Эпимеризованные производные полисахарида к5 с высокой степенью сульфатирования

Эпимеризованные производные полисахарида к5 с высокой степенью сульфатирования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается новых производных полисахарида К5 с высокой степенью сульфатирования, способа их получения, новых сильно O-сульфатированных промежуточных продуктов, полезных при их синтезе, и фармацевтических композиций, содержащих данные производные полисахарида К5 в качестве активных ингредиентов, практически лишенных активности на свертываемость крови.

В частности, изобретение касается способа получения эпи-К5-N,O-гиперсульфатов, исходя из полисахарида К5, предварительно N-деацетилированного, N-сульфатированного и С5-эпимеризованного, по меньшей мере, на 20%, путем O-гиперсульфатирования в подходящих условиях и последующего N-сульфатирования, а также касается данных эпи-К5-N,O-гиперсульфатов, обладающих антиангиогенной и антивирусной активностью, и новых низкомолекулярных промежуточных продуктов для эпи-К5-N-сульфатов.

Уровень техники

Гликозаминогликаны, такие как гепарин, гепарансульфат, дерматансульфат, хондроитинсульфат и гиалуроновая кислота, - это биополимеры, которые в промышленности экстрагируют из различных органов животных.

В частности, гепарин, который в основном получают экстрагированием из слизистой оболочки кишечника свиней или легких крупного рогатого скота, является полидисперсным полимером с молекулярным весом приблизительно в пределах от 3000 до 30000 Д, состоящим из смешанных цепей, в основном состоящих из уроновой кислоты (глюкуроновой или идуроновой кислоты) и аминосахара (глюкозамина), соединенных между собой связями α-1→4- или β-1→4. У гепарина уроновое звено может подвергаться O-сульфатированию в положении 2, а глюкозаминовое звено подвергается N-ацетилированию или N-сульфатированию, 6-O-сульфатированию и 3-O-сульфатированию приблизительно у 0,5% глюкозаминовых звеньев.

Свойства и естественный биосинтез гепарина у млекопитающих описаны в Lindahl et al., 1986 in Lane D. and Lindahl U. (Editors) "Heparin. Chemical and Biological Properties, Clinical Applications", Edward Arnold, London, Pages 159-190; Lindahl U., Feingold D.S. and Roden L., 1986 TIBS, 11, 221-225; Conrad H.E. "Heparin Binding Proteins", Chapter 2: Structure of Heparinoids. Academic Press, 1998. Биосинтез гепарина происходит, начинаясь с его предшественника N-ацетилгепарозана, состоящего из смешанных цепей, состоящих из повторяющихся звеньев дисахарида глюкуронил-β-1→4-N-ацетилглюкозамина. Данный предшественник подвергается энзиматическим модификациям, которые включают частичный гидролиз N-ацетила, замещение его группой SO₃ ^-, эпимеризацию карбоксила в положении 5 некоторой части глюкуроновых звеньев с превращением их в идуроновые звенья и введение O-сульфатных групп с образованием продукта, который после промышленной экстракции содержит вдвое больше сульфатных групп по сравнению с карбоксильными группами на 1 звено дисахарида. Кроме того, эти энзиматические модификации ведут к образованию пентасахаридного участка связывания антитромбина III (ATIII), называемого активным пентасахаридом, который представляет собой структуру, необходимую для высокоаффинного связывания гепарина с ATIII и существенную для антикоагуляционной и антитромботической активности самого гепарина. Этот пентасахарид, который имеется только в некоторых цепях, составляющих гепарин, содержит сульфатированное звено глюкозамина в положении 3 и глюкуроновую кислоту, расположенные между дисахаридами, содержащими идуроновую кислоту.

В природе образование активного пентасахарида осуществляется посредством реакции эпимеризации карбоксила некоторой части глюкуроновых звеньев в идуроновые звенья под действием глюкуронил-С5-эпимеразы (С5-эпимеризация) и соответствующего сульфатирования, которое также ведет к введению сульфатной группы в гидроксил в положении 3 глюкозамина. В частности, в природе образование активного пентасахарида осуществляется таким образом, что С5-эпимеризация происходит отдельными "кластерами", то есть на части цепей, и в большой степени, при этом образуется продукт, содержащий больше идуроновых звеньев, чем глюкуроновых. В самом деле, коммерческий гепарин содержит примерно 70% идуроновых звеньев и 30% глюкуроновых звеньев.

Наряду с основным антикоагуляционным и антитромботическим действием гепарин также оказывает антилипемическое, антипролиферативное, антивирусное, противораковое и противометастазное действие, но его применение в качестве лекарственного препарата сдерживается из-за побочных эффектов, обусловленных его антикоагуляционным действием, которые может вызывать кровотечения.

Как известно, капсулярный полисахарид К5, выделенный из Escherichia coli и описанный Vann W.F. et al., European Journal of Biochemistry, 1981, 116, 359-364 ["Vann 1981"], состоит из смешанных цепей, состоящих из повторяющихся звеньев дисахарида глюкуронил-β-1→4-N-ацетилглюкозамина, поэтому он проявляет такую же повторяющуюся последовательность (А):

как у N-ацетилгепарозана - предшественника гепарина. Капсулярный полисахарид К5, именуемый в дальнейшем как "полисахарид К5" или просто "К5", подвергали химической модификации Lormeau et al., как описано в US 5550116, и Casu et al., как описано в Carbohydrate Research, 1994, 263, 271-284. O-сульфаты К5, обладающие противораковым, противометастазным, антивирусным действием, в особенности против ВИЧ, описаны в ЕР 333243 и WO 98/34958. К5 также подвергали химическим и энзиматическим модификациям для того, чтобы получить продукты, имеющие такой же тип биологической активности на свертываемость крови in vitro, как у гепарина, экстрагированного из органов животных (экстрактивного гепарина).

Получение продуктов, обладающих таким же типом активности на свертываемость крови, как экстрактивный гепарин, осуществляется способом, имитирующим процесс, происходящий в природе и предусматривающий всю ключевую стадию С5-эпимеризации с помощью D-глюкуронил-C5-эпимеразы.

В способах, описанных в IT 1230785, WO 92/17507, WO 96/14425 и WO 97/43317, в качестве исходного материала используется К5. Полученный при ферментации К5 подвергают N-деацетилированию, а затем N-сульфатированию, и образовавшийся при этом К5-N-сульфат подвергают С5-эпимеризации в растворе с помощью С5-эпимеразы, полученной хроматографией раствора микросомальных ферментов из клеток мастоцитомы мышей (IT 1230785) или бычьей печени (WO 92/17507, WO 96/14425 и WO 97/43317).

D-глюкуронил-С5-эпимераза из бычьей печени была очищена Campbell P. et al., J. Biol. Chem., 1994, 269/43, 26953-26958 ("Campbell 1994"), которые также получили ее аминокислотный состав и описали ее применение в растворе для превращения K5-N-сульфата в соответствующий продукт, эпимеризованный на 30%, засвидетельствовав образование идуроновой кислоты методом HPLC с последующей полной деполимеризацией с помощью азотистой кислоты на дисахариды.

В WO 98/48006 описана последовательность ДНК, кодирующей D-глюкуронил-С5-эпимеразу, и была получена рекомбинантная D-глюкуронил-С5-эпимераза с помощью рекомбинантного экспрессирующего вектора, содержащего эту ДНК, а затем очищена Campbell et al., как показано в Jin-Ping L. et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 20069-20077 ("Jin-Ping 2001").

Полная последовательность С5-эпимеразы описана в Crawford B.E. et al., J. Biol. Chem., 2001, 276(24), 21538-21543 (Crawford 2001).

В WO 01/72848 описан способ получения N-деацетилированных N-сульфатированных производных полисахарида К5, эпимеризованных до идуроновой кислоты, по меньшей мере, на 40% в пересчете на сумму уроновых кислот, с молекулярным весом от 2000 до 30000, содержащих от 25% до 50% высокоаффинных цепей для ATIII и обладающих антикоагуляционной и антитромботической активностью, выраженной в виде отношения HCII/антиХа, от 1,5 до 4. В этом документе описано гиперсульфатирование К5-N-сульфата, эпимеризованного на 40-60%, и показано, что полученный продукт, для которого приведен спектр ¹³С-ЯМР, содержит 2-3,5 сульфатных группы на 1 звено дисахарида. При повторении вышеуказанного гиперсульфатирования в описанных условиях и изучении ¹³С-ЯМР было установлено, что полученный продукт на самом деле представляет собой свободный амин, содержащий 80-95% 6-O-сульфата и 30% 3-O-сульфата на аминосахаре, но степень сульфатирования составляет 3,2. Также оказалось, что в условиях гиперсульфатирования, описанных в WO 01/72848, достигается степень сульфатирования не более 3,2. В US 2002/0062019 описан способ получения эпи-К5-N,O-сульфатов, проявляющих активность в регуляции свертывания крови, у которых степень сульфатирования составляет от 2,3 до 2,9, с молекулярным весом от 2000 до 30000, либо от 4000 до 8000, либо от 18000 до 30000. Этот способ включает стадии: (p-а) N-деацетилирования полисахарида К5 и N-сульфатирования образовавшегося К5-амина, (p-b) эпимеризации К5-N-сульфата, (p-с) O-гиперсульфатирования эпи-К5-N-сульфата, (p-d) частичного O-десульфатирования, (p-е) избирательного 6-O-сульфатирования, (p-f) N-сульфатирования полученного при этом продукта, причем любой продукт, полученный по окончании одной из стадий от (p-b) до (p-f), может быть подвергнут деполимеризации. В этом документе описан эпи-К5-N,O-сульфат с молекулярным весом 7400, получаемый при проведении стадий от (p-а) до (p-f) с последующей азотистой деполимеризацией под конец стадии (p-f), у которого степень сульфатирования составляет от 2,3 до 2,9.

В том же документе описана и отдельная часть К5 с молекулярным весом примерно 5000, которая также может быть подвергнута стадиям от (p-а) до (p-f).

Для того, чтобы стандартизировать терминологию и сделать текст более понятным, в настоящем описании будут применяться условные термины и выражения, в единственном или множественном числе. В частности:

- "К5" или "полисахарид К5" означает капсулярный полисахарид из Escherichia coli, полученный путем ферментации, то есть это смешанная цепь, состоящая из звеньев дисахарида (А), необязательно содержащих двойную связь на невосстанавливающем конце, как показано выше, и в любом случае он получен и очищен методами, описанными в литературе, в частности методом Vann 1981, методом Manzoni M. et al., Journal of Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301-311 ("Manzoni 1996") или методом, описанным в WO 01/72848 WO 02/068447; специалисту в этой области должно быть ясно, что все, что показано в дальнейшем, применимо к любому N-ацетилгепарозану;

- "С5-эпимераза" означает В-глюкуронил-С5-эпимеразу, экстрактивную или рекомбинантную, но в любом случае она получена, выделена и очищена, в частности, как описано в Campbell 1994; WO 98/48006; Jin-Ping L. et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 20069-20077 ("Jin-Ping 2001") или Crawford 2001;

- "К5-амин" означает К5, деацетилированный, по меньшей мере, на 95%, у которого N-ацетильные группы не обнаруживаются на обычном приборе для ЯМР;

- "К5-N-сульфат" означает К5, деацетилированный, по меньшей мере, на 95% и N-сульфатированный обычно на 100%, так как N-ацетильные группы не обнаруживаются на обычном приборе для ЯМР, как описано далее;

- "эпи-К5" означает К5 и его производные, у которых 20-60% глюкуроновых звеньев подверглись С5-эпимеризации в идуроновые звенья;

- "эпи-К5-N-сульфат" означает К5-N-сульфат, у которого 20-60% глюкуроновых звеньев подверглись С5-эпимеризации в идуроновые звенья;

- "эпи-К5-амин-O-гиперсульфат" означает эпи-К5-амин-O-сульфат, у которого степень сульфатирования составляет, по меньшей мере, 3,4;

- "эпи-К5-N,O-гиперсульфат" означает эпи-К5-амин-O-сульфат, подвергшийся полному N-сульфатированию до степени сульфатирования, по меньшей мере, 4.

Кроме того:

- условные термины и выражения, определенные выше, относятся к К5, выделенному после ферментации, обычно с молекулярным весом приблизительно в пределах от 1500 до 50000 и средним молекулярным весом 10000-25000, предпочтительно 15000-25000;

- условные термины и выражения, определенные выше, если им предшествует сокращение "НМ" (низкомолекулярный), например НМ К5-N-сульфат, НМ эпи-К5-N-сульфат, означают низкомолекулярные продукты, полученные при фракционировании или при деполимеризации К5-N-сульфата и состоящие или происходящие из K5-N-сульфатов со средним молекулярным весом приблизительно от 1500 до 12000 в пересчете на 100% N-сульфатированный продукт;

- условные термины и выражения, определенные выше, если при них стоит слово "производное", в целом означают как производные нативного К5, так и низкомолекулярного К5;

- выражение "приблизительно" в отношении молекулярного веса означает молекулярный вес, измеренный методом вискозиметрии, ± теоретический вес дисахаридного звена, включая вес натрия, который принимается равным 461 в случае производных эпи-К5-N-сульфатов и 806 в случае производных эпи-К5-N,O-гиперсульфатов со степенью сульфатирования 4,26;

- выражение "преобладающая разновидность" означает соединение, которое в смеси, состоящей из НМ эпи-К5-N-сульфата, НМ эпи-К5-амин-O-гиперсульфата или НМ эпи-К5-N,O-гиперсульфата, представлено в наибольшей степени, что определяется пиком на графике молекулярного веса при измерении методом HPLC;

- если не оговорено иначе, "степень сульфатирования" означает соотношение SO₃ ^-/COO^-, также выражаемое числом сульфатных групп на 1 звено дисахарида, при измерении кондуктометрическим методом, описанным в Casu В. et al.. Carbohydrate Research, 1975, 39, 168-176 (Casu 1975), который также применялся в WO 01/72848;

- "условия O-гиперсульфатирования" означают предельное O-сульфатирование, которое проводится, к примеру, согласно методу С, описанному в В. Casu et al., Carbohydrate Research, 1994, 263, 271-284 (Casu 1994);

- термин "алкил" означает линейный или разветвленный алкил, тогда как "тетрабутиламмоний" означает группу тетра-п-бутиламмония.

Сущность изобретения

Было показано, что в отличие от того, что происходит при применении способов, описанных в IT 1230785, WO 92/17507, WO 96/14425, WO 97/43317, WO 01/72848 и US 2002/0062019, исходя из эпи-К5-N-сульфата можно получить эпи-К5-амин-O-гиперсульфат с большей степенью сульфатирования, чем у любого другого эпи-К5-амин-O-сульфата, описанного в литературе, например, в WO 01/72848, путем получения соли третичного или четвертичного органического основания данного эпи-К5-N-сульфата с обязательным оставлением реакционной смеси на 30-60 минут при поддержании рН около 7 с помощью того же органического основания, а затем обработки полученной соли O-сульфатирующим реагентом в условиях O-гиперсульфатирования.

Подвергая полученные при этом эпи-К5-амин-O-гиперсульфаты N-сульфатированию, получают новые эпи-К5-N,O-гиперсульфаты, которые в отличие от продуктов, описанных в IT 1230785, WO 92/17507, WO 96/14425, WO 97/43317, WO 01/72848 и US 2002/0062019, лишены активности на свертываемость крови и полезны для получения лекарств, в частности фармацевтических композиций, обладающих антиангиогенной и антивирусной активностью, либо косметических композиций.

При деполимеризации данных эпи-К5-N,O-гиперсульфатов с помощью азотистой кислоты получают новые НМ эпи-К5-N,O-гиперсульфаты, лишенные активности на свертываемость крови и обладающие антиангиогенной и антивирусной активностью.

При получении N,O-сульфата из N-деацетилированных производных полисахарида К5, эпимеризованных, по меньшей мере, на 40% до идуроновой кислоты в пересчете на сумму уроновых кислот и имеющих низкий молекулярный вес, методом, описанным в WO 01/72848, было установлено, что деполимеризация высокомолекулярного продукта, полученного по окончании заключительной стадии процесса N-сульфатирования, может давать различные результаты, так как она обычно приводит к получению некоторых деполимеризованных продуктов, обладающих значительно меньшей активностью, чем те высокомолекулярные продукты, из которых они образуются, на все параметры свертывания крови. Предполагается, что это происходит потому, что на деградацию с применением азотистой кислоты влияет присутствие сульфатных групп. В частности, сульфаты в положении 3 глюкозамина ведут к образованию гетерогенных продуктов, как описано в Nagasawa et al., Thrombosis Research, 1992, 65, 463-467 (Nagasawa 1992).

Тогда же было обнаружено, что при азотистой деполимеризации эпи-K5-N-сульфата, в котором содержание идуроновой кислоты в пересчете на сумму уроновых кислот составляет 20-60%, предпочтительно 40-60%, более предпочтительно около 60%, образуются НМ эпи-К5-N-сульфаты, являющиеся новыми эффективными промежуточными продуктами для получения НМ эпи-К5-N,O-гиперсульфатов, обладающих высокой активностью на различные биологические параметры, в частности обладающие или не обладающие активностью на параметры свертывания крови. Оказалось, что при деполимеризации эпи-К5-N-сульфата можно получить новые НМ эпи-К5-N-сульфаты со средним молекулярным весом приблизительно от 2000 до 4000, в частности, определенные НМ эпи-К5-N-сульфаты, состоящие из смесей, в которых преобладающим соединением является декасахарид или додекасахарид либо тетрадекасахарид. К тому же эти НМ эпи-К5-N-сульфаты, которые невозможно получить иным способом, обладают интересными биологическими свойствами и являются важными промежуточными продуктами для получения НМ эпи-К5-N,O-гиперсульфатов, обладающих антивирусной и/или антиангиогенной активностью и неожиданно лишенных активности на свертываемость крови.

Подвергая НМ эпи-К5-N-сульфат вышеуказанному методу получения соли с помощью третичного или четвертичного органического основания с обязательным оставлением реакционной смеси на 30-60 минут при поддержании рН около 7 с помощью того же органического основания, а затем обработки полученной соли O-сульфатирующим реагентом в условиях O-гиперсульфатирования, получают новые НМ эпи-К5-амин-O-гиперсульфаты. Подвергая НМ эпи-К5-амин-O-гиперсульфат N-сульфатированию, получают новые N-сульфатированные и O-гиперсульфатированные производные (НМ эпи-К5-N,O-гиперсульфаты), неожиданно лишенные активности на свертываемость крови и обладающие антивирусной и/или антиангиогенной активностью, полезные для получения фармацевтических или косметических композиций.

Эти НМ эпи-К5-N-сульфаты получают из К5-N-сульфата посредством реакции эпимеризации с помощью выделенной и очищенной рекомбинантной С5-эпимеразы, иммобилизованной на твердом носителе, при температуре около 30°С и рН около 7 в течение 12-24 часов в присутствии двухвалентного катиона, выбранного из числа кальция, магния, бария и марганца, и последующей реакции азотистой деполимеризации полученного при этом продукта, либо в обратной последовательности.

Неожиданно наблюдения за ходом реакции эпимеризации в вышеуказанных условиях позволяют предположить, что в отличие от того, что происходит в природе при биосинтезе гепарина, протекает не "кластерная", а обычная С5-эпимеризация субстрата через каждые 2 звена глюкуроновой кислоты, которая ведет к образованию производных эпи-К5-N-сульфатов, отличающихся наличием повторяющегося тетрасахаридного звена, состоящего из двух звеньев глюкозамина, разделенных сначала глюкуроновым звеном, а затем идуроновым звеном, либо наоборот.

Подробное описание изобретения

Итак, в соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение предусматривает способ получения производных эпи-К5-N,O-гиперсульфатов, характеризующихся тем, что:

(a) производное эпи-К5-N-сульфата, в кислотной форме, обрабатывают третичным или четвертичным органическим основанием, оставляя реакционную смесь на 30-60 минут, и поддерживают значение рН раствора около 7 добавлением того же третичного или четвертичного органического основания, и выделяют соль данного органического основания;

(b) данную соль органического основания и данного производного эпи-К5-N-сульфата обрабатывают O-сульфатирующим реагентом в условиях O-гиперсульфатирования;

(c) полученное при этом производное эпи-К5-амин-O-гиперсульфата обрабатывают N-сульфатирующим реагентом и выделяют производное эпи-К5-N,O-гиперсульфата.

В общем случае производное эпи-К5-N,O-гиперсульфата выделяют в виде натриевой соли и необязательно данную натриевую соль превращают в другую химически или фармацевтически приемлемую соль.

В этом контексте термин "химически приемлемый" относится к катиону, применяемому при химическом синтезе, типа натрия, аммония, иона (C₁-C₄)-тетраалкиламмония, или при очистке продукта, тогда как "фармацевтически приемлемый" не требует объяснений.

Предпочтительны катионы щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммония, (С₁-С₄)-тетраалкиламмония, алюминия и цинка. Наиболее предпочтительны катионы натрия, кальция и тетрабутиламмония.

В соответствии с предпочтительным выполнением способа стадия (а) проводится путем пропускания раствора натриевой соли производного эпи-К5-N-сульфата, то есть полисахарида К5, предварительно N-деацетилированного, N-сульфатированного, обычно на 100%, С5-эпимеризованного на 20-60% и необязательно деполимеризованного азотистой кислотой, со средним молекулярным весом приблизительно от 1000 до 25000, предпочтительно от 1500 до 25000, через колонку с кислым анионообменником, к примеру, типа IR-120 Н⁺ сбора элюата вместе с промывочным раствором и нейтрализации элюата третичным или четвертичным органическим основанием, предпочтительно водным раствором гидроокиси тетрабутиламмония. Раствор оставляют на 1 час, поддерживая рН около 7 добавлением того же самого основания, и полученную при этом соль выделяют путем лиофилизации.

На стадии (b) O-гиперсульфатирование проводится при помощи избытка O-сульфатирующего реагента и обработки при температуре от 20 до 70°С в течение времени вплоть до 24 часов в апротонном полярном растворителе.

Предпочтительно выделенную на стадии (а) соль третичного или четвертичного органического основания и производного эпи-К5-N-сульфата, то есть полисахарида К5, предварительно N-деацетилированного, N-сульфатированного, предпочтительно на 100%, С5-эпимеризованного на 20-60% и необязательно деполимеризованного азотистой кислотой, со средним молекулярным весом приблизительно от 1000 до 25000, предпочтительно от 1500 до 25000, растворяют в диметилформамиде и обрабатывают O-сульфатирующим реагентом в количестве 2-10 моль на каждый свободный гидроксил при температуре 40-60°С в течение 10-20 часов. В качестве O-сульфатирующего реагента предпочтительно используют соединение пиридин·SO₃ в количестве 2,5-5 моль, предпочтительно 2,5-4 моль на 1 свободный гидроксил на 1 дисахарид и реакцию проводят предпочтительно при 50-60°С, более предпочтительно при 55°С в течение ночи.

Полученный по окончании реакции продукт выделяют путем добавления 0,1-1 объема воды и нейтрализации, предпочтительно с помощью гидроокиси натрия, осаждения насыщенным раствором хлористого натрия в ацетоне, фильтрования и необязательно ультрафильтрации.

Полученный при этом продукт обычно представляет собой натриевую соль производного эпи-К5-амин-O-гиперсульфата с содержанием идуроновой кислоты в 20-60% от суммы уроновых кислот, со средним молекулярным весом приблизительно от 3500 до 40000, предпочтительно от 4500 до 40000, со степенью сульфатирования не менее 3,4, предпочтительно, по меньшей мере, 3,5, более предпочтительно от 3,55 до 4, наиболее предпочтительно от 3,55 до 3,8. Полученная при этом соль может быть превращена в другую соль. Например, может быть проведен обмен ионов на ион кальция с помощью мембран для ультрафильтрации.

На стадии (с) производное эпи-К5-амин-O-гиперсульфата с очень высокой степенью сульфатирования подвергают N-сульфатированию, используя известные в литературе методы N-сульфатирования.

На практике N-сульфатирование проводится путем обработки водного раствора, содержащего производное эпи-К5-амин-O-гиперсульфата, полученное на стадии (b), карбонатом натрия и N-сульфатирующим реагентом, например соединением (C₁-C₄)-триалкиламин·SO₃ или пиридин·SO₃, выдерживания смеси при 30-50°С в течение 8-24 часов и выделения нужного производного эпи-К5-N,O-гиперсульфата, к примеру, путем диафильтрации. Необязательно стадию N-сульфатирования повторяют до получения степени замещения более чем на 95%, предпочтительно до полного завершения.

Новые производные эпи-К5-N,O-гиперсульфаты, полученные при этом, обычно находятся в виде натриевой соли. Натриевая соль может быть превращена в другую химически или фармацевтически приемлемую соль. Особенно предпочтительны соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммония, (С₁-С₄)-тетраалкиламмония, алюминия и цинка. Наиболее предпочтительны соли натрия, кальция и тетрабутиламмония.

Исходные эпи-К5-N-сульфаты, направляемые на стадию (а) способа настоящего изобретения, происходят из полисахарида К5, предварительно N-деацетилированного, N-сульфатированного практически на 100%, С5-эпимеризованного на 20-60%, предпочтительно на 40-60%, и необязательно деполимеризованного азотистой кислотой, со средним молекулярным весом приблизительно от 1000 до 25000, предпочтительно от 1500 до 25000. Предпочтительно исходный материал представляет собой эпи-К5-N-сульфат со средним молекулярным весом от 10000 до 25000 или НМ эпи-К5-N-сульфат со средним молекулярным весом приблизительно от 1000 до 12000, более предпочтительно от 1000 до 10000, наиболее предпочтительно от 1500 до 8000.

Эпи-К5-N-сульфаты, полученные путем С5-эпимеризации К5-N-сульфатов, хорошо известны в литературе и широко описаны, к примеру, в WO 92/17507, WO 01/72848, WO 98/14425, WO 97/43317 или US 2002/0062019. Их получение путем С5-эпимеризации глюкуронового звена К5-N-сульфата с помощью D-глюкуронил-С5-эпимеразы описано в документах, приведенных выше.

НМ эпи-К5-N-сульфат с содержанием идуроновой кислоты приблизительно 20%, полученный путем N-деацетилирования, N-сульфатирования и С5-эпимеризации фрагмента К5 со средним молекулярным весом 5000, описан в WO 92/17507. Однако такой НМ К5-N-сульфат содержит значительное количество ацетильных групп.

Эпи-К5-N-сульфат с содержанием идуроновой кислоты в 40-60%, особенно предпочтительный в качестве исходного материала, получают путем эпимеризации K5-N-сульфата, практически лишенного ацетильных групп, который, в свою очередь, получают из особенно чистого К5, в частности не содержащего липофильных веществ, описанного в WO 02/068477. В соответствии с предпочтительным выполнением способа при эпимеризации используется К5-N-сульфат, полученный из К5, лишенный липофильных веществ, как тот, что описан в WO 02/068477, а С5-эпимеризация проводится с помощью D-глюкуронил-С5-эпимеразы, выделенной, очищенной и иммобилизованной на твердом носителе, при рН около 7, при температуре примерно 30°С и в течение 12-24 часов, в присутствии, по меньшей мере, одного двухвалентного иона, выбранного из числа кальция, магния, бария и марганца.

НМ эпи-К5-N-сульфаты с более высоким содержанием идуроновой кислоты, в частности 40-60%, предпочтительно 50-55%, - это новые, особенно предпочтительные продукты в качестве исходных материалов для получения НМ производных эпи-К5-N,O-гиперсульфатов.

Вышеуказанные НМ эпи-К5-N-сульфаты получают способом, который характеризуется тем, что К5-N-сульфат подвергается, в любом порядке,

(i) С5-эпимеризации с помощью O-глюкуронил-С5-эпимеразы, выделенной, очищенной и находящейся в растворе или иммобилизованной на твердом носителе, при рН около 7, при температуре примерно 30°С и в течение 12-24 часов, в присутствии, по меньшей мере, одного двухвалентного иона, выбранного из числа кальция, магния, бария и марганца; и

(ii) азотистой деполимеризации, за которой необязательно следует восстановление, обычно с помощью борогидрида натрия.

Выражение "в любом порядке" означает, что способ может выполняться равно как в направлении (i)-(ii), то есть в порядке, приведенном выше, так и в обратном порядке, то есть в направлении (ii)-(i), подвергая К5-N-сульфат сначала реакции азотистой деполимеризации, а затем необязательно восстановлению борогидридом натрия и после этого С5-эпимеризации в изложенных выше условиях. Предпочтительный порядок - в направлении (i)→(ii). Последовательность (ii)-(i) предпочтительно применяется тогда, когда исходят из НМ К5-N-сульфатов со средним молекулярным весом более 4000, предпочтительно около 6000. Например, можно определить количество нитрита натрия, которое из расчета на 1 г эпи-К5-N-сульфата позволяет получить НМ эпи-К5-N-сульфат с молекулярным весом более 4000, предпочтительно не менее 6000, с тем, чтобы получить полезные промежуточные продукты для получения НМ эпи-К5-N,O-гиперсульфатов. В самом деле, в этом случае на стадии (ii) достигается оптимальная степень эпимеризации.

В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, С5-эпимераза подвергается иммобилизации на инертном твердом носителе.

С5-эпимераза, предпочтительно рекомбинантная, выделенная и очищенная, к примеру, согласно Campbell 1994, WO 98/48006, Jin-Ping 2001 или Crawford 2001, подвергается иммобилизации на инертном носителе в присутствии субстрата, то есть в присутствии исходного производного К5-N-сульфата или в присутствии НМ K5-N-сульфата, предпочтительно со средним молекулярным весом более 4000, более предпочтительно не менее 6000. Иммобилизация проводится в соответствии со стандартными методами, например, как описано в WO 01/72848.

Реакция С5-эпимеризации проводится путем пропускания 20-1000 мл 25 мМ раствора Hepes, рН около 7, содержащего 0,001-10 г субстрата (К5-N-сульфата или НМ К5-N-сульфата, предпочтительно с молекулярным весом более 4000, более предпочтительно, по меньшей мере, 6000) и катион, выбранный из числа кальция, магния, бария и марганца в концентрации от 10 до 60 мМ, через колонку, содержащую от 1,2×10⁷ до 3×10¹¹ cpm иммобилизованного фермента, при рН около 7 и температуре примерно 30°С, при скорости пропускания в 30-220 мл/час в течение 12-24 часов, предпочтительно 15-24 часов.

Предпочтительно данный раствор пропускают со скоростью 200 мл/час в течение ночи (15-20 часов). Полученный продукт очищают и отделяют в соответствии с известными методами, например, ультрафильтрации и осаждения этанолом. Полученный при этом продукт состоит либо из эпи-К5-N-сульфата (в этом случае его растворяют в воде и подвергают деполимеризации), либо из НМ эпи-К5-N-сульфата (в таком случае он является конечным продуктом). Степень эпимеризации, что на практике означает количество идуроновых звеньев относительно глюкуроновых, рассчитывают с помощью ¹Н-ЯМР методом, описанным в WO 96/4425.

Реакция азотистой деполимеризации проводится в соответствии с известными методами деполимеризации гепарина, например в соответствии с методами, описанными в ЕР 37319, WO 82/03627, или в соответствии с методом деполимеризации К5-N-сульфата, описанным в ЕР 544592, но исходя из К5-N-сульфата или эпи-К5-N-сульфата, содержащего от 0 до 10%, предпочтительно не более 5% ацетильных групп. Предпочтительно деполимеризации проводится с помощью нитрита натрия и соляной кислоты на эпи-К5-N-сульфате, практически лишенном ацетильных групп, с последующим восстановлением in situ борогидридом натрия.

На практике холодный водный раствор эпи-К5-N-сульфата доводят до кислого значения рН (приблизительно 2) соляной кислотой и обрабатывают на холоду нитритом натрия при постоянной температуре (примерно 4°С) и рН (приблизительно 2), а по окончании деполимеризации (примерно 15-30 минут) раствор нейтрализуют гидроокисью натрия и обрабатывают, опять при температуре примерно 4°С, водным раствором борогидрида натрия. По окончании восстановления (приблизительно 4 часа) излишек борогидрида натрия устраняют соляной кислотой, раствор нейтрализуют гидроокисью натрия и выделяют деполимеризованный (и восстановленный) продукт в соответствии с известными методами, например, путем прямого осаждением этанолом или ацетоном. Продукт, полученный по окончании деполимеризации, может представлять собой либо HM эпи-К5-N-сульфат (в этом случае он является конечным продуктом), либо НМ K5-N-сульфат (в таком случае он непосредственно подвергается С5-эпимеризации, как описано выше, после выделения либо в растворе без предварительного выделения), в частности, если его молекулярный вес составляет более 4000, предпочтительно, по меньшей мере, 6000, или же его утилизируют для получения НМ К5-N,O-гиперсульфата, обладающего антиангиогенной и антивирусной активностью. При надлежащем контроле за реакцией деполимеризации, в частности, используя различные количества нитрита натрия/соляной кислоты, получают НМ К5-N-сульфаты или НМ эпи-К5-N-сульфаты со средним молекулярным весом на всем интервале примерно от 1500 до 12000, предпочтительно от 1500 до 10000, более предпочтительно от 1500 до 7500, который рассчитывают из спектра ¹³С-ЯМР путем интегрирования сигнала, относящегося к атому С2 2,5-ангидроманнитола, и сигнала от аномерного углерода глюкозамина на полисахаридной цепочке.

В соответствии с общим выполнением способа, к примеру, исходя из 1 г эпи-К5-N-сульфата, исходный продукт растворяют в 100-200 мл деионизованной воды и ставят в термостат на 4°С. Затем добавляют такое количество нитрита натрия, чтобы получить нужный молекулярный вес, к примеру, от 2000 до 4000. Таким образом, исходя из эпи-К5-N-сульфата со средним молекулярным весом 20000 при измерении методом HPLC на колонке BioRad BioSil 250 с использованием стандарта гепарина с известным молекулярным весом, нужно будет добавить от 330 до 480 мг нитрита натрия в виде 0,2% водного раствора. Раствор, содержащий эпи-К5-N-сульфат и нитрит натрия, при 4°С доводят до рН 2 добавлением 0,1 N HCl, охлажденного до 4°С. Раствор оставляют на 20-40 минут для протекания реакции с медленным перемешиванием, а затем нейтрализуют с помощью 0,1 N NaOH. Полученный продукт доводят до комнатной температуры и обрабатывают восстановительным реагентом, например борогидридом натрия (250-500 мг растворяют в 50-100 мл воды) и оставляют для протекания реакции на 4-8 часов. Избыток борогидрида натрия удаляют доведением рН до 5-5,5 с помощью 0,1 N HCl и оставляют еще на 2-4 часа. Наконец, раствор нейтрализуют с помощью 0,1 N NaOH и выделяют продукт путем осаждения ацетоном или этанолом после концентрации продукта испарением при пониженном давлении.

Аналогичным образом можно определить количество нитрита натрия, которое, исходя из 1 г К5-N-сульфата или эпи-К5-N-сульфата, позволяет получить НМ K5-N-сульфат или НМ эпи-К5-N-сульфат со средним молекулярным весом от 4000 до 12000, предпочтительно от 4000 до 7500, более предпочтительно от 6000 до 7500.

Полученный при этом НМ эпи-К5-N-сульфат с содержанием идуроновой кислоты от 20 до 60%, предпочтительно от 40 до 60%, более предпочтительно от 50 до 55%, и практически лишенный -NH₂ и N-ацетильных групп, со средним молекулярным весом примерно от 1500 до 12000, предпочтительно от 1500 до 10000, более предпочтительно от 1500 до 7500, а также его химически и фармацевтически приемлемые соли представляют собой новые продукты, применимые в качестве представляющих особый интерес исходных материалов для получения НМ эпи-К5-N,O-гиперсульфатов, но и сами по себе они полезны в качестве активных ингредиентов фармацевтических или косметических композиций и составляют дополнительный аспект настоящего изобретения.

Предпочтительно исходными материалами при получении производных эпи-К5-N,О-гиперсульфатов настоящего изобретения являются производные эпи-К5-N-сульфаты, состоящие из смешанных цепей, из которых, по меньшей мере, 90% соответствуют формуле I:

в которой уроновые звенья на 20-60% состоят из идуроновой кислоты, n - целое число от 2 до 100, предпочтительно от 3 до 100, а соответствующий катион является химически или фармацевтически приемлемым.

Более предпочтительно данные исходные производные эпи-К5-N-сульфаты состоят из смешанных цепей, из которых, по меньшей мере, 90% соответствуют формуле I, в которой уроновые звенья на 40-60% состоят из идуроновой кислоты, n - целое число от 2 до 100, предпочтительно от 3 до 100, а соответствующий катион является химически или фармацевтически приемлемым. Наиболее предпочтительно исходные материалы представляют собой НМ эпи-К5-N-сульфаты, представленные выше, состоящие из смешанных цепей, из которых, по меньшей мере, 90% соответствуют формуле I, в которой уроновые звенья на 20-60%, предпочтительно на 40-60%, более предпочтительно на 50-55% состоят из идуроновой кислоты, n - целое число от 2 до 20, предпочтительно от 3 до 15, а соответствующий катион является химически приемлемым.

На практике данные предпочтительные НМ эпи-К5-N-сульфаты состоят из смешанных цепей, из которых, по меньшей мере, 90% соответствуют формуле I':

в которой уроновые звенья на 20-60%, предпочтительно на 40-60%, более предпочтительно на 50-55% состоят из идуроновой кислоты, q - целое число от 2 до 20, предпочтительно от 3 до 15, а соответствующий катион является химически или фармацевтически приемлемым.

В этом контексте термин "химически" относится к катиону, применяемому при химическом синтезе, типа ионов натрия, аммония, (С₁-С₄)-тетраалкиламмония, или при очистке продукта.

Предпочтительны катионы щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммония, (С₁-С₄)-тетраалкиламмония, алюминия и цинка. Наиболее предпочтительны катионы натрия, к