Фрагмент fr316 митохондриального гена nd1, предназначенный для выявления возбудителей описторхоза

Фрагмент fr316 митохондриального гена nd1, предназначенный для выявления возбудителей описторхоза

Реферат

Изобретение относится к паразитологии, медицине и биотехнологии и может быть использовано для обнаружения возбудителей описторхоза Opisthorchis felineus и видоспецифической идентификации методом молекулярной гибридизации этого патогенного представителя семейства Opisthorchiidae.

Известные на настоящее время три первичные последовательности ДНК гена парамиозина (РМ) Opisthorchis felineus (1) не пригодны для идентификации этого вида молекулярно-генетическими лабораторными методами, так как данные о молекулярной структуре этого гена для других представителей семейства Opisthorchiidae отсутствуют и поэтому невозможно надежное и воспроизводимое выявление паразита без риска ложных положительных результатов.

Известные на настоящее время две первичные последовательности ДНК фрагмента митохондриального гена цитохром оксидазы 1 (СОХ1) Opisthorchis felineus (2) малопригодны для идентификации этого вида и различения его от других видов гельмитов семейства Opisthorchiidae, поскольку их количества недостаточно для представления внутривидового полиморфизма по первичной последовательности этого фрагмента, относящегося к классу высоковариабельных генетических маркеров, и поэтому не позволяют разработать видоспецифические зонды или праймеры для точного и чувствительного выявления этого паразита молекулярно-генетическими лабораторными методами.

Известные на настоящее время 6 первичных последовательностей ДНК фрагмента первого транскрибируемого спэйсера в рибосомальном кластере (ITS1) (3, 4, 5) также малопригодны для идентификации этого вида и различения его от других видов гельмитов семейства Opisthorchiidae. Во-первых, шести последовательностей недостаточно для приемлемого отражения внутривидового полиморфизма по первичной последовательности этого фрагмента, относящегося к классу средневариабельных генетических маркеров. Во-вторых, биогеографические данные для образцов в карточках указаны с недостаточной точностью (для пяти - «/country="Russia: Western Siberia"» и для одного «/country="Russia: Western Siberia, Novosibirsk"») и поэтому не позволяют разработать видоспецифические зонды или праймеры для надежного и воспроизводимого выявления этого паразита молекулярно-генетическими лабораторными методами на всех территориях обитания паразита.

Технической задачей изобретения является установление нуклеотидной последовательности фрагмента митохондриального гена NADH-дегидрогеназы (ND1), предназначенного для выявления возбудителей описторхоза.

Поставленная техническая задача достигается получением нуклеотидной последовательности фрагмента fr316 митохондриального гена ND1 Opisthorchis felineus, содержащей участки-мишени для идентификации гельмитов данного вида. В известных источниках информации последовательность гена ND1 Opisthorchis felineus не представлена.

Для получения фрагмента fr316 митохондриального гена ND1 выделяют тотальную ДНК из одной метацеркарии Opisthorchis felineus и производят ПЦР со специфическими праймерами ND1-Fw и ND1-Rv со следующим термопрофилем: стадия денатурации - 94°C, 2 мин; 26 циклов из шага 94°C, 30 сек, шага 57°C, 1 мин и шага 72°C, 1 мин 45 сек, стадия достройки - 72°C, 5 мин. Затем 1 мкл продукта реакции используют для амплификации с праймерами JB11 и NDeRv со следующим термопрофилем: стадия денатурации - 94°C, 2 мин; 29 циклов из шага 94°C, 30 сек, шага 55°C, 1 мин и шага 72°C, 45 сек, стадия достройки - 72°C, 5 мин. В результате ПЦР с указанными праймерами получается продукт размером около 530 пн.

Структура использованных праймеров:

ND1-Fw: 5'-TGGGT-GTTCT-GCGAG-CATT-3'

ND1-Rv: 5'-AGGAA-GAGTA-GCACG-AGCCC-A-3'

JB-11: 5'-AGATT-CGTAA-GGGGC-CTAAT-A-3'

NDeRv: 5'-AAATG-GAACG-TTACA-ATACT-CAG-3'

Полученные ПЦР-продукты очищают переосаждением полиэтиленгликолем и этанолом и затем используют для проведения реакции секвенирования с последующим разделением продуктов реакции на приборах ABI310A или ABI3100 фирмы Applied Biosystems. Реакции секвенирования для каждого образца ДНК проводят с двух сторон с использованием праймеров JB11 и NDeRv.

Было просеквенировано 22 индивидуальных последовательности размером около 530 пн. для образцов Opisthorchis felineus из четырех географических точек: р.Обь, г.Новосибирск, Новосибирская обл. (8 образцов); р.Сайма, г.Сургут, Ханты-Мансийский автономный округ (2 образца); р.Иртыш, г.Ханты-Мансийск, Ханты-Мансийский автономный округ (2 образца); р.Шеркалка, с.Шеркалы, Ханты-Мансийский автономный округ (10 образцов).

В результате проверки этих индивидуальных последовательностей амплифицированного фрагмента митохондриального гена ND1 Opisthorchis felineus размером около 530 пн. по критериям надежности идентификации каждой нуклеотидной позиции был выделен фрагмент меньшего размера - 316 пн, обозначенный O_fel_316_ND1, в котором каждая нуклеотидная позиция определена с высоким качеством. В результате такой тщательной проверки качества определения нуклеотидной последовательности была выведена консенсусная последовательность фрагмента O_fel_316_ND1, показанная в SEQ ID NO 1:

gtttrttyca gagatttgck gayttrctya agttggttgt gaagtttaag 50

gttastttwt ttcargtgcg tagstgrtty ggytgrttrg gkgtrwtytt 100

rttggttttt ttrkcttgtt gytattgtyt gatrttttst ttgtcccayg 150

atggsggkkg ygrttctgtg ttrcttctyt ggytgcttyt rgtwacyagg 200

ttgactggtt atagkgtttt gagkgtgggy tgrggttctt ataaaaagtt 250

tgctytagta agmtgtgtgc gttctgcttt tggttctgtt acmtttgarg 300

cttgctttat gtgtat 316

Обозначения вырожденных позиций приведены в соответствии со Стандартом 25 ВОИС по представлению перечней последовательностей нуклеотидов и аминокислот в патентных заявках.

Вырожденные позиции (k, m, r, s, w, y) означают, что в отдельных индивидуальных последовательностях фрагмента митохондриального гена ND1 Opisthorchis felineus был обнаружен или тот или иной указанный нуклеотид, т.е. по этой позиции был обнаружен однонуклеотидный полиморфизм, присущий этому фрагменту у этого вида. Выявление участков с полиморфными позициями позволило исключить эти участки как кандидаты на участки-мишени для точной, надежной и воспроизводимой видоспецифической идентификации Opisthorchis felineus.

Чтобы определить участки-мишени с такими свойствами, для полученной консенсусной последовательности фрагмента O_fel_316_ND1 был проведен сравнительный анализ с привлечением соответствующих фрагментов для других видов рода Opisthorchis и семейства Opisthorchiidae (Opisthorchis viverrini, Clonorchis sinensis, Metorchis bilis) как просеквенированных заявителем, так и опубликованных в GenBank (6; 7; 8; 9).

В результате двухэтапного сравнительного анализа внутривидового и межвидового разнообразия структуры нуклеотидной последовательности фрагмента O_fel_316_ND1 было намечено несколько участков-мишеней для видоспецифической идентификации Opisthorchis felineus, приведенных в следующих примерах.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Конструирование праймеров для O_fel_316_ND1-специфической ПЦР.

Нуклеотидная последовательность O_fel_316_ND1 фрагмента 316 митохондриального гена ND1 Opisthorchis felineus была использована для конструирования праймеров для O_fel_316_ND1-специфической ПЦР. Конструирование праймеров проводили с помощью интернет-доступной компьютерной программы Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi). В результате выбраны следующие последовательности праймеров:

Pr_O_fel_316_ND1_Left (левый праймер) -

TTGGTTGTGAAGTTTAAGGTTAGTTTA

Pr_O_fel_316_ND1_Right (правый праймер) -

CCTCAAAGGTAACAGAACCAAAA

Характеристики праймеров:

Праймер	Длина	Температура плавления (С°)	G/C состав (%)	Значение самокомплементарности	Значение самокомплементарности в 3'-области
Pr_O_fel_316_ND1_Left	27	58.80	29.63	4.00	3.00
Pr_O_fel_316_ND1_Right	23	59.56	39.13	3.00	0.00

Выравнивание последовательностей фрагментов fr316 митохондриальных генов ND1 Opisthorchis felineus и Clonorchis sinensis демонстрирует, что праймеры Pr_O_fel_316_ND1_Left и Pr_O_fel_316_ND1_Right могут быть использованы для O_fel_316_ND1-специфической ПЦР.

Пример 2. Конструирование зондов для выявления ДНК Opisthorchis felineus методом молекулярной гибридизации.

Нуклеотидная последовательность O_fel_316_ND1 фрагмента fr316 митохондриального гена ND1 была использована для конструирования зондов для выявления ДНК Opisthorchis felineus методом молекулярной гибридизации. Конструирование зондов проводили с помощью интернет-доступной компьютерной программы Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi). В результате выбраны следующие последовательности зондов:

Hyb_O_fel_316_ND1_32

GTTGGTTGTGAAGTTTAAGGTTAGTTTATTTCAAGT

Hyb_O_fel_316_ND1_234

GGTTCTTATAAAAAGTTTGCTCTAGTAAGCTGTGTG

Характеристики зондов:

Зонд	Длина	Температура плавления (С°)	G/C состав (%)	Значение самокомплементарности
Hyb_O_fel_316_ND1_32	36	65.87	30.56	3.00
Hyb_O_fel_316_ND1_234	36	66.52	36.11	4.00

Выравнивание последовательностей фрагментов fr316 митохондриальных генов ND1 Opisthorchis felineus и Clonorchis sinensis демонстрирует, что зонды Hyb_O_fel_316_ND1_32 и Hyb_O_fel_316_ND1_234 могут быть использованы для выявления ДНК Opisthorchis felineus методом молекулярной гибридизации.

Таким образом, фрагмент O_fel_316_ND1 митохондриального гена ND1, а также видоспецифические праймеры и зонды могут быть использованы для выявления возбудителей описторхоза и дифференциального распознавания ДНК представителей семейства Opisthorchiidae для исследований в фундаментальной и прикладной паразитологии и медицине. Кроме того, данный фрагмент, видоспецифические праймеры и зонды могут быть использованы в биотехнологии для создания ДНК-диагностикумов.

Изобретение может использоваться для совершенствования схемы выявления возбудителей описторхоза.

Источники информации

1. Shustov A.V., Kotelkin A.T., Sorokin A.V., Ternovoi V.A., Loktev V.B. The Opisthorchis felineus paramyosin: cDNA sequence and characterization of its recombinant fragment // Parasitol Res.; 2002, V.88, N.8, P.724-730. (GenBank entries AF311774, AF311775, AHO 10489).

2. Di V.U., Morozova O.V. and Fedorov K.P. 2006, // GenBank entry DQ469316. GenBank entry DQ469317. Unpublished.

3. Morozova O.V. and Di V.U. 2006, // GenBank entry DQ456826. GenBank entry DQ456827. GenBank entry DQ456828. Unpublished.

4. Di V.U., Fedorov K.P. and Morozova O.V. 2006, // GenBank entry DQ456831. Unpublished.

5. Morozova O.V., Di V.U., Fedorov K.P. 2006, // GenBank entry DQ456829. GenBank entry DQ456830. Unpublished.

6. Le T.H., Van De N., Blair D., Sithithawom P. and McManus D.P. Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini: Development of a mitochondrial-based multiplex PCR for their identification and discrimination // Exp.Parasitol., 2006, 112 (2), 109-114// GenBank entry DQ116944. GenBank entry DQ119551.

7. Lee S.U., Park H.Y. and Huh S. 2001 Nucleotide sequence of the nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 1 (ND1) from Clonorchis sinensis // GenBank entry AF229851. Unpublished.

8. Ngo T.H., Nguyen V.C., Nguyen B.N., Trieu N.T., Bui V.T. and Le T.H. 2006. // GenBank entry DQ882172. GenBank entry DQ882173. Unpublished.

9. Le T.H. and Nguyen V.D. 2006. // GenBank entry DQ882174. GenBank entry DQ882175. Unpublished.

Фрагмент fr316 митохондриального гена ND1, выделенный из ДНК Opisthorchis felineus и имеющий установленную нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID 1, предназначенный для выявления возбудителей описторхоза.