Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококков с повышенной вирулентностью

Полипептидные вакцины для широкой защиты против рядов поколений менингококков с повышенной вирулентностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Все приведенные в настоящем описании документы полностью включены в него в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области иммунологии и вакцинологии. В частности, оно относится к антигенам из Neisseria meningitidis (менингококка) и их применению при иммунизации.

Уровень техники

N. meningitidis представляет собой неподвижный, грамотрицательный человеческий патоген, который колонизирует глотку и вызывает менингит (и, изредка, септицемию в отсутствие менингита). Он вызывает и эндемическое, и эпидемическое заболевание. После внедрения конъюгированной вакцины против Haemophilus influenzae, N. meningitidis представляет собой основную причину бактериального менингита в США.

На основании капсулярного полисахарида организма были идентифицированы различные серогруппы N. meningitidis. Серогруппа А представляет собой патоген, чаще всего вызывающий эпидемическую заболеваемость в Африке южнее Сахары. Серогруппы В и С ответственны за огромное количество случаев в США и в большинстве развитых стран. Серогруппы W135 и Y ответственны за остальные случаи в США и развитых странах. После серогруппы классификация включает серотип, сероподтип, а затем иммунотип и в стандартной номенклатуре перечисляется серогруппа, серотип, сероподтип и иммунотип, каждый из которых отделен двоеточием, например, B:4:P1.15:L3,7,9. В пределах серогруппы В некоторые ряды поколений вызывают заболевание часто (сверхинвазивные), некоторые ряды (последовательности) поколений вызывают более тяжелые формы заболевания, чем другие (сверхвирулентные), а другие вообще редко вызывают заболевание. Признаны 7 сверхвирулентных рядов поколений, а именно, подгруппы I, III и IV-1, комплекс ЕТ-5, комплекс ЕТ-37, кластер А4 и ряд поколений 3. Они были определены многолокусным ферментным электрофорезом (MLEE), но многолокусное типирование последовательностей (MLST) также использовалось для классификации менингококков (ссылка 1).

Полисахаридная вакцина против серогрупп А, С, W135 и Y была известна в течение многих лет [2,3], но получить вакцину против серогруппы В оказалось невозможным. Были испытаны вакцины на основе пузырьков наружной оболочки (например, см. ссылку 4), но защита, обеспечиваемая этими вакцинами, обычно ограничена штаммом, используемым для изготовления вакцины. Поэтому остается потребность в широко эффективной вакцине против серогруппы В.

Сообщалось о геномных последовательностях для менингококковых серогрупп А [5] и В [6,7], и последовательность серогруппы В исследовали для идентификации антигенов вакцины (например, ссылки 8-13). Перспективными антигенами манипулировали для улучшения гетерологичной экспрессии (ссылки 14-16).

Задачей изобретения является получение дополнительных и улучшенных композиций для обеспечения иммунитета против менингококкового заболевания и/или инфекции и, в частности, для обеспечения широкого иммунитета против менингококка серогруппы В.

Раскрытие изобретения

Вакцины против патогенов, таких как вирус гепатита В (HBV), возбудителей дифтерии и столбняка, содержат один белковый антиген (например, поверхностный антиген HBV, или столбнячный токсоид). Напротив, бесклеточные вакцины против коклюша обычно содержат, по меньшей мере, 3 белка B.pertussis, а пневмококковая вакцина Prevenar^TM содержит 7 отдельных конъюгированных сахаридных антигенов. Другие вакцины, такие как клеточная вакцина против коклюша, вакцина против кори, инактивированная вакцина против полиомиелита (IPV) и менингококковые OMV вакцины по происхождению представляют собой сложные смеси большого числа антигенов.

Поэтому то, может ли защита против инфекции патогеном быть вызвана одним антигеном, небольшим количеством определенных антигенов или сложной смесью неопределенных антигенов, зависит от рассматриваемого патогена. Изобретение основано на открытии, что небольшое количество определенных антигенов способно обеспечить широкий спектр защиты против менингококковой инфекции, и изобретение включает композицию, которая после введения индивидууму способна вызвать (индуцировать) антительный ответ (гуморальный иммунный ответ) у данного индивидуума, причем гуморальный иммунный ответ оказывает бактерицидное действие против двух или нескольких (например, 2 или 3) сверхвирулентных рядов поколений А4, ЕТ-5 и ряда поколений 3 серогруппы В N.meningitidis.

Предпочтительнее, чтобы композиция изобретения состояла не из одного антигена, а включала смесь 10 или менее (например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) очищенных антигенов, и особенно предпочтительно, чтобы композиция не включала сложные или неопределенные смеси антигенов, например, предпочтительно, чтобы композиция не включала пузырьки наружной мембраны.

Для менингококка серогруппы В было обнаружено, что смесь пяти определенных белковых антигенов белков вызывает хорошую защитную иммунную реакцию. Таким образом, изобретение включает композицию, включающую следующие пять менингококковых белковых антигенов: (1) белок "NadA" (2) белок «741»; (3) белок «936»; (4) белок «953» и (5) белок «287». Указанные антигены именуются в данном описании как «5 основных антигенов».

Белок "NadA"

"NadA" (адгезин А Neisseriae) из серогруппы В. N.meningitidis раскрыт в виде белка «961» в ссылке 10 (SEQ ID NO 2943 и NO 2944) и в виде «NMB1994» в ссылке 6 (см. также номера доступа генного банка 11352904 и 7227256). Подробное описание белка можно найти в ссылке 17. В серогруппе А нет соответствующего белка (5, 17).

При использовании в соответствии с настоящим изобретением, NadA может принимать различные формы. Предпочтительными формами NadA являются усеченные или делеционные варианты, такие как варианты, раскрытые в ссылках 14-16. В частности, предпочтителен NadA без его С-концевого мембранного якоря (например, делеция остатков 351-405 для штамма 2996 [SEQ ID NO 1]), который иногда определяется в настоящем описании использованием надстрочного «С», например, NadA^(С). Экспрессия NadA без его домена мембранного якоря (например, SEQ ID NO 1) в E.coli приводит к секреции белка в надосадочную жидкость культуры с сопутствующим удалением его 23-мерного лидерного пептида (например, для оставления 327-мера для штамма 2996 [SEQ ID NO 2]). Полипептиды без их лидерных пептидов иногда определяются в настоящем описании использованием надстрочного «NL», например, NadA^(NL) или NadA^(С)(NL).

Предпочтительные последовательности NadA имеют идентичность 50% или более (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с SEQ ID NO 2. Она включает варианты NadA (например, аллельные варианты, гомологи, ортологи, паралоги, мутанты и т.д.). Аллельные формы NadA показаны на фиг.9 ссылки 18.

Другие предпочтительные последовательности NadA включают, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из SEQ ID NO 1, где n равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты включают эпитоп из NadA. Другие предпочтительные фрагменты лишены одной или нескольких аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) из С-конца и/или N-конца SEQ ID NO 1 (например, NadA^(С), NadA^(NL) или NadA^(С)(NL)). Когда остатки N-конца устраняются, предпочтительно, чтобы делеция не устранила способность NadA прилипать к человеческим эпителиальным клеткам. Предпочтительным фрагментом SEQ ID NO 1 является SEQ ID NO 2.

Секретируемый NadA можно удобно получить в высоко очищенной форме из надосадочной жидкости культуры способом, включающим этапы: концентрации и диафильтрации против буфера ультрафильтрацией; анионной колоночной хроматографии; гидрофобной колоночной хроматографии; колоночной хроматографии на гидроксиапатитной керамике; диафильтрации против буфера и фильтрационной стерилизации. Дополнительные детали способа представлены в примерах.

NadA предпочтительно используется в олигомерной форме (например, в тримерной форме).

Белок 741

Белок «741» из серогруппы В раскрыт в ссылке 10 (SEQ ID NO 2535 & 2536) и в виде "NMB1870" в ссылке 6 (см. также номер доступа генного банка GI:7227128). Соответствующий белок в серогруппе А (5) имеет номер доступа генного банка 7379322. 741 по структуре представляет собой липопротеин.

При использовании в соответствии с настоящим изобретением белок 741 может иметь различные формы. Предпочтительными формами 741 являются усеченные или делеционные варианты, такие как формы, раскрытые в ссылках 14-16. В частности, N-конец 741 может подвергнуться делеции до поли-глициновой последовательности и включая ее (т.е. делеции остатков 1-72 для штамма МС58 [SEQ ID NO 3]), которая иногда определяется в настоящем описании использованием приставки "ΔG". Данная делеция может усилить экспрессию. Делеция также удаляет сайт липидирования «741».

Предпочтительные последовательности 741 имеют идентичность 50% или более (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с SEQ ID NO 3. Она включает варианты 741 (например, аллельные варианты, гомологи, ортологи, паралоги, мутанты и т.д.). Аллельные формы 741 можно найти в SEQ ID NO от 1 до 22 ссылки 16 и в SEQ ID NO от 1 до 23 ссылки 19. В SEQ ID NO 1-299 ссылки 20 представлены дополнительные последовательности 741.

Другие предпочтительные последовательности 741 включают, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из SEQ ID NO 3, где n = 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты включают эпитоп из 741. Другие предпочтительные фрагменты лишены одной или более аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) из С-конца и/или N-конца SEQ ID NO 3.

Белок 741 представляет собой крайне эффективный антиген для того, чтобы вызвать гуморальный иммунный ответ против менингококков, и он экспрессирован во всех менингококковых серогруппах. Филогенетический анализ показывает, что белок расщепляется на 2 группы и что одна из них расщепляется снова для получения всего трех вариантов (21), и, хотя сыворотка, выработанная против данного варианта, является бактерицидной в пределах группы того же варианта, она не активна против штаммов, которые экспрессируют один из других двух вариантов, т.е. существует перекрестная защита внутри вариантов, но неперекрестная защита между вариантами. Поэтому для максимальной эффективности между штаммами предпочтительно, чтобы композиция включала более одного варианта белка 741. Иллюстративная последовательность из каждого варианта представлена в настоящем описании в SEQ ID NO 10, 11 и 12, начиная с N-концевого цистеинового остатка, к которому будет ковалентно прикреплен липид в липопротеиновой форме 741.

Поэтому предпочтительно, чтобы композиция включала, по меньшей мере, 2 из: (1) первого белка, включающего аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, а% идентичность с последовательностью SEQ ID NO 10 и/или включающего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента, по меньшей мере, х смежных аминокислот из SEQ ID NO 10; (2) второго белка, включающего аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, b% идентичность с SEQ ID NO 11 и/или включающего аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента, по меньшей мере, из у смежных аминокислот из SEQ ID NO 11; и (3) третьего белка, включающего аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, с% идентичность с SEQ ID NO 12 и/или включающую аминокислотную последовательность, состоящую из фрагмента, по меньшей мере, z смежных аминокислот из SEQ ID NO 12.

Величина а составляет, по меньшей мере, 85, например, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Величина b составляет, по меньшей мере, 85, например, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Величина с составляет, по меньшей мере, 85, например, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 или более. Величины а, b и с не имеют взаимосвязи друг с другом.

Величина х составляет, по меньшей мере, 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Величина y составляет, по меньшей мере, 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Величина z составляет, по меньшей мере, 7, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Величины x, y и z не имеют взаимосвязи друг с другом.

Предпочтительно, чтобы каждая данная аминокислотная последовательность 741 не подпадала под более одной категории (1), (2) и (3). Таким образом, любая данная последовательность 741 должна подпадать только под одну из категорий (1), (2) и (3). Таким образом, предпочтительно, чтобы: белок (1) имел менее чем i% идентичность последовательности с белком (2); белок (1) имел менее, чем j% идентичность последовательности с белком (3); и белок (2) имел менее, чем k% идентичность последовательности с белком (3). Величина i составляет 60 или более (например, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90 и т.д.) и составляет, максимум а. Величина j составляет 60 или более (например, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 и т.д.) и составляет, максимум b. Величина k составляет 60 или более (например, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88. 89, 90 и т.д.) и составляет, максимум c. Величины i, j и k не имеют взаимосвязи друг с другом.

Белок 936

Белок «936» из серогруппы В раскрыт в ссылке 10 (SEQ ID NO 2883 и 2884) и в виде "NMB2091" в ссылке 6 (см. также номер доступа генного банка GI:7227353). Соответствующий ген в серогруппе А (5) имеет номер доступа генного банка 7379093.

При использовании в соответствии с настоящим изобретением, белок 936 может иметь различные формы. Предпочтительными формами 936 являются усеченный или делеционный варианты, такие как варианты, раскрытые в ссылках 14-16. В частности, N-концевой лидерный пептид 936 может быть подвергнут делеции (т.е. делеции остатков 1-23 для штамма МС58 [SEQ ID NO 4]) для получения 936^(NL).

Предпочтительные последовательности 936 имеют идентичность 50% или более (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более) с SEQ ID NO 4. Они включают варианты (например, аллельные варианты, гомологи, ортологи, паралоги, мутанты и т.д.).

Другие предпочтительные последовательности 936 включают, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из SEQ ID NO 4, где n = 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты включают эпитоп из 936. Другие предпочтительные фрагменты лишены одной или более аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) из С-конца и/или N-конца SEQ ID NO 4.

Белок 953

Белок «953» из серогруппы В раскрыт в ссылке 10 (SEQ ID NO 2917 и 2918) и в виде "NMB1030" в ссылке 6 (см. также номер доступа генного банка GI:7226269). Соответствующий белок в серогруппе А (5) имеет номер доступа генного банка 7380108.

При использовании в соответствии с настоящим изобретением белок 953 может иметь различные формы. Предпочтительными формами 953 являются усеченные или делеционные варианты, такие как варианты, раскрытые в ссылках 14-16. В частности, N-концевой лидерный пептид 953 может быть подвергнут делеции (т.е. делеции остатков 1-19 для штамма МС58 (SEQ ID NO 5) для получения 953^(NL).

Предпочтительные последовательности 953 имеют идентичность с SEQ ID NO 5 50% или более (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Они включают варианты 953 (например, аллельные варианты, гомологи, ортологи, паралоги, мутанты и т.д.). Аллельные формы 953 показаны на фиг.19 ссылки 12.

Другие предпочтительные последовательности 953 включают, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из SEQ ID NO 5, где n = 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты включают эпитоп из 953. Другие предпочтительные фрагменты лишены одной или более аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) из С-конца и/или N-конца SEQ ID NO 5.

Белок 287

Белок «287» из серогруппы В раскрыт в ссылке 10 (SEQ ID NO 3103 и 3104) и в виде "NMB2132" в ссылке 6 и в виде "GNA2132" в ссылке 13 (см. также номер доступа генного банка GI:7227388). Соответствующий белок в серогруппе А (5) имеет номер доступа генного банка 7379057.

При использовании в соответствии с настоящим изобретением, белок 287 может иметь различные формы. Предпочтительными формами 287 являются усеченные или делеционные варианты, такие как варианты, раскрытые в ссылках 14-16. В частности, N-конец 287 может быть подвергнут делеции до его полиглициновой последовательности и включая ее (т.е. делеции остатков 1-24 для штамма МС58 (SEQ ID NO 6)), которая иногда идентифицируется в настоящем описании использованием приставки "ΔG". Делеция может усилить экспрессию.

Предпочтительные последовательности 287 имеют идентичность с SEQ ID NO 6 50% или более (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Они включают варианты 287 (например, аллельные варианты, гомологи, ортологи, паралоги, мутанты и т.д.). Аллельные формы 287 показаны на фиг.5 и 15 ссылки 12 и в примере 13 и на фиг.21 ссылки 10 (SEQ ID NO 3179-3184).

Другие предпочтительные последовательности 287 включают, по меньшей мере, n последовательных аминокислот из SEQ ID NO 6, где n = 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты включают эпитоп из 287. Другие предпочтительные фрагменты лишены одной или более аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или более) из С-конца и/или N-конца SEQ ID NO 6.

Слитые белки

5 антигенов могут присутствовать в композиции в виде 5 отдельных белков, но предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, 2 из антигенов были экспрессированы в виде одиночной полипептидной цепи (слитый («гибридный») белок (ссылки 14-16)), например, 5 антигенов из менее, чем 5 полипептидов. Гибридные белки предоставляют 2 основных преимущества: во-первых, белку, который может быть неустойчивым или слабо экспрессированным сам по себе, можно помочь добавлением подходящего гибридного партнера, который преодолевает указанную проблему; во-вторых, упрощается промышленное изготовление, поскольку необходимо использовать только одну экспрессию и очистку для продукции двух отдельно используемых белков.

Гибридный белок, включенный в композицию по изобретению, может включать 2 или более (т.е., 2, 3, 4 или 5) из 5 основных антигенов. Предпочтительны гибриды, состоящие из 2 из 5 основных антигенов.

В пределах комбинации 5 основных антигенов антиген может присутствовать в более, чем одном гибридном белке и/или в виде негибридного белка. Однако предпочтительно, чтобы антиген присутствовал или виде гибрида, или в виде не гибрида, но не в виде обоих, хотя может быть полезным включить белок 741 как в виде гибридного, так и в виде негибридного (предпочтительно, липопротеинового) антигена, в частности, когда используют более одного варианта 741.

Двухантигенные гибриды для использования в изобретении включают: NadA и 741; NadA и 936; NadA и 953; NadA и 287; 741 и 936; 741 и 953; 741 и 287; 936 и 953; 936 и 297; 953 и 287. Предпочтительные двухантигенные гибриды включают: 741 и 936; 953 и 287.

Гибридные белки могут быть представлены формулой NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH, где: Х представляет собой аминокислотную последовательность одного из пяти основных антигенов; L представляет собой необязательную линкерную аминокислотную последовательность; А представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность; В представляет собой необязательную С-концевую аминокислотную последовательность и n=2, 3, 4 или 5.

Если часть -Х- имеет лидерную пептидную последовательность в ее форме дикого типа, то она может быть включена в гибридный белок или пропущена в нем. В некоторых вариантах реализации лидерные пептиды будут подвергнуты делеции, за исключением таковых части -Х-, расположенной на N-конце гибридного белка, т.е., лидерный пептид Х₁ будет сохранен, но лидерные пептиды Х₂...Х_n будут пропущены. Это представляет собой эквивалент делеции всех лидерных пептидов и использованию лидерного пептида Х₁ в качестве части -А-.

Для каждых n случаев [-X-L-] линкерная аминокислотная последовательность -L- может присутствовать или отсутствовать. Например, когда n=2, гибрид может представлять собой NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH, и т.д. Линкерная аминокислотная последовательность(и) -L- будет обычно короткой (например, из 20 или менее аминокислот, т.е., 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают короткие пептидные последовательности, которые способствуют клонированию, полиглициновые линкеры (т.е., включающие Cly_n, где n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) и гистидиновые метки (т.е., His_n, где n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более). Другие подходящие линкерные аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области. Полезным линкером является GSGGGG (SEQ ID NO 9), причем дипептид Gly-Ser образован из сайта рестрикции BamHI, таким образом, способствуя клонированию и манипуляции, а тетрапептид (Gly)₄ представляет собой типичный полиглициновый линкер. Если Х_n+1 представляет собой белок ΔG, а L_n представляет собой глициновый линкер, то он может быть эквивалентен Х_n+1, не представляющему собой белок ΔG, и отсутствующему L_n.

-А- представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность. Она обычно будет короткой (например, из 40 или менее аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности для направления транспорта белка или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, гистидиновые метки, т.е., His_n, где n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более). Другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области. Если Х₁ лишен его собственного метионина N-конца, -А- представляет собой предпочтительно олигопептид (например, с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотами), который обеспечивает наличие метионина на N-конце.

-В- представляет собой необязательную С-концевую аминокислотную последовательность. Она обычно будет короткой (например из 40 или менее аминокислот, т.е., 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают последовательности для направления транспорта белка, короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, гистидиновые метки, т.е., His_n, где n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) или последовательности, которые усиливают устойчивость белка. Другие подходящие С-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области.

Наиболее предпочтительно, n = 2. Двумя предпочтительными белками данного типа являются: Х₁ представляет собой 936 и Х₂ представляет собой 741; Х₁ представляет собой 287 и Х₂ представляет собой 953.

Двумя особенно предпочтительными гибридными белками изобретения являются следующие:

n	A	X1	L1	X2	L2	B	[SEQ ID]
2	MA	ΔG287	GSGGGG	953(NL)	-	-	7
2	M	936(NL)	GSGGGG	ΔG741	-	-	8

Указанные 2 белка можно использовать в комбинации с NadA (в частности, с SEQ ID NO 2).

Гибрид 936-ΔG741 можно удобно получить в высоко очищенной форме при его экспрессии у E.coli способом, включающим этапы: гомогенизации; центрифугирования; катионной колоночной хроматографии; анионной колоночной хроматографии; гидрофобной колоночной хроматографии; диафильтрации против буфера; и стерилизации фильтрованием. Дополнительные детали способа представлены в примерах.

Последовательности

Изобретение включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 1-8. Оно также включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность с идентичностью с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 1-8. Как описано выше, степень идентичности последовательности составляет предпочтительно более 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более).

Изобретение также включает полипептид, содержащий фрагмент последовательности NadA N.meningitidis, где указанный фрагмент сохраняет способность адгезии NadA к эпителиальным клеткам человека. Таким образом, предпочтительны фрагменты, которые сохраняют аминокислоты 24-87 NadA полной длины. Предпочтительные фрагменты лишены N-концевого лидерного пептида указанной NadA и/или С-концевого мембранного якорного домена указанной NadA. Настоящее изобретение не включает в свой объем ни один из фрагментов NadA, раскрытый в предшествующем уровне техники, например, в ссылках 6-18. У NadA полной длины (17), SEQ ID NO 1 лишена мембранного якорного домена, а SEQ ID NO 2 лишена лидерного пептида.

Изобретение также включает нуклеиновую кислоту, кодирующую такие полипептиды. Кроме того, изобретение включает нуклеиновую кислоту, которая может гибридизироваться к данной нуклеиновой кислоте, предпочтительно в «жестких условиях» (например, 65°С в 0,1хSSC, 0,5% раствор SDS, додецилсульфата натрия).

Полипептиды по изобретению можно получить различными средствами (например, рекомбинантной экспрессией, очисткой из культуры клеток, химическим синтезом (по меньшей мере, частично) и т.д.) и в различных формах (например, нативной, гибридной, негликозилированной, липидированной и т.д.). Их предпочтительно получают по существу в чистой форме (т.е., по существу лишенными белков другой N.meningitidis или белков клеток-хозяев).

Нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением можно получить многими путями (например, химическим синтезом (по меньшей мере, частично) из геномной или кДНК библиотек, из самого организма и т.д.), и она может принимать различные формы (например, однонитевую, двухнитевую, векторов, зондов и т.д.). Их предпочтительно получают по существу в чистой форме (т.е., по существу лишенными нуклеиновых кислот другой N.meningitidis или нуклеиновых кислот клеток-хозяев).

Термин «нуклеиновая кислота» включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные каркасы (например, фосфоротиоаты и т.д.), а также пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) и т.д. Изобретение включает нуклеиновую кислоту, включающую последовательности, комплементарные таковым, описанным выше (например, для антисмысловых или зондирующих целей).

Изобретение также включает способ получения полипептида по изобретению, предусматривающий этап культивирования клетки-хозяина, трансформированной нуклеиновой кислотой по изобретению, в условиях, которые вызывают экспрессию полипептида.

Изобретение включает способ получения полипептида по изобретению, включающий этап синтеза, по меньшей мере, части полипептида химическими средствами.

Изобретение включает способ получения нуклеиновой кислоты по изобретению, предусматривающий этап амплификации нуклеиновой кислоты с использованием способа амплификации на основе праймера (затравки) (например, PCR, полимеразной реакцией синтеза цепи).

Изобретение включает способ получения нуклеиновой кислоты по изобретению, предусматривающий этап синтеза, по меньшей мере, части нуклеиновой кислоты химическими средствами.

Штаммы

Предпочтительные белки по изобретению включают аминокислотную последовательность, обнаруженную в серогруппе В N.meningitidis. В пределах серогруппы В предпочтительными штаммами являются 2996, МС58, 95N477 и 394/98. Штамм 394/98 иногда именуется в настоящем описании "NZ", поскольку он представляет собой новозеландский штамм.

Белок 287 предпочтительно происходит из штамма 2996 или, предпочтительнее, из штамма 394/98.

Белок 741 предпочтительно происходит из штаммов МС58, 2996, 394/98 или 95N477 серогруппы В или из штамма 90/18311 серогруппы С. Предпочтительнее штамм МС58.

Белки 936, 953 и NadA предпочтительно происходит из штамма 2996.

Штаммы могут быть указаны в виде подстрочной надписи, например, 741_МС58 представляет собой белок 741 из штамма МС58. При отсутствии других указаний, указанные в настоящем описании белки (например, без подстрочной надписи) получены из штамма 2996 N.meningitidis, который может быть принят за «эталонный» штамм. Однако следует понимать, что изобретение в целом не ограничено данным штаммом. Как указано выше, общие ссылки на белок (например, «287», «919» и т.д.) могут применяться для включения указанного белка из любого штамма. Он обычно будет иметь идентичность последовательности с 2996 90% или более (например, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более).

Когда композиция включает конкретный белковый антиген (например, 741 или 287), композиция может включать указанный антиген в форме нескольких вариантов, например, один и тот же белок, но из нескольких штаммов. Данные белки могут быть включены в виде тандемных или отдельных белков.

Когда используются гибридные белки, отдельные антигены в пределах гибрида (т.е., отдельные части -Х-) могут быть из одного или нескольких штаммов. Например, когда n=2, Х₂ может быть из того же штамма, что Х₁ или из другого штамма. Когда n=3, штамм может представлять собой (i) X₁=X₂=X₃ (ii) X₁=X₂≠X₃ (iii) X₁≠X₂=X₃ (iv) X₁≠X₂≠X3 или (v) X₁=X₃≠X₂ и т.д.

Сверхвирулентные ряды поколений и реакции бактерицидных антител

В целом, композиции по изобретению способны вызвать бактерицидные реакции сывороточных антител после введения индивидууму. Данные реакции можно измерить у мышей, и они представляют собой стандартный показатель эффективности вакцины (например, см. концевое примечание 14 ссылки 13). Бактерицидная активность сыворотки (SBA) измеряет уничтожение бактерий, опосредованное комплементом, и ее можно анализировать с использованием комплемента человека или крольчонка. Стандарты ВОЗ требуют, чтобы вакцина вызывала, по меньшей мере, 4-кратное увеличение SBA более, чем у 90% реципиентов.

Вместо обеспечения узкой защиты композиции по изобретению могут вызвать бактерицидный гуморальный иммунный ответ против нескольких сверхвирулентных рядов поколений серогруппы В. В частности, они могут вызывать бактерицидные реакции против 2 или 3 из следующих трех сверхвирулентных рядов поколений: (i) кластер А4; (ii) комплекс ЕТ5 и (ii) ряд поколений 3. Они могут дополнительно вызывать бактерицидные гуморальные иммунные ответы против одного или нескольких сверхвирулентных рядов поколений подгруппы I, подгруппы III, подгруппы IV-1 или комплекса ЕТ-37 и против других рядов поколений, например, сверхинвазивные ряды поколений.

Это необязательно означает, что композиция может вызвать выработку бактерицидных антител против каждого и всех штаммов менингококка группы В в пределах указанных сверхвирулентных рядов поколений, например, скорее для каждой данной группы из 4 или более штаммов менингококка серогруппы В в пределах конкретного сверхвирулентного ряда поколений, антитела, вызванные композицией, являются бактерицидными против, по меньшей мере, 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90% или более) группы. Предпочтительные группы штаммов будут включать штаммы, выделенные, по меньшей мере, в четырех из следующих стран: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR и CU. Сыворотка предпочтительно имеет бактерицидный титр, по меньшей мере, 1024 (например, 2¹⁰, 2¹¹, 2¹², 2¹³, 2¹⁴, 2¹⁵, 2¹⁶, 2¹⁷, 2¹⁸ или выше, предпочтительно, по меньшей мере, 2¹⁴), т.е., сыворотка способна уничтожить, по меньшей мере, 50% испытуемых бактерий определенного штамма при разведении 1/1024, как описано в ссылке 13.

Предпочтительные композиции могут включать бактерицидные реакции против следующих штаммов менингококка серогруппы В: (i) из кластера А4, штамма 961-5945 (B:2b:P1.21,16) и/или штамма G2136 (B:-); (ii) из комплекса ЕТ-5, штамма МС58 (В:15:Р1.7,16b) и/или штамма 44/76 (В:15:Р1.7,16); (iii) из ряда поколений 3, штамма 394/98 (В:4:P1.4) и/или штамма BZ198 (B:NT:-). Более предпочтительные композиции могут вызвать бактерицидные реакции против штаммов 961-5945, 44/76 и 394/98.

Оба штамма 961-5945 и G2136 представляют собой эталонные штаммы Neisseria MLST (идентификационные №№ 638 и 1002 в ссылке 22). Штамм МС58 широко доступен (например, АТСС ВАА-335) и представлял собой штамм, секвенированный в ссылке 6. Штамм 44/76 широко использовался и характеризовался (например, ссылка 23) и представляет собой один из эталонных штаммов Neisseria MLST (идентификационный № 237 в ссылке 22; ряд 32 табл.2 в ссылке 1). Штамм 394/98 был первоначально выделен в Новой Зеландии в 1998 г, и было несколько опубликованных исследований с использованием данного штамма (например, ссылки 24 и 25). Штамм BZ198 представляет собой другой эталонный штамм MLST (идентификационный № 409 в ссылке 22; ряд 41 табл.2 в ссылке 1).

Композиция может дополнительно вызывать бактерицидную реакцию против штамма LNP17592 (W135:2a:P1.5,2) серогруппы W135 из комплекса ЕТ-37. Он представляет собой штамм Haji, выделенный во Франции в 2000 г.

Гетерологичный хозяин

Хотя экспрессия белков по изобретению может происходить у Neisseria, согласно настоящему изобретению, предпочтительно используется гетерологичный хозяин. Гетерологичный хозяин может быть прокариотическим (например, бактерией) или эукариотическим. Он представляет собой предпочтительно E.coli, но другие подходящие хозяева включают Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (т.е. M.tuberculosis),дрожжи и т.д.

Таким образом, изобретение включает композицию, которая после введения индивидууму способна вызвать гуморальный иммунный ответ у данного индивидуума, причем гуморальный иммунный ответ является бактерицидным против двух или более (например, 2 или 3) сверхвирулентных рядов поколений А4, ЕТ-5 и ряда поколений 3 серогруппы В N.meningitidis, и в которой иммуногены в композиции, которые вызывают развитие гуморального иммунного ответа, получены рекомбинантной экспрессией у хозяина, не являющегося Neisseria. Таким образом, иммуногены в композициях по изобретению представляют собой предпочтительно рекомбинантные иммуногены. Таким образом, могут быть предпочтительны композиции, которые не включают препараты OMV.

Иммуногенные композиции и лекарственные средства

Композиции по изобретению являются иммуногенными и, предпочтительнее, представляют собой вакцинные композиции. Вакцины в соответствии с изобретением могут быть или профилактическими (т.е. для предотвращения инфекции), или терапевтическими (т.е. для лечения инфекции), но обычно будут профилактическими.

рН композиции составляет предпочтительно от 6 до 8, предпочтительно, приблизительно 7. Устойчивый рН можно поддерживать использованием буфера. Когда композиция включает гидроокись алюминия, предпочтительно использовать гистидиновый буфер (26). Композиция может быть стерильной и/или лишенной пирогенов. Композиции по изобретению могут быть изотоничными при введении людям.

Композиции могут быть представлены во флакончиках, или они могут быть представлены в виде готовых к употреблению заполненных шприцев. Шприцы могут поставляться с иглами или без них. Шприц будет включать одну дозу композиции, тогда как флакончик может включать одну дозу или множество доз. Композиции для инъекций будут обычно представлять собой жидкие растворы или суспензии. Альтернативно, они могут быть представлены в твердой форме (например, лиофилизированными) для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией.

Композиции по изобретению могут быть упакованы в стандартной дозированной форме, содержащей одну дозу или множество доз. Для форм, содержащих множество доз, флакончики предпочтительнее предварительно заполненных шприцев. Эффективные дозированные формы можно установить обычными способами, но типичная доза композиции для инъекции человеку имеет объем 0,5 мл.

Когда композицию по изобретению предстоит готовить непосредственно перед применением (например, когда компонент представлен в лиофилизированной форме), и она представлена в виде набора, набор может включать 2 флакончика или он может включать один готовый к использованию заполненный шприц и один флакончик, причем содержимое шприца используется для реактивации содержимого флакончика перед инъекцией.

Изобретение также включает композицию по изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Лекарственное средство предпочтительно способно вызвать иммунную реакцию у млекопитающего (т.е. оно представляет собой иммуногенную композицию) и, предпочтительнее, представляет собой вакцину.

Изобретение также включает применение композиции по изобретению в приготовлении лекарственного средства для того, чтобы вызвать иммунную реакцию у млекопитающего. Оно также включает применение белка "NadA", белка «741»,