Способ получения l-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду escherichia, в которой инактивирован ген b2383

Способ получения l-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду escherichia, в которой инактивирован ген b2383

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислот с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена b2383 (ypdD).

Предшествующий уровень техники

Белок B2383 (YpdD) предположительно является компонентом фермента IIa, ферментом I системы ФТС (фосфотрансферазной системы сахаров). ФТС состоит из двух цитоплазматических и энергетически сопряженных белков (срединный компонент фермента I и N-терминальный компонент Hpr) и цепи карбогидратспецифических Ферментов II (С-терминальный компонент фермента IIa), которые катализируют сопутствующие процессы транслокации и фосфорилирования карбогидратов. Процессы потребления и фосфорилирования сопряжены, делая систему ФТС связующим звеном между процессами поглощения и метаболизма сахаров. Фосфоенолпируват является первичным донором фосфата. Фосфоенолпируват передает фосфатную группу по пути сигнальной трансдукции ферменту 1 (E1), который, в свою очередь, переносит на гистидин белка, HP. Следующий этап в системе включает сахар-специфический мембраносвязанный комплекс, фермент 2 (EII), который переносит сахар в клетку. Комплекс включает пермеазу сахара, которая катализирует транспортные реакции. EII обычно подразделяется на три различных домена, EIIA, EIIB, и EIIC (Aboulwafa M. et al., Molecular Microbiology, 48(1), 131-141 (2003)).

Более чем 20 карбогидратов могут быть транспортированы в бактериальную клетку с помощью системы фосфоенолпируват : карбогидратфосфотрансферазы (ФТС), которая широко распространена среди бактерий. Эти свойства ФТС обеспечивают бактериальную клетку интегрированной системой, которая гарантирует оптимальное усвоение карбогидратов в комплексном микроокружении.

Однако в настоящее время отсутствуют сообщения об инактивации гена b2383 (гена ypdD) для целей получения L-аминокислот.

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислоты с использованием указанных штаммов.

Данные цели были достигнуты путем обнаружения того факта, что инактивация гена b2383 может повысить продукцию L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии - продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, при этом указанная бактерия была модифицирована таким образом, что экспрессия гена b2383 в этой бактерии ослаблена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом экспрессия гена b2383 ослаблена путем инактивации гена b2383.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя:

- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде с целью продукции и выделения L-аминокислоты в культуральную жидкость, и

- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматических L-аминокислот и неароматических L-аминокислот.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.

1. Бактерия согласно настоящему изобретению

Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, обладающая способностью к продукции L-аминокислоты, при этом бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена b2383 у этой бактерии ослаблена.

Согласно настоящему изобретению термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.

Термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-аминокислоты» в качестве применяемого здесь термина также означает бактерию, способную продуцировать и вызывать накопление любой L-аминокислоты в питательной среде в больших количествах по сравнению с диким типом или родительским штаммом Е. coli, таким как штамм Е. coli К-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л. Термин «L-аминокислота» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Термин «ароматическая L-аминокислота» включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. Предпочтительными, в частности, являются L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Семейство Enterobacteriaceae включает бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnologylnformation) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpos/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea, предпочтительна.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, но не ограничивается только ею, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были заново классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Термин «бактерия, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии экспрессия гена b2383 ослаблена», означает, что бактерия модифицирована таким образом, что модифицированная бактерия содержит меньшее количество белка В2383 по сравнению с немодифицированной бактерией или что модифицированная бактерия становится неспособной синтезировать белок В2383.

Термин "инактивация гена b2383" означает, что модифицированный ген кодирует полностью нефункциональный белок. Возможно также, что модифицированный участок ДНК неспособен нормально экспрессировать ген в результате делеции части гена, сдвига рамки считывания гена, введения missense/nonsense мутации(й) или модификации прилегающей к гену области в результате включения последовательностей, контролирующих экспрессию гена, таких как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, сайты связывания рибосомы и т.д.

Уровень экспрессии гена можно оценить путем измерения количества мРНК, транскрибируемой с гена, с использованием ряда известных методов, включая блотинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР и подобные им. Количество белка, кодируемого геном, можно измерить известными методами, включая SDS-PAGE с последующим иммуноблотингом (Вестерн блотингом) и подобными им.

Ген b2383 (синонимы - ypdD, fryA) кодирует белок В2383 (синонимы: предположительный N-терминальный компонент Hpr семейства PTS, средний компонент фермента I, С-терминальный компонент фермента IIa, FryA, YpdD). Ген b2383 (нуклеотиды комплементарны нуклеотидам с номерами с 2500012 по 2502507 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2; gi: 49175990; в базе данных GenBank; SEQ ID NO: 1) располагается между генами ypdC и ypdE на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена b2383 и аминокислотная последовательность кодируемого им белка В2383 приведена в Списке последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO: 1) и 2 (SEQ ID NO: 2) соответственно.

Поскольку в последовательностях ДНК разных родов или штаммов семейства Enterobacteriaceae могут существовать некоторые различия, нуклеотидная последовательность гена b2383, подлежащего инактивации, не ограничивается последовательностью гена, приведенной в SEQ ID No: 1, но также может включать последовательности генов, гомологичных последовательности, приведенной в SEQ ID No: 1. Поэтому вариант белка, кодируемого геном b2383, может быть представлен белком с гомологией не менее 80%, предпочтительней не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности, кодируемой геном b2383 и приведенной в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO.2), до тех пор, пока активность белка В2383 сохраняется на том же уровне, как до инактивации.

Кроме того, ген b2383 может быть представлен вариантом, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO: 1), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, в жестких условиях, при условии, что указанный вариант кодирует функциональный белок таким, каким он был до инактивации. "Жесткие условия" включают такие условия, при которых образуются специфические гибриды, например гибриды, имеющие гомологию 60%, предпочтительней не менее чем 70%, более предпочтительней не менее чем 80% и наиболее предпочтительней не менее чем 90%, а неспецифические гибриды, например гибриды, имеющие меньшую перечисленной выше гомологию, не образуются. Например, демонстрацией жестких условий может служить однократная или многократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная отмывка при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при температуре 60°С. Длина зонда может быть выбрана соответствующим образом в зависимости от условий гибридизации и обычно варьирует в диапазоне от 100 п.о. до 1 тыс.п.о.

Инактивация указанного гена может быть выполнена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработки нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, разрушение гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83) и (Datsenko K.A. and Warmer B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), называемого также "Red-зависимая интеграция".

Активность белка В2383 может быть измерена методами, описанными, к примеру, ранее (Aboulwafa M. et al., Molecular Microbiology, 48(1), 131-141 (2003)).

Методами приготовления плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерии - продуценты L-аминокислоты

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, которая модифицирована таким образом, что в ней ослаблена экспрессия гена b2383, может быть использована бактерия, способная продуцировать как ароматические, так и неароматические L-аминокислоты.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации гена b2383 в бактерии, уже обладающей способностью продукцировать L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению, может быть получена путем придания бактерии, в которой ген b2383 уже инактивирован, способности продуцировать L-аминокислоты.

Бактерии - продуценты L-треонина

Примеры родительских штаммов для выведения бактерии - продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патент США 5175107, патент США 5705371), Е. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (патент США 5631157), Е. coli NRRL-21593 (патент США 5939307), Е. coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), Е. coli FERM BP-3519 and FERM ВР-3520 (патент США 5376538), Е. coli MG442 (Гусятинер и др. Генетика (в России), 14, 947-956 (1978)), Е. coli VL643 and VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, а также способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая придает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, с существенно десенсибилизированной регуляцией треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Штамм Е. coli ВКПМ В-5318 (Европейский патент ЕР 0593792В) согласно настоящему изобретению также может быть использован в качестве родительского штамма для выведения бактерии - продуцента L-треонина. Штамм В-5318 является прототрофным в отношении изолейцина, а регуляторная область треонинового оперона в плазмиде pVIC40 заменена на репрессор лямбда-фага С1, чувствительный к температуре, и PR промотор. Штамм ВКПМ В-5318 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером VKPM В-5318.

Желательно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких генов, перечисленных ниже:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок; и

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу);

Ген thrA, кодирующий аспартокиназагомосериндегидрогеназу I Escherichia coli был расшифрован (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентраным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrA расположен между генами thrL и thrB на хромосоме штамма Е. coli К-12. Ген thrB, который кодирует гомосеринкиназу Escherichia coli, был расшифрован (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrB расположен между генами thrA и thrC на хромосоме штамма Е. coli К-12. Ген thrC, который кодирует треонинсинтазу Escherichia coli, был расшифрован (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в базе данных GenBank). Ген thrC расположен между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ на хромосоме штамма Е. coli К-12. Все три гена функционируют как отдельный оперон треонина. Для усиления экспрессии треонинового оперона из него желательно удалить область аттенуатора, который влияет на транскрипцию (заявки РСТ WO 2005/049808, WO 2003/097839).

Мутантный ген thrA, который кодирует аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, а также гены thrB и thrC, могут быть получены в составе одного оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая присутствует в штамме-продуценте треонина Е. coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.

Ген rhtA расположен на 18-й минуте хромосомы Е. coli рядом с glnHPQ опероном, который кодирует компоненты системы глутаминового транспорта. Ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541, gi: 440181 в базе данных GenBank) и расположен между генами рехВ и ompX. Элемент, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был обозначен как ген rhtA (rht: устойчивость к гомосерину и треонину). Также было показано, что мутация rhtA23 является заменой нуклеотидного остатка G на нуклеотидный остаток А в позиции 1 относительно стартового кодона ATG (ABSTRACTS of the 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with the Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No.457, EP 1013765 A).

Ген asd E. coli уже описан (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi: 161313 07 в базе данных GenBank) и может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5:185) с использованием праймеров, сконструированных на основе нуклеотидной последовательности гена. Гены asd от других микроорганизмов могут быть получены подобным образом.

Ген aspC Е. coli тоже уже описан (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi: 16128895 в базе данных GenBank) и может быть получен методом ПЦР. Гены aspC от других микроорганизмов могут быть получены подобным образом.

Бактерии - продуценты L-лизина

Примеры бактерий - продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутантов, обладающих устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично отменяется, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются только ими, оксализин, лизингидроксамат, S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (AEC), γ-метиллизин, α-хлорокапролактам и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, обычными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli АJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах снижена чувствительность аспартокиназы к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC 196 может быть использован в качестве бактерии - продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был выведен путем придания штамму W3110, производному от штамма Escherichia coli К-12, устойчивости к АЕС. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ 13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 6 декабря, 1994 г. и получил инвентарный номер PERM P-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 29 сентября 1995 г., и штамм получил инвентарный номер PERM BP-5252 (смотри патент США 5827698).

Примеры родительских штаммов для выведения бактерий - продуцентов L-лизина согласно настоящему изобретению включают штаммы, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина, усилена. Примеры ферментов, участвующих в биосинтезе L-лизина, включают, но не ограничиваются только ими, дигидродипиколинатсинтазу (DapA), аспартокиназу (LysC), дигидродипиколинатредуктазу (DapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (LysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США 6040160), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), аспартатполуальдегиддегидрогеназу (asd) и аспартазу (AspA) (Европейский патент ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, участвующего в эффективном использовании энергии (суо) (Европейский патент ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (PntAB) (патент США 5830716), гена ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390), или комбинации этих генов.

Примеры родительских штаммов для выведения бактерий - продуцентов L-лизина согласно настоящему изобретению включают штаммы, имеющие сниженную или элиминированную активность фермента, который катализирует реакцию образования компонента, отличного от L-лизина, путем ответвления от пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализирует реакцию образования компонента, отличного от L-лизина, путем ответвления от пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5827698) и пируват-малаткарбоксилазу/малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).

Бактерии - продуценты L-цистеина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-цистеина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е. coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белки, участвующие в процессе секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е. coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патентная заявка Японии JP 11155571 А2); штамм Е. coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (заявка РСТ WO 0127307 А1) и им подобные.

Бактерии - продуценты L-лейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерий - продуцентов L-лейцина, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е. coli, устойчивые к лейцину (например штамм 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121)) или к аналогам лейцина, включающим, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (патент Японии 62-34397В и патентная заявка Японии 8-70879А); штаммы Е. coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ WO 96/06926; штамм Е. coli H-9068 (патентная заявка Японии JP8-70879A), и им подобные.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, участвующих в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).

Бактерии - продуценты L-гистидина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-гистидина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е. coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); Е. coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); Е. coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4388405); Е. coli H-9342 (PERM ВР-6675) и Е. coli H-9343 (PERM ВР-6676) (патент США 6344347); Е. coli H-9341 (PERM ВР-6674) (Европейский патент ЕР 1085087); Е. coli AI80/pFM201 (патент США 6258554), и им подобные.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-гистидина, согласно настоящему изобретению также включают штаммы, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина, усилена. Примеры ферментов биосинтеза L-гистидина включают АТФ-фосфорибозилтрансферазу (HisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (HisI), фосфорибозил-АТФ-пирофосфогидролазу (HisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (HisA), амидотрансферазу (HisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (HisC), гистидинолфосфатазу (HisB), гистидинолдегидрогеназу (HisD), и так далее.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI) угнетаются L-гистидином, и поэтому способность продуцировать L-гистидин может быть также эффективно усилена путем введения мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в фермент фосфорибозилтрансферазу (HisG) (патенты РФ 2003677 и 2119536).

Отдельные примеры штаммов, обладающих способностью продуцировать L-гистидин, включают штаммы Е. coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, несущий ДНК, кодирующую ферменты биосинтеза L-гистидина (патентная заявка Японии JP 56-005099 А), штамм Е. coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ-7270, патент РФ 2119536), и так далее.

Бактерии - продуценты L-глутаминовой кислоты.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как Е. coli VL334thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е. coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофным по L-изолейцину и L-треонину и имеет мутации в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). Аллель гена thrC дикого штамма переносили методом основной трансдукции с использованием бактериофага Р1, растущего на клетках штамма дикого типа Е. coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотрофный по L-изолейцину VL334thrC⁺ (ВКПМ В-8961). Этот штамм способен продуцировать L-глутаминовую кислоту.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, в которых экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты, усилена. Примеры ферментов, участвующих в биосинтезе L-глутаминовой кислоты, включают глутаматдегидрогеназу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтетазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу, пируваткарбоксилазу, пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобисфосфатальдолазу, фосфофруктокиназу и глюкозофосфатизомеразу.

Примеры штаммов, модифицированных так, что экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, усилена/ы, включают штаммы, описанные в Европейских заявках ЕР 1078989 А, ЕР 955368 А, и ЕР 952221 А.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению также включают в себя штаммы со сниженной или элиминированной активностью фермента, который катализирует синтез компонента, другой чем L-глутаминовая кислота, но ответвляющийся от пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, ацетогидроксикислуюсинтазу, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, дефицитные по активности фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеющие сниженную активность фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно они включают нижеследующие штаммы:

E. coli W3110sucA::Kmr

Е. coli AJ12624 (FERM ВР-3853)

Е. coli АJ12628 (FERM BP-3854)

Е. coli АJ12949 (FERM BP-4881)

Е. coli W3110sucA::Kmr является штаммом, полученным путем разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (в дальнейшем именуемого как ген "sucA)» в штамме Е. coli W3110. Этот штамм полностью дефицитен по α-кетоглутаратдегидрогеназе.

Другие примеры бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты включают штаммы, которые принадлежат к роду Escherichia и обладают устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты. Эти штаммы могут быть также лишены активности фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы и включают, к примеру, штаммы Е. coli АJ13199 (FERM ВР-5807) (патент США 5908768), FFRM Р-12379, который к тому же имеет низкую способность расщеплять L-глутаминовую кислоту (патент США 5393671); АJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6110714) и им подобные.

Примеры бактерий - продуцентов L-глутаминовой кислоты включают мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы и могут быть получены, как описано выше. Такие штаммы включают штамм Pantoea ananatis AJ13356. (патент США 6331419). Штамм Pantoea ananatis AJ13356 был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 19 февраля, 1998 года и получил инвентарный номер FERM Р-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 11 января 1999 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 лишен активности фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы в результате разрушения субъединицы αKGDH-E1 гена sucA. При получении вышеописанный штамм был идентифицирован как штамм Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Однако в последнее время на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S pRNA он был переклассифицирован как принадлежащий к виду Pantoea ananatis. Хотя штамм AJ13356 был депонирован в вышеупомянутый депозитарий как штамм Enterobacter agglomerans, в целях данной цпецификации они описываются как штаммы Pantoea ananatis.

Бактерии - продуценты L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-фенилаланина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются только ими, штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы Е. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКПМ В-8197); Е. coli HW1089 (АТСС 55371) несущий ген рНеА34 (патент США 5354672); Е. coli MWEC101-b (KR8903681); Е. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952). Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы штаммы Е, coli К-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), Е. coli К-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), Е. coli К-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и Е. coli К-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ] названный AJ 12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР 488424 В1). Кроме того, могут использоваться бактерии - продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с усиленной активностью белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1 соответственно).

Бактерии - продуценты L-триптофана

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-триптофана, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е. coli JP 4735/pMU3028 (DSM10122) и JP 6015/pMU91 (DSM10123), лишенными фермента триптофанил-тРНК-синтетаза, кодируемого мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е. coli SV164 (pGH5) с аллелем serA, кодирующим фосфоглицератдегидрогеназу со снятым ингибированием серином по типу обратной связи и аллелем trpE, кодирующим антранилатсинтазу со снятым ингибированием триптофаном по принципу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е. coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), лишенные фермента триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, в котором усилена способность продуцировать фосфоенолпируват (заявка РСТ WO 9708333, патент США 6319696) и подобные им могут быть использованы.

Ранее было установлено, что ген yddG, кодирующий белок мембраны, который не участвует в пути биосинтеза никакой L-аминокислоты, придает микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аминокислотным аналогам, при условии если аллель дикого штамма этого гена амплифицировать на мультикопийном векторе в микроорганизме. Помимо этого ген yddG может усилить продукцию L-фенилаланина или L-триптофана при условии, если ввести дополнительные копии в клетки соответствующих штаммов-продуцентов (заявка РСТ WO 03044192). Поэтому желательно, чтобы бактерия - продуцент L-триптофана была в дальнейшем модифицирована таким образом, чтобы иметь усиленную экспрессию открытой рамки считывания yddG.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-триптофана, согласно настоящему изобретению также включают штаммы, в которых усилены одна или более активностей ферментов, выбранных из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы и триптофансинтазы. Ферменты антранилатсинтаза и фосфоглицератдегидрогеназа оба подвержены ингибированию по типу обратной связи со стороны L-триптофана и L-серина, поэтому в эти ферменты можно вводить мутацию, десенсибилизирующую ингибирование по типу обратной связи. Отдельные примеры штаммов, имеющих такую мутацию, включают штамм Е. coli SV164, который несет десенсибилизированную антранилатсинтазу, и штамм-трансформант, полученный путем введения в штамм Е. coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), который содержит мутантный ген serA, кодирующий фермент фосфоглицератдегидрогеназу с десенсибилизированной регуляцией по типу обратной связи.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий - продуцентов L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых введен опреон триптофана, который содержит ген, кодирующий фермент антранилатсинтазу с десенсибилизированной регуляцией по типу обратной связи (патентные заявки Японии JP 57-71397 А и JP 62-244382 А, патент США 4371614). Кроме того, способность п