Ассоциация микроорганизмов sulfobacillus olympiadicus, ferroplasma acidiphilum, leptospirillum ferrooxidans для окисления сульфидного золотосодержащего концентрата

Ассоциация микроорганизмов sulfobacillus olympiadicus, ferroplasma acidiphilum, leptospirillum ferrooxidans для окисления сульфидного золотосодержащего концентрата

Реферат

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Может быть использовано в биогидрометаллургической технологии извлечения золота, а именно при промышленной переработке сложных сульфидных концентратов, преимущественно на месторождениях с рудами, содержащими пирротин, арсенопирит, пирит, антимонит.

Известно использование умеренно термофильных микроорганизмов в способах переработки золотомышьяковых сульфидных руд в ЮАР, Австралии, Гане, Китае и США.

Известен и ряд ацидофильных ассоциаций умеренно термофильных микроорганизмов, выделенных из промышленных реакторов на операции бактериального окисления рудных концентратов по технологии т.н. биовыщелачивания. В частности, в ЮАР и Австралии отмечается присутствие в пульпах Acidithiobacillus caldus и Leptospirillum ferrooxidans [D.E.Rawlings, N.J.Coram, M.N.Garduer and S.M.Deane. Thiobacillus caldus and Leptospirillum ferrooxidans are widely distributed in continuous flow biooxidation tanks used to treat variety of metal containing ores and concentrate. In: Biohydrometallurgy and the Environment toward the Mining of the 21^st century. (R.Amils, A.Ballester, Eds.), Part A. IBS, 1999, Elsevier, p.777-786], [J.Nicolette Coram-Uliana, Robert P. van Hille, William J.Kohr, Susan T.L.Harrison. Development of Method to Assay the Microbial Population in Heap Bioleaching operation. In: Proc. 16th Intern. Biohydromet. Symp. (S.T.L. Harrison, D.E.Rawlings and J.Petersen, Eds.), Cape Town, 25-29 Sept. 2005. p.647-656], [D.E.Rawlings, H. Tributsch and G.S.Hansford. Reasons rather than Thiobacillus ferrooxidans are the dominant iron-oxidizing bacteria in many commercial processes for the biooxidation of pyrite and related ores. Microbiology, 1999, v.145, p.5-13], [Биогеотехнология металлов. Практическое руководство. М., 1989, c.11-28].

Недостатком известных микроорганизмов и ассоциаций является недостаточная активность при окислении концентратов, содержащих пирротин, арсенопирит, пирит, антимонит.

Известна железосульфоокисляющая ацидофильная ассоциация бактерий Thiobacillus ferrooxidans, Leptospirillium ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans, Ferroplasma acidiphilum [Патент РФ 2256712. Способ переработки первичных золотосульфидных руд].

Недостатком известной ассоциации является нестабильность ее состава в условиях динамической многофакторной системы, включающей химические, биологические и физические параметры и взаимозависимые характеристики рудного концентрата и микроорганизмов, что обусловливает снижение уровня ее активности.

Задачей изобретения является выделение ассоциации умеренно термофильных микроорганизмов, характеризующихся стабильностью, способствующей повышению ее активности.

Задача решена выделением из рабочих промышленных реакторов естественной ассоциации микроорганизмов Sulfobacillus olympiadicus sp.nov., S-5, депонированных Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН ВКМ В-2420 D, архей Ferroplasma acidiphilum, Y-9, депонированных Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН ВКМ В-2421 D, архей Ferroplasma acidiphilum Y-10, депонированных Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН ВКМ В-2422 D, Leptospirillum ferrooxidans L-5, депонированных Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН ВКМ В-2423 D, для окисления сульфидных золотосодержащих концентратов при соотношении S-5 60-80%, Y-9, Y-10 10-20%, L-5 10-20%. Свидетельство о депонировании №12310 от 10.07.06 Всероссийской коллекцией микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.Н.Скрябина РАН, 142240, г.Пущино, Московской области, пр. Науки, 5.

Кроме того, выделены микроскопические грибы Aspergillus niger A-5 естественного происхождения, не участвующие непосредственно в процессе окисления сульфидного золотосодержащего концентрата.

Технический результат изобретения заключается в выделении из рабочих промышленных реакторов золотоизвлекательной фабрики новых естественных, сформировавшихся в течение технологического процесса штаммов микроорганизмов Sulfobacillus olympiadicus sp.nov., S-5, архей Ferroplasma acidiphilum, Y-9 и Y-10, Leptospirillum ferrooxidans L-5, что способствует повышению стабильности ассоциации в условиях непостоянства биолого-физико-химического равновесия среды и, в итоге, повышению ее активности.

Технический результат заключается также в сочетании железоокисляющих, сероокисляющих и сульфидоокисляющих свойств микроорганизмов ассоциации, проявляющихся одновременно при окислении всех сульфидных соединений промышленного рудного концентрата вследствие выявленного количественного соотношения штаммов, что также способствует повышению активности ассоциации.

Умеренно термофильные бактерии Sulfobacillus olympiadicus sp.nov., штамм S-5, археи Ferroplasma acidiphilum, штамм Y-9 и Y-10 и Leptospirillum ferrooxidans, L-5 выделены из пульпы реакторов бактериального окисления золотосодержащих концентратов Олимпиадинской золотоизвлекательной фабрики.

Определены таксономический статус и основные характеристики бактерии.

Sulfobacillus olympiadicus sp.nov., штамм S-5 имеет следующие характеристики. Это грамположительная бактерия.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, с закругленными концами. Размер клеток 0,7-0,8×1,75-2,0 мкм. Часто образуют цепочки из четырех клеток. Перетрих. Образуют споры. Клетки имеют слизистую капсулу.

Культуральные признаки.

На питательной минеральной среде образуют помутнение и появление оранжевого цвета среды за счет окисления закисного железа в окисное.

Физиолого-биохимические свойства.

Получают энергию за счет окисления закисного железа, сульфидных минералов и восстановленных соединений серы. Аэроб. Конструктивный обмен миксотрофный, то есть наряду с автотрофной фиксацией углекислоты нуждаются в небольших добавках органических веществ (например, дрожжевого экстракта в концентрации 0,02%). При росте на среде с закисным железом, дополненной 0,02% дрожжевого экстракта, минимальное время генерации составляет 1,3 часа. Рост на элементной сере поддерживается - только в присутствии 1 мМ закисного железа. На тиосульфате и тетратионате рост не поддерживается. Автотрофный рост не наблюдается. В присутствии закисного железа наблюдается рост на фруктозе, глюкозе, сахарозе, серине, d-аспарагине, янтарной и лимонной кислотах только в первом пассаже. Исключение составляет восстановленный глутатион, который поддерживает рост S.olympiadicus S-5 в присутствии закисного железа в течение пяти пассажей. В отсутствии железа данный штамм не растет ни на одном из перечисленных субстратов, включая и дрожжевой экстракт.

Рост бактерий и окисление неорганических субстратов происходит в диапазоне температур 15-55°С. Температурный оптимум составляет 45°С. Оптимальное значение рН при росте S.olympiadicus, S-5 на закисном железе и сульфидных минералах 1,8-1,9. При этих значениях рН за 10 часов культивирования на закисном железе достигается и максимальная скорость окисления железа. Пределы рН в процессе окисления Fe²⁺ и сульфидных концентратов составляют 1,5-2,45.

Молекулярно-биологические характеристики.

Содержание ГЦ оснований в ДНК - 48,9 мол. %. По нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК наиболее близок к Sulfobacillus thermotolerans и образует с ним единый кластер. Однако уровень гибридизации между ними составляет всего 35%, что в совокупности с их физиологическими различиями подтверждает правомочность выделения обнаруженного штамма в отдельный вид. Результаты рестрикционного анализа хромосомной ДНК с последующим разделением фрагментов методом пульс-электрофореза также подтвердилии уникальность данного штамма (табл.1).

Ferroplasma acidiphilum, штаммы Y-9 и Y-10, имеют следующие характеристики. Это грамотрицательная архея.

Морфологические признаки.

Клетки имеют неправильную округлую форму, полиморфны. Часть клеток образуют колонии в виде гроздьев. Клеточная стенка отсутствует. Поверхность клеток покрыта слизистым материалом. Размножаются равномерным делением и почкованием.

Культуральные признаки.

На жидкой среде, содержащей минеральные соли азота, фосфора, а также ионы магния, калия и закисное железо в концентрации 4 г/л и дополненной 0,02% дрожжевого экстракта, образуется помутнение и побурение среды за счет окисления закисного железа в окисное.

Физиолого-биохимические свойства.

Хемолитоавтотрофы. Нуждаются в дрожжевом экстракте как факторе роста. Энергию получают за счет окисления закисного железа и сульфидных минералов в их смеси в концентрате, в качестве источника углерода используют СО₂ атмосферы. На чистых сульфидных минералах не растут. Рост на элементной сере, тетратионате и тиосульфате не наблюдается. Наблюдается рост в диапазоне температур 15-50°С. Температурный оптимум для роста штаммов Y-9 и Y-10 составляет соответственно 39 и 42-45°С. Данные штаммы растут в диапазоне рН 1,0-2,5, при оптимальном значении рН 1,7-1,8. Содержание ГЦ оснований в ДНК - 35,9 мол.% у штамма Y-9 и 36,1 мол.% у штамма Y-10. ДНК штаммов Y-9 и Y-10 имеют 98 и 99% гомологии с типовым штаммом Ferroplasma acidiphilum, Y 1^T соответственно. Между собой эти штаммы имеют также высокий процент гибридизации - 97%. По данным рестрикционного анализа хромосомной ДНК каждый штамм имеет свои специфические особенности, и их следует рассматривать как отдельные штаммы, принадлежащие к Ferroplasma acidiphilum (табл.1).

Leptospirillum ferrooxidans, штамм L-5 имеет следующие характеристики. Это грамотрицательная бактерия.

Морфологические признаки.

Клетки обладают полиморфизмом. В стадии лагфазы и экспоненциального роста клетки имеют форму вибрионов с размером клеток 0,3-0,6×1,0 мкм, в стационарную фазу роста клетки выглядят как спириллы с размером клеток 0,6×3,5 мкм. Кроме того, наблюдаются туго скрученные вибрионы с почти сомкнутыми концами - псевдококки. Обладают одним полярным жгутиком. Размножаются делением.

Культуральные признаки.

На жидкой минеральной среде с содержанием закисного железа 2,5-3,0 г/л наблюдается побурение среды за счет окисления закисного железа в окисное.

Физиолого-биохимические свойства.

Хемолитоавтотроф, аэроб. В качестве источника энергии используют закисное железо и сульфидные минералы. Элементную серу, тиосульфат и тетратионат не окисляют. Источником углерода служит СО₂ атмосферы. Растут в диапазоне температур от 15 до 40°С. Оптимальная температура роста - 35-37°С. Рост наблюдается при значениях рН 1,1-2,2 с оптимальным значением рН 1,5.

Молекулярно-биологические характеристики

Содержание ГЦ оснований в ДНК - 51,3 мол.%, т.е. близок к типовому штамму (50,6%). Рестрикционный профиль хромосомной ДНК отличается от других штаммов, что свидетельствует о его штаммовой специфичности (табл.1).

Из гетеротрофных микроорганизмов выделены микроскопические грибы рода Aspergillus, развивающиеся при рН 2,0-3,0 и при температуре 28-40°С.

При лабораторных условиях их количество в пульпе распределяется в соотношении:

S.olympiddicus (S-5) 60-80%

F.acidiphilum (Y-9, Y-10) 10-17%

L.ferrooxidans (L-5) 10-20%.

Таблица 1
Размер фрагментов ДНК, расщепленной эндонуклеазами рестрикции и проанализированной методом пульс-электрофореза, у микроорганизмов ассоциации (в m.п.н.)
Номер фрагмента от линии старта	x)Sulfobacillus olympiadicus S-5	xx)Leptospirillum ferrooxidans L-5	xxx)Ferroplasma acidiphilum Y-9	xxx)Ferropiasma acidiphilum Y-10	xx)Acidithiobacillus ferrooxidans	xx)Acidithiobacillus thiooxidans 4
1	143	167	138	202	159	203
2	137	151	131	126	148	182
3	114	135	126	100	138	176
4	99	129	121	92	133	125
5	97	116	114		126	107
6	94	111	111		117	75
7	74	91	104		112	55
8	68	85	95		105
9	63	77	90		93
10	56	74	70		86
11	52	68	61		81
12	50	62	58		76
13	46	59	50		70
14	-	56	41		66
15	-	-	-		60
Примечание: эндонуклеазы рестрикции: х) - NotI; xx) - XbaI; xxx) - XhoI

Aspergillus niger, штамм А-5 имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки.

Аналогичны штаммам, описанным в литературе: Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Определитель. Киев: Наукова Думка. 1988.

Культуральные признаки.

Аспергиллы отличаются широкой метаболической активностью и адаптивной способностью использовать множество разнообразных органических соединений, не метаболизируемых другими организмами (в том числе топливо, резина, краски, лаки, пластмассы, руды, камень, бетон и др.), но не способны окислять неорганические источники энергии и поэтому не участвуют в процессе окисления сульфидного золотосодержащего концентрата. В лабораторных условиях их количество в пульпе не превышает 0,002%. Гриб устойчив к повышенным концентрациям тяжелых металлов (сурьма, мышьяк и др.). Для этого вида считаются токсичными следующие концентрации солей тяжелых металлов:

CaCl₂ - 1,2 мг/л; ртуть металлическая - 0,1 мг/л; NiCl₂ - 0,9 мг/л; NiSO₂×6H₂O - 0,4 мг/л; Pb(NO₃)₂ - 0,007 М.

Штамм А-5 отличается от известных ранее по следующим признакам:

1. по устойчивости к мышьяку в концентрации 5-7 г/л;

2. по устойчивости к сурьме в концентрации 2-4 г/л;

3. по способности к росту при рН 1,8-2,0;

4. по способности к росту при 40°С (отдельные изоляты способны расти при 40-50°С).

Описанные ранее штаммы А.niger являются мезофилами и растут при рН не ниже 2,0.

Знание структуры хромосомной ДНК (табл.1) позволяет вести мониторинг штаммов, входящих в состав ассоциации.

Пример 1.

Эксперименты проведены в колбах на 500 мл с 200 мл среды на качалке (150 об/мин) при температуре 39°С.

Варианты опыта:

1. Ассоциация хемолитотрофов без дополнительного внесения органического вещества: среда 9К с Fe²⁺ (2.0 г/л), тиосульфатом (следы), рН 1,8-2,0. Присутствуют сульфобациллы, лептоспириллы и ферроплазмы.

2. Ассоциация хемолитотрофов без дополнительного внесения органического вещества: среда 9К с грибной биомассой, образующей легкоусваиваемые сульфобациллами и ферроплазмами органические вещества (инокулят 1% по объему), Fe²⁺ (2.0 г/л), тиосульфатом (следы), рН 1,8-2,0. Присутствуют все члены ассоциации.

3. Ассоциация хемолитотрофов без дополнительного внесения органического вещества в миксотрофных условиях: среда 9К с дрожжевым экстрактом, Fe²⁺ (2.0 г/л), тиосульфатом (следы), рН 1,8-2,0, Присутствуют все члены ассоциации.

Из данных таблицы 2 видно, что за все время опыта в течение 7 суток скорость окисления Fe²⁺ ассоциацией была более высокой в присутствии всех членов ассоциации и грибов в качестве источника легкоусваиваемых органических веществ.

Таблица 2
Окисление Fe2+ ассоциацией микроорганизмов в разных условиях
Сутки	Количество окисленного Fe2+ (г/л) за сутки	Общее количество клеток в 1 мл
Варианты	Варианты
1	2	3	1	2	3
1	-	0.4	-	106	106	106
2	-	0.2	-	106	106	107
3	0.6	1.0	-	106	106	107
4	0.9	1.5	0.3	106	106	107
5	1.0	1.6	0.4	106	107	107
6	1.4	1.6	0.8	106	107	107
7	0.9	2.0	1.4	106	107	107

Таблица 3
Степень окисления сульфидных минералов ассоциацией микроорганизмов промышленного рудного концентрата
Микроорганизмы	Степень окисления, % в течение 10 суток
Арсенопирит	Пирит + пирротин	S сульфидов
1. Ferroplasma acidiphilum, Y-10х)	68,4	49,5	50,7
2. Sulfobacillus olympiadicus, S-5x)	85,3	61,5	62,0
3. Ferroplasma acidiphilum, Y-9, Y-10 + Sulfobacillus olympiadicus, S-5 + Leptospirillum ferrooxidans L-5	94,6-95,8	61,5	62,3
4. Контроль без микроорганизмов	17,1	15,7	17,0
х) + дрожжевой экстракт

Пример 2.

Эксперименты проведены в колбах Эрленмейера на 500 мл с 200 мл среды с плотностью пульпы 5% на качалке со скоростью 150 об/мин при температуре 39°С, рН 1,8 и добавлении 0,02% дрожжевого экстракта или грибов. Продолжительность опыта - 10 суток.

Результаты анализов твердой фазы представлены в таблице 3.

Очевидно, что ассоциацией микроорганизмов сульфидные минералы, как, например, арсенопирит окисляются более полно (94,6-95,8%). Пирит и пирротин окисляются одинаково как сульфобациллами, так и всей ассоциацией. Роль других членов ассоциации (лептоспириллы и ферроплазмы) в реальной пульпе связана с окислением Fe²⁺ и поддержанием высокого окислительно-восстановительного потенциала пульпы, а также с образованием ростовых факторов, в которых нуждаются сульфобациллы и археи. Серная часть сульфидов окисляется до H₂SO₄ и S°.

Химическое окисление сульфидных минералов без микроорганизмов в пульпе происходит слабо (табл.3).

Пример 3.

Окисление сульфидных минералов происходит ассоциацией микроорганизмов в плотной пульпе в промышленных реакторах при рН 2,1-1,6 и температуре 38-40°С. Общее число клеток микроорганизмов в ассоциации 4,26×10⁹ в 1 мл. Основные члены ассоциации представлены в соотношении:

S.olympiadicus, S-5	- 70%
F.acidiphilum, Y-9 и Y-10	- 20%
L.ferrooxidans, L-5	- 10%

Степень окисления сульфидных минералов в пульпе представлена в таблице 4.

Таблица 4
Степень окисления сульфидных минералов в пульпе
Месяцы	Степень окисления, % (средняя за месяц)
FeAsS	FeS+FeS2	Сера сульфидная, Ss
Октябрь	91,44	86,22	83,56
Ноябрь	93,6	90,45	74,5
Декабрь	92,0	91,6	85,5

Характеристики и свойства выделенной ассоциации микроорганизмов способствуют повышению ее стабильности, активности, расширению биотехнологических возможностей при промышленном освоении сульфидных золотосодержащих концентратов, содержащих пирротин, арсенопирит, пирит, антимонит.

Ассоциация микроорганизмов, состоящая из Sulfobacillus olympiadicus ВКМ В-2420 D 60-80%, архей Ferroplasma acidiphilum BKM B-2421 D и архей Ferroplasma acidiphilum ВКМ В-2422 D 10-20%, Leptospirillum ferrooxidans ВКМ В-2423 D 10-20% для окисления сульфидного золотосодержащего концентрата.