Штамм гриба arthrobotrys longa вкпм f-942 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при лечении тромбозов. Штамм гриба Arthrobotrys longa ВКПМ F-942 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов и может быть использован в качестве продуцента лонголитина. Изобретение позволяет повысить выход лонголитина. 2 табл.

Реферат

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может найти применение при лечении тромбозов.

Известен штамм гриба Arthrobotrys longa Mecht №1 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов (авторское свидетельство СССР №745943, кл. С12N 1/14, опубл. 1980) [1].

Однако активность лонголитина в получаемом из культуральной жидкости ферментном препарате низкая, недостаточная для обеспечения возможности его промышленного использования.

Известен штамм гриба Arthrobotrys longa Mecht №2 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов (патент RU №2182596, кл. С12N 1/14, опубл. 2002) [2].

Этот известный штамм является наиболее близким аналогом предлагаемого штамма гриба.

Однако фибринолитическая и тромболитическая активности комплекса ферментов, содержащегося в культуральной жидкости этого известного штамма гриба, недостаточно высоки для того, чтобы использовать его в качестве продуцента в промышленных условиях.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является обеспечение возможности повышения фибринолитической и тромболитической активностей лонголитина.

Данный технический результат достигается тем, что продуцентом лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов - является новый штамм гриба Arthrobotrys longa Mecht №3 (Longopharm №1), ВКПМ F-942.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1. Мицелий известного [2] штамма гриба Arthrobotrys longa Mecht №2 выращивают в пробирках на косяках питательной агаризованной среды Чапека следующего состава, г/л: KH2PO4 - 0,9-1,1; NaNO3 - 2,9-3,1; KCl - 0,4-0,5; MgSO4×7H2O - 0,4-0,5; сахароза - 24-26; вода водопроводная - остальное.

Затем проводят глубинное культивирование гриба в 2 этапа: выращивание посевного мицелия и проведение собственно биосинтеза лонголитина.

Посевной мицелий выращивают 36-40 часов в жидкой питательной среде, содержащей, г/л: K2HPO4 - 2,0-2,4; NaNO3 - 9,3-9,8; KNO3 - 1,15-1,35; сахароза - 18-20; вода водопроводная - остальное.

Биосинтез комплекса ферментов проводят в течение 120-144 часов на среде того же состава с увеличенной 2 раза концентрацией исходных компонентов в качалочных колбах объемом 750 мл с 200 мл питательной среды при температуре 26-28°С.

Из полученной культуральной жидкости клетки осаждают центрифугированием. Из полученного центрифугата культуральной жидкости высаживают лонголитин двумя объемами охлажденного до - 20°С ацетона при температуре 4°С.

Осадок отделяют на мембранном фильтре и сушат под вакуумом.

Для определения фибринолитической активности (ФА) 15 мг полученного осадка (препарата лонголитина) растворяют в 1 мл физиологического раствора. Приготовленный раствор наносят в объеме 0,03 мл на непрогретые и на прогретые при 86°С фибриновые пластины. Способность к активации плазминогена (АА) определяют по разности зон лизиса на непрогретых и на прогретых пластинах полимерного фибрина.

За единицу ФА принимают зону лизиса в 10 мм2 стандартной фибриновой пластины (к 9 мл бычьего 0,3% фибриногена добавляют 0,2 мл тромбина с концентрацией 2 мг/мл), которая образуется за 5-6 час при температуре 37°С после нанесения 1 мл раствора лонголитина, содержащего 15 мг сухого препарата лонголитина.

Установлено, что у исходного известного [2] штамма гриба Arthrobortrys longa Mecht №2 площадь зон лизиса на непрогретых пластинах равна 400-600 мм2 (ФА). АА составляет 25-50% от ФА. Из этого следует, что активность лонголитина у известного [2] штамма Arthrobortrys longa Mecht №2 в единицах активности составляет около 16500 единиц ФА.

Пример 2. Для получения нового штамма в стерильные пластиковые пробирки объемом 1,5 мл наливают по 1 мл полученной культуральной жидкости известного [2] штамма гриба Arthrobortrys longa Mecht №2, содержащей 105 клеток/мл. Пробирки герметично закрывают и передают на обработку гамма-лучами.

Обработку гамма-лучами ведут, поместив приготовленные пробирки с культуральной жидкостью на различном расстоянии от источника. Все пробирки обрабатывают в течение одинакового промежутка времени. Поглощенную дозу рассчитывают по данным счетчика Гейгера в каждой точке расположения пробы.

После облучения клетки высевают на чашки Петри и проверяют их жизнеспособность. В таблице 1 указано усредненное количество выживших клеток в пробирке после обработки содержащейся в ней культуральной жидкости исходного штамма гриба Arthrobortrys longa Mecht №2 различными дозами гамма-облучения.

Таблица 1
Количество выживших клеток после обработки культуральной жидкости исходного штамма Arthrobortrys longa Mecht №2 различными дозами гамма-облучения.
№ образцаДоза экспозиционная (кРад)Усредненное количество выживших клеток в 1-й облученной пробирке
110105
240104
380103
4120102
52005
63000

Как видно из таблицы 1, критической величиной является поглощенная доза 300 кРад, после получения которой клетки погибают.

Отбирают 1000 колоний клеток, выживших после получения поглощенной дозы 200 кРад, и проверяют их на активность лонголитина. Для этого колонии рассевают на отдельные чашки Петри и затем подращивают в 800 мл жидкой среды в колбах объемом 2 л. После выращивания в течение 120-144 часов клетки осаждают центрифугированием, из приготовленного центрифугата культуральной жидкости выделяют лонглитин, определяют его фибринолитическую (ФА) и активаторную активность (АА).

Результаты проверки представлены в таблице 2.

Таблица 2
Фибринолитическая (ФА) и активаторная активность (АА) лонголитина, выделенного из культуральной жидкости нового мутантного штамма гриба Arthrobortrys longa Mecht №3 (Longopharm №1), ВКПМ F-942
№ образцаКоличество проверенных клоновАктивность лонголитина в мм2 зоны лизиса
ФибринолитическаяАктиваторная
1756200-400120-200
2173200-400120-200
361300-500180-300
418600-800250-400
521000-1200450-600

Как видно из таблицы 2, фибринолитическая и активаторная активность лонголитина, содержащегося в культуральной жидкости двух выделенных клонов клеток, выживших при поглощенной дозе 200 кРад, в 3 раза выше, чем эта активность исходного штамма Arthrobotrys longa Mecht №2.

Эти клоны отобрали и использовали для дальнейшего фенотипирования.

Новый мутантный штамм гриба, названный авторами Arthrobortrys longa Mecht №3 (Longopharm №1), при росте на среде Чапека образует широкорастущие ворсистые колонии с интенсивной оранжево-розовой пигментацией, которая увеличивается с возрастом колонии. Макроконидиальное спороношение отсутствует. Обратная сторона колоний желтоватая. Наблюдается обильное образование микроконидий на вегетативных гифах. При росте на сусло-агаре состава: сусло с базовым левовращающим градусом (БЛГ) 5° (показатель сахаристости сусла по рефрактометру), агар-агар - 20 г/л интенсивность окраски ворсистой розоватой колонии с возрастом увеличивается в центре. В центре колонии с возрастом образуются более высокие выросты - столоны - слабоветвящиеся мицелиальные тяжи. Обратная сторона колоний с радиальными складками, коричневая.

Культуральные признаки. При росте в погруженной культуре в колбах на качалке, имеющей 240 об/мин при температуре 26-28°С в течение 144-168 час на сусле (4° БЛГ) и на синтетической среде, содержащей, г/л: K2HPO4 - 4,2-4,4; NaNo3 - 18-20; KNO3 - 2,2-2,8; сахароза - 20-40; вода водопроводная - остальное, наблюдается образование одноклеточных микроконидий величиной 4-6 мкм. Микроконидии образуются непосредственно на гифах вегетативного мицелия. Культуральная жидкость имеет вид разбавленного водой молока, плохо фильтруется, пигментов во внешнюю среду не выделяет. Ортимум рН роста в глубинной культуре 6,5. Гриб растет на простой синтетической среде, не требует добавления витаминов и факторов роста.

Лоноголитин, выделяемый новым штаммом, чувствителен к 4-(2-аминоэтил)бензен сульфонилфлуорид гидрохлориду, который в концентрации 16 микромолей полностью ингибирует его активность. Что доказывает принадлежность этого комплекса ферментов, продуцируемого новым штаммом Arthrobortrys longa, к сериновому типу протеаз. Новый мутантный штамм Arthrobortrys longa синтезирует лонголитин с активностью 36300 единиц ФА. Известный [2] исходный штамм при культивировании в тех же условиях синтезирует лонголитин с активностью около 16500 единиц ФА. Лонголитин, синтезируемый новым штаммом, сохраняет способность к активации плазминогена, присущую известному [2] штамму.

Новый мутантный штамм гриба Arthrobortrys longa Mecht №3 (Longopharm №1) синтезирует лонголитин в количестве 6-10 г на 1 л культурального фильтрата. Для сравнения: исходный штамм [2] гриба Arthrobortrys longa Mecht №2 при культивировании в этих же условиях накапливает лонголитин в количестве 2-4 г на 1 л культарального фильтрата.

Новый штамм гриба хранится в коллекции микроорганизмов Общества с ограниченной ответственностью «Лонгофарм» под авторским названием Arthrobotrys longa Mecht №3 (Longopharm №1). Он депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИгенетика под названием Arthrobotrys longa ВКПМ F-942.

Таким образом, новый мутантный штамм гриба Arthrobortrys longa Mecht №3 (Longopharm №1), ВКПМ F-942 обеспечивает получение лонголитина с повышенной ферментативной активностью, что позволит использовать его в промышленных условиях.

Штамм гриба Arthrobotrys longa ВКПМ F-942 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов.