксипропилметилцеллюлозы составляет от примерно 2% до примерно 10% (вес./об.). Еще более предпочтительно, концентрация составляет от примерно 2% до примерно 5% (вес./об.). Наиболее предпочтительно, концентрация составляет около 3,9% (вес/объем).

Пероральные композиции по настоящему изобретению могут необязательно включать сорастворитель. В случае некоторых средств для доставки требуется наличие сорастворителей в связи со свойственными им характеристиками растворимости. Примеры сорастворителей включают этанол, N-метилпирролидон, N,N-диметилацетамид, N,N-диметилформамид, гликофурол, этоксидиол, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль 300 и поливинилпирролидон. Предпочтительно, конечная концентрация сорастворителей составляет от примерно 5 об.% до примерно 30 об.%. Еще более предпочтительно, концентрация составляет от примерно 10 об.% до примерно 25 об.%. Наиболее предпочтительно, концентрация составляет примерно 20 об.%.

Пероральные композиции по настоящему изобретению могут необязательно включать консервант. Консервант представляет собой соединение, которое добавляют к композиции и которое действует как противомикробный агент. Среди известных в технике эффективных и приемлемых для введения в парентеральные композиции консервантов следует отметить фенольные консерванты, алкилпарабены, бензиловый спирт, хлорбутанол, резорцинол и другие аналогичные консерванты и различные их смеси. Примеры фенольных консервантов включают крезолы и фенолы или смесь крезолов и фенола. Примеры крезолов включают мета-крезол, орто-крезол, пара-крезол, хлорокрезол или их смеси. Термин «алкилпарабены» относится к С₁-С₄ алкилпарабенам или их смесям. Примеры алкилпарабенов включают метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен и бутилпарабен. Концентрации их должны быть достаточны для поддержания эффективности консерванта в плане задержки микробного роста. Предпочтительно, консервант представляет собой фенольное производное. Более предпочтительно, консервант представляет собой крезол. Еще более предпочтительно, консервант представляет собой мета-крезол.

Предпочтительная концентрация консерванта в готовой смеси составляет примерно от 1,0 мг/мл до примерно 20,0 мг/мл. Более предпочтительные диапазоны концентрации консерванта в готовой смеси составляют от примерно 2,0 мг/мл до примерно 8,0 мг/мл, от 2,5 мг/мл до примерно 4,5 мг/мл и от примерно 2,0 мг/мл до примерно 4,0 мг/мл. Наиболее предпочтительная концентрация консерванта составляет примерно 3,0 мг/мл.

Пероральные композиции по настоящему изобретению могут необязательно включать средства, способствующие поддержанию изотоничности. Средства, способствующие поддержанию изотоничности, представляют собой соединения, которые являются физиологически толерантными и придают определенный тонус композиции для предупреждения прохода жидкости через клеточные мембраны. Примеры таких соединений включают глицерин, соли, например NaCl, и сахара, например декстрозу, маннит и сахарозу. Указанные соединения обычно используют для таких целей в известных концентрациях. Могут быть добавлены одно или более средств, способствующие поддержанию изотоничности, для доведения до нужного уровня ионной силы или тонуса. Предпочтительное средство, способствующее поддержанию изотоничности, представляет собой NaCl. Концентрация NaCl составляет предпочтительно примерно от 10 мМ до 200 мМ, более предпочтительно, составляет примерно от 50 мМ до 150 мМ и наиболее предпочтительно, составляет примерно 100 мМ.

Альтернативно, введение композиций может осуществляться в виде твердой формы, такой как таблетка, капсула или препарат из частиц, такой как порошок. Твердые дозированные формы могут быть приготовлены путем смешивания твердой формы соединения с твердой формой активного средства. Альтернативно, твердая форма может быть получена из раствора соединения и активного средства с помощью известных в данной области методов, таких как лиофильная сушка, осаждение, кристаллизация и диспергирование в твердом состоянии.

Соединения GLP-1, подходящие для использования по настоящему изобретению

Соединения GLP-1 по настоящему изобретению могут быть приготовлены с помощью большого числа методов, известных в данной области, таких как методы химии твердофазного синтеза, выделения и очистки молекул GLP-1 из природных источников, технология на основе рекомбинантной ДНК или сочетание указанных методов. Например, методы получения пептидов GLP-1 описаны в патентах США NoNo. 5118666, 5120712, 5512549, 5977071 и 6191102.

По принятым в данной области правилам, аминоконцу в GLP-1(7-37)ОН присваивается номер 7 и карбоксильному концу присваивается номер 37. Другие аминокислоты в полипептиде нумеруются последовательно, как показано в SEQ ID No:1. Например, положение 12 занято фенилаланином и положение 22 занято глицином.

Два природных усеченных пептида GLP-1 описываются формулой I, как показано на SEQ ID: NO:1:

His⁷-Ala-Glu-Gly¹⁰-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu²⁰-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala²⁵-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly³⁵-Arg-Xaa³⁷

Формула I, SEQ ID NO:1,

где Xaa³⁷ обозначает Gly или -NH_2.

Предпочтительно, соединение GLP-1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или модифицированную таким образом, что она отличается по одной, двум, трем, четырем или пяти аминокислотам от SEQ ID: NO:1.

Предпочтительная группа соединений GLP-1 состоит из аналогов GLP-1 формулы I (SEQ ID: NO:2).

His-Xaa⁸-Xaa⁹-Gly-Xaa¹¹-Phe-Thr-Xaa¹⁴-Asp-Xaa¹⁶-Xaa¹⁷-Xaa¹⁸-Xaa¹⁹-Xaa²⁰-Xaa²¹-Xaa²²-Xaa²³-Xaa²⁴-Xaa²⁵-Xaa²⁶-Xaa²⁷-Phe-Ile-Xaa³⁰-Xaa³¹-Xaa³²-Xaa³³-Xaa³⁴-Xaa³⁵-Xaa³⁶-Xaa³⁷-Xaa³⁸-Xaa³⁹-Xaa⁴⁰-Xaa⁴¹-Xaa⁴²-Xaa⁴³-Xaa⁴⁴-Xaa⁴⁵.

Формула I (SEQ ID: NO:2),

где Xaa⁸ обозначает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;

Xaa⁹ обозначает Glu, Asp или Lys;

Xaa¹¹ обозначает Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;

Xaa¹⁴ обозначает Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;

Xaa¹⁶ обозначает Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp или Lys;

Xaa¹⁷ обозначает Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;

Xaa¹⁸ обозначает Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr или Lys;

Xaa¹⁹ обозначает Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gln или Lys;

Xaa²⁰ обозначает Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr, или Lys;

Xaa²¹ обозначает Glu, Asp или Lys;

Xaa²² обозначает Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;

Xaa²³ обозначает Gln, Asn, Arg, Glu, Asp или Lys;

Xaa²⁴ обозначает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp или Lys;

Xaa²⁵ обозначает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;

Xaa²⁶ обозначает Lys, Arg, Gln, Glu, Asp, или His;

Xaa²⁷ обозначает Leu, Glu, Asp или Lys;

Xaa³⁰ обозначает Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;

Xaa³¹ обозначает Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp или Lys;

Xaa³² обозначает Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;

Xaa³³ обозначает Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp или Lys;

Xaa³⁴ обозначает Asn, Lys, Arg, Glu, Asp или His;

Xaa³⁵ обозначает Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys;

Xaa³⁶ обозначает Gly, Arg, Lys, Glu, Asp или His;

Xaa³⁷ обозначает Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp или Lys, или делетирован;

Xaa³⁸ обозначает Ser, Arg, Lys, Glu, Asp или His, или делетирован;

Xaa³⁹ обозначает Ser, Arg, Lys, Glu, Asp или His или делетирован;

Xaa⁴⁰ обозначает Gly, Asp, Glu или Lys или делетирован;

Xaa⁴¹ обозначает Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp или Lys или делетирован;

Xaa⁴² обозначает Ser, Pro, Lys, Glu или Asp или делетирован;

Xaa⁴³ обозначает Ser, Pro, Glu, Asp или Lys или делетирован;

Xaa⁴⁴ обозначает Gly, Pro, Glu, Asp или Lys или делетирован и

Xaa⁴⁵ обозначает Ala, Ser, Val, Glu, Asp или Lys, Ala-NH₂, Ser-NH₂, Val-NH₂, Glu-NH₂, Asp-NH₂ или Lys-NH₂ или делетирован;

при условии, что если аминокислота в положениях 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44 делетирована, то аминокислота ниже по ходу транскрипции от данной аминокислоты также делетирована.

Предпочтительно, чтобы соединения GLP-1 содержали меньше шести аминокислот, которые отличаются от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)ОН или в эксендине-4. Более предпочтительно, чтобы соединение GLP-1 формулы I содержало меньше пяти аминокислот, которые отличаются от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)ОН или в эксендине-4. Еще более предпочтительно, чтобы меньше четырех аминокислот отличалось от соответствующей аминокислоты в GLP-1(7-37)ОН или в эксендине-4.

Соединения GLP-1 по настоящему изобретению включают производные формулы I, такие как С1-6-сложный эфир или его амид или С-1-6-алкиламид или С-1-6-диалкиламид. Документ WO 99/43706, в котором описываются производные соединений GLP-1 формулы I, включен в настоящее описание в качестве ссылки. Соединения формулы I были дериватизированы, как описано в WO 99/43706, и удаление дериватизирующих группировок также входит в область настоящего изобретения.

Другая предпочтительная группа соединений GLP-1 состоит из аналогов GLP-1 формулы II (SEQ ID NO:3):

Xaa⁷-Xaa⁸-Xaa⁹-Gly-Xaa¹¹-Xaa¹²-Thr-Ser-Asp-Xaa¹⁶-Ser-Xaa¹⁸-Xaa¹⁹-Leu-Glu-Gly-Xaa²³-Xaa²⁴-Ala-Xaa²⁶-Xaa²⁷-Phe-Ile-Xaa³⁰-Xaa³¹-Leu-Xaa³³-Xaa³⁴-Xaa³⁵-Xaa³⁶-R³⁷

Формула II (SEQ ID NO:3),

где Xaa⁷ обозначает L-гистидин, D-гистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин или α-метилгистидин;

Xaa⁸ обозначает Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser или Thr;

Xaa⁹ обозначает Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu или His;

Xaa¹¹ обозначает Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys или His;

Xaa¹² обозначает His, Trp, Phe или Tyr;

Xaa¹⁶ обозначает Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Tyr, Glu или Ala;

Xaa¹⁸ обозначает His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala или Lys;

Xaa¹⁹ обозначает Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg или Cys;

Xaa²³ обозначает His, Asp, Lys, Glu, Gln или Arg;

Xaa²⁴ обозначает Glu, Arg, Ala или Lys;

Xaa²⁶ обозначает Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu или His;

Xaa²⁷ обозначает Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg или Lys;

Xaa³⁰ обозначает Ala, Glu, Asp, Ser или His;

Xaa³¹ обозначает Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp или Lys;

Xaa³³ обозначает Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly или Glu;

Xaa³⁴ обозначает Glu, Lys или Asp;

Xaa³⁵ обозначает Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His или Glu;

Xaa³⁶ обозначает Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu или His;

R³⁷ обозначает Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro или делетирован.

Другая предпочтительная группа соединений GLP-1 состоит из аналогов GLP-1 формулы III (SEQ ID NO: 4):

Xaa⁷-Xaa⁸-Glu-Gly-Xaa¹¹-Xaa¹²-Thr-Ser-Asp-Xaa¹⁶-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa²²-Xaa²³-Xaa²⁴-Xaa²⁵-Lys-Xaa²⁷-Phe-Ile-Xaa³⁰-Trp-Leu-Xaa³³-Xaa³⁴-Xaa³⁵-Xaa³⁶-R³⁷

Формула III (SEQ ID NO:4),

где Xaa⁷ обозначает L-гистидин, D-гистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин или α-метилгистидин;

Xaa⁸ обозначает Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser или Thr;

Xaa¹¹ обозначает Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys или His;

Xaa¹² обозначает His, Trp, Phe или Tyr;

Xaa¹⁶ обозначает Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu или Ala;

Xaa²² обозначает Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg или Cys;

Xaa²³ обозначает His, Asp, Lys, Glu или Gln;

Xaa²⁴ обозначает Glu, His, Ala или Lys;

Xaa²⁵ обозначает Asp, Lys, Glu или His;

Xaa²⁷ обозначает Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg или Lys;

Xaa³⁰ обозначает Ala, Glu, Asp, Ser или His;

Xaa³³ обозначает Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly или Glu;

Xaa³⁴ обозначает Glu, Lys или Asp;

Xaa³⁵ обозначает Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His или Glu;

Xaa³⁶ обозначает Arg, Glu или His;

R³⁷ обозначает Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro или делетирован.

Другая предпочтительная группа GLP-1 соединений состоит из аналогов GLP-1 формулы IV (SEQ ID NO: 5):

Xaa⁷-Xaa⁸-Glu-Gly-Thr-Xaa¹²-Thr-Ser-Asp-Xaa¹⁶-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa²²-Xaa²³-Ala-Ala-Xaa²⁶-Glu-Phe-Ile-Xaa³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa³⁵-Arg-R³⁷.

Формула IV (SEQ ID NO:5),

где Xaa⁷ обозначает L-гистидин, D-гистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин или α-метилгистидин;

Xaa⁸ обозначает Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Met или Thr;

Xaa¹² обозначает His, Trp, Phe или Tyr;

Xaa¹⁶ обозначает Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu или Ala;

Xaa²² обозначает Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg или Cys;

Xaa²³ обозначает His, Asp, Lys, Glu или Gln;

Xaa²⁶ обозначает Asp, Lys, Glu или His;

Xaa³⁰ обозначает Ala, Glu, Asp, Ser или His;

Xaa³⁵ обозначает Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His или Glu;

R³⁷ обозначает Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro или делетирован.

Другая предпочтительная группа соединений GLP-1 состоит из аналогов GLP-1 формулы V (SEQ ID NO: 6):

Xaa⁷-Xaa⁸-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa²²-Xaa²³-Xaa²⁴-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Xaa³⁰-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R³⁷

Формула V (SEQ ID NO:6),

где Xaa⁷ обозначает L-гистидин, D-гистидин, дезаминогистидин, 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин или α-метилгистидин;

Xaa⁸ обозначает Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser или Thr;

Xaa²² обозначает Gly, Asp, Glu, Gln, Asn, Lys, Arg или Cys;

Xaa²³ обозначает His, Asp, Lys, Glu или Gln;

Xaa²⁴ обозначает Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg или Lys;

Xaa³⁰ обозначает Ala, Glu, Asp, Ser или His;

R³⁷ обозначает Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro или делетирован.

Предпочтительные соединения GLP-1 формул I, II, III, IV и V включают аналоги GLP-1 или фрагменты аналогов GLP-1, причем указанные аналоги или их фрагменты включают аминокислоту, отличную от аланина в положении 8 (аналоги по положению 8). Предпочтительно, чтобы аналоги по указанному положению 8 содержали одно или более дополнительных изменений в положениях 9, 11, 12, 16, 18, 22, 23, 24, 26, 27, 30, 31, 33, 34, 35, 36 и 37 в сравнении с соответствующей аминокислотой в нативном GLP-1(7-37)OH. Предпочтительно также, чтобы указанные аналоги имели 6 или менее замен в сравнении с соответствующими аминокислотами в нативном GLP-1(7-37)OH или GLP-1(7-36)OH. Более предпочтительные аналоги содержат 5 или менее замен в сравнении с соответствующими аминокислотами в нативном GLP-(7-37)OH или GLP-1(7-36)OH или содержат 4 или менее замен в сравнении с соответствующими аминокислотами в нативном GLP-1(7-37)OH или GLP-1(7-36)OH. Еще более предпочтительно, чтобы указанные аналоги имели 3 или менее замен в сравнении с соответствующими аминокислотами в нативном GLP-1(7-37)OH или GLP-1(7-36)OH. Наиболее предпочтительно, чтобы указанные аналоги имели 2 или менее замен в сравнении с соответствующими аминокислотами в нативном GLP-1(7-37)OH.

Предпочтительные GLP-1 соединения формул II, III, IV и V включают аналоги GLP-1 или фрагменты аналогов GLP-1, в которых глицин в положении 22 и предпочтительно аланин в положении 8 замещены другой аминокислотой.

В том случае, когда положение 22 занято аспарагиновой кислотой, глютаминовой кислотой, аргинином или лизином, положение 8 представляет собой предпочтительно глицин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин или метионин и более предпочтительно валин или глицин. В том случае, когда положение 22 занято сульфоновой кислотой, такой как цистеиновая кислота, положение 8 представляет собой предпочтительно глицин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин или метионин и более предпочтительно валин или глицин.

Другие предпочтительные соединения GLP-1 включают аналоги GLP-1 формулы IV (SEQ ID NO: 5), причем указанные аналоги имеют последовательность GLP-1(7-37)OH, за исключением того, что аминокислота в положении 8 представляет собой предпочтительно глицин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин или метионин и более предпочтительно валин или глицин, и положение 30 занято глютаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой, серином, гистидином и более предпочтительно, глютаминовой кислотой.

Другие предпочтительные соединения GLP-1 включают аналоги GLP-1 формулы IV (SEQ ID NO: 5), причем указанные аналоги имеют последовательность GLP-1(7-37)OH, за исключением того, что аминокислота в положении 8 представляет собой предпочтительно глицин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин или метионин и более предпочтительно, валин или глицин, и положение 37 занято гистидином, лизином, аргинином, треонином, серином, глютаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой, триптофаном, тирозином, фенилаланином и более предпочтительно, гистидином.

Другие предпочтительные соединения GLP-1 включают аналоги GLP-1 формулы IV (SEQ ID NO:5), причем указанные аналоги имеют последовательность GLP-1(7-37)ОН, за исключением того, что аминокислота в положении 8 представляет собой предпочтительно глицин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин или метионин и более предпочтительно валин или глицин, и положение 22 занято глютаминовой кислотой, лизином, аспарагиновой кислотой или аргинином и более предпочтительно глютаминовой кислотой или лизином, и положение 23 занято лизином, аргинином, глютаминовой кислотой, аспарагиновой кислотой и гистидином и более предпочтительно лизином или глютаминовой кислотой.

Другие предпочтительные соединения GLP-1 включают аналоги GLP-1 формулы V (SEQ ID NO:6), причем указанные аналоги имеют последовательность GLP-1(7-37)ОН,