Иммунотерапия злокачественных заболеваний в-клеток и аутоиммунных заболеваний с применением конъюгированных и неконъюгированных антител, комбинаций антител и слитых белков

Иммунотерапия злокачественных заболеваний в-клеток и аутоиммунных заболеваний с применением конъюгированных и неконъюгированных антител, комбинаций антител и слитых белков

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическому способу лечения злокачественных заболеваний, связанных с B-клетками, в частности к способу лечения агрессивных лимфом, которые не являются лимфомами Ходжкина (неходжкинские лимфомы). В частности, данное изобретение направлено на разработку способов лечения и диагностики заболеваний, связанных с B-клетками, заболеваний, связанных с T-клетками, или аутоиммунных заболеваний у млекопитающих путем введения млекопитающим терапевтических композиций, для которых не осуществляется предварительное введение дозы антитела, не меченного радиоактивной меткой.

Уровень техники

B-клеточные лимфомы экспрессируют поверхностные антигены, которые, как было показано, являются хорошими мишенями для терапии моноклональными антителами (Mab). Антитела, либо применяемые сами по себе (простые антитела), либо в сочетании с химиотерапией, могут быть конъюгированы с токсинами или с радионуклидами для радиоиммунотерапии (RAIT). Антитело, меченное радиоактивной меткой, вводят после (Kaminski M.S. et al., J. Clin. Oncol.19: 3918-3928, 2001) или совместно (Press O.W. et al., New Engl. J. Med. 329: 1219-24, 1993) с немеченым антителом для улучшения распределения вводимой дозы. Большинство исследователей используют радиоактивно меченное антитело мыши в сочетании с немеченым антителом, которое является мышиным или химерным (гибридным). С точки зрения токсикологии считалось выгодным метить радиоактивной меткой мышиное антитело из-за меньшего периода его полувыведения по сравнению с химерным антителом. Моноклональное антитело с более продолжительным периодом полувыведения дает более длительное время пребывания радиоактивного иммуноконъюгата в крови и костном мозге и, вероятно, таким образом, порождает большую токсичность. Поскольку антитело само по себе почти не вызывает токсичности, немеченые антитела как мышиное, так и химерное, используют для улучшения распределения дозы, как утверждается, за счет насыщающего антигена на нормальных клетках и тканях тела (cf. Kaminski, US Patent No. 5595721; Wiseman et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39: 181-194, 2001).

Применение моноклональных антител в целевой радиотерапии раковых заболеваний (радиоиммунотерапия; RAIT) привело к замечательным клиническим результатам в случае гематологических заболеваний, таких как неходжкинская лимфома (NHL). В настоящее время в попытках минимизации системной токсичности циркулирующих радионуклидов и активации опухолей к действию радиации проверяются новые стратегии. Первая из упомянутых задач решается за счет предварительного нацеливания, а вторая путем комбинированной терапии с использованием лекарственных средств для повышения чувствительности к действию радиоактивного излучения. См. Govindan, S.V et al., Current Trends, Pharmaceutical Science and Technology Today3: 90-98, 2000.

Противоопухолевая активность RAIT имеет место в основном благодаря сопутствующей радиоактивности присоединенной к антителу радиоактивной метки, которая испускает непрерывные, экспоненциально уменьшающиеся порции излучения низкой интенсивности при внесении дозы извне. Четыре продукта, содержащие радиоактивно меченные антитела, были доведены до состояния коммерческих препаратов для применения в радиоиммунотерапии NHL. Эти препараты включают в себя ¹³¹I-тозитумомаб (Bexxar™), ⁹⁰Y-ибритумомаб тиуксетан (Zevalin™), ⁹⁰Y-эпратузумаб (hLL2) и ¹³¹I-Lym-1. Более подробный обзор указанных продуктов см. Goldenberg D.M., Critical Reviews in Oncology/Hematology39: 195-201, 2001, и Goldenberg D.M., J. Nucl. Med. 43: 693-713, 2002.

Как Bexxar (Corixa Corp., Seattle, WA), так и Zevalin (IDEC-Y2B8; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA) являются мышиными моноклональными антителами (Mab), направленными против антигена CD20, который экспрессируется на поверхности нормальных и злокачественных B-лимфоцитов. Bexxar применяется как мышиное моноклональное антитело IgG2a с добавлением «холодного» (не содержащего радиоактивных веществ) мышиного антитела, тогда как Zevalin содержит меченое мышиное антитело, а также добавленный к продукту холодный человеческий/мышиный химерный ритуксимаб (Rituxan™, IDEC-Genentech). Для улучшения нацеливания на опухоль оба продукта предусматривают предварительную терапию дозированным холодным антителом, которая включает в себя 1-ч вливание 450 мг немеченого антитела Bexxar и 4-6 ч вливание 450 мг ритуксимаба с Zevalin. Оба продукта вызывают более высокую и более продолжительную ответную реакцию по сравнению с простыми антителами, но, помимо этого, они обладают ограничивающей дозу токсичностью, преимущественно миелотоксичностью. Zevalin был утвержден Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами (FDA) для лечения рецидивирующей низкоуровневой или измененной B-клеточной неходжкинской лимфомы. Радиоактивно меченному анти-CD-20-моноклональному антителу должна предшествовать доза холодных антител, чтобы оптимизировать локализацию на опухоли. Фактически в случае введения предварительной дозы характерные числа локализации для поглощения Zevalin ¹¹¹индий отдельными участками опухоли падают с 78% до 15% (Wiseman et al., ibid).

Эпратузумаб (⁹⁰Y-эпратузумаб) представляет собой гуманизированное антитело IgG₁, направленное против анти-CD22-антигена. Антиген быстро интернализуется при связывании антитела. Сообщалось, что простое антитело эффективно как при фолликулярной, так и при значительной диффузной B-клеточной лимфоме (Leonard J.P. et al., Epratuzumab (hLL2, anti-CD22 humanized monoclonal antibody) is an active and well-tolerated therapy for refractory/relapsed diffuse large B-cell non-Hodgkin's lymphoma (NHL), Blood (Suppl) 96:578a [abstr. 2482], 2000; Press O.W. et al., Immunotherapy of Non-Hodgkin's Lymphomas, Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program), p. 221-40, 2001). Не ожидается, что эпратузумаб вызывает увеличение количества человеческих антител против человеческих антител (HAHA), что делает его пригодным для повторного дозирования. Исходные мышиные антитела mLL2 помечены ¹³¹I, причем они эффективны в отношении разнообразных подтипов B-клеточных лимфом (Linden O. et al. Clin. Cancer Res.5:3287s-3291s, 1999). После интернализации антитело, меченное ¹³¹I, дегалогенируется, и радионуклид выделяется из клетки. Радиоактивные металлы, такие как иттрий, удерживаются в клетке при интернализации (Sharkey R.M., et al. Cancer Immunol. Immunother.44:179-88, 1997). Более короткий физический период полураспада ⁹⁰Y в определенной степени компенсирует более длинный период полувыведения эпратузумаба и обеспечивает целесообразность их сочетания.

RAIT, как правило, назначают в виде единичного вливания. Однако у подхода, связанного с разделением радиоиммунотерапии на несколько порций, существуют теоретические преимущества, т.к. разделение улучшает ситуацию с неоднородностью поглощенной дозы, как подчеркнуто в O'Donoghue J.A., Dosimetric Principles of Targeted Radiotherapy, в Radioimmunotherapy of Cancer, A.R. Fritzberg (ed.), Marcel Dekker, Inc., 1-20, New-York, Basel, 2000. Помимо этого, существуют экспериментальные данные, подтверждающие, что терапевтический эффект может быть улучшен путем разделения большого однократного введения меченого антитела на ряд более мелких введений (Schlom J. et al. J. Natl. Cancer Inst.82:763-71, 1990). Подходы, включающие в себя два вливания, а также многократные вливания, были изучены клинически с использованием мышиных антител (DeNardo G.L., et al. Cancer Biother. Radiopharm.13:239-54, 1998; Vose J.M., et al. J. Clin. Oncol.18:1316-23, 2000).

Сообщалось о внутриопухолевой изменчивости в отношении экспрессии антигена CD22. Было найдено, что в свежих образцах опухолей пяти пациентов 52-89% клеток лимфомы содержат антиген для анти-CD22-Mab HD6 (Press O.W. et al. Cancer Res. 49:4906-12, 1989). Одно из заявленных преимуществ радиоиммунотерапии с использованием источников β-излучения с широким диапазоном заключается в их способности убивать антиген-отрицательные клетки опухоли, которые находятся в непосредственной близости от целевых клеток. Путем определения величины экспрессии антигена клетками опухоли перед проведением терапии можно изучить клиническую актуальность данной концепции при назначении радиоиммунотерапии с применением ⁹⁰Y-меченного эпратузумаба против CD22.

Для подтверждения теоретических преимуществ разделения дозы на порции были предприняты исследования и опубликованы экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу этого. Данные исследования были направлены на изучение осуществимости разделенной на порции радиоиммунотерапии с использованием радиоактивно меченного гуманизированного антитела. Было найдено, что после предварительного приема 100 мг гуманизированного Mab CD22, т.е. эпратузумаба, меченного ¹¹¹In для дозиметрических целей, последующие разделенные на порции дозы эпратузумаба, меченного ⁹⁰Y, при величине каждой порции до 7,5 мКи/м², раз в неделю в течение периода до 2-3 недель приводят к приемлемой и эффективной радиоиммунотерапии (Linden et al., Cancer Biother Radiopharm 2002; 17:490 [abstract 47]). Хотя эти клинические исследования и предполагают, что разделенная на порции терапия радиоиммуноконъюгатов осуществима, однако не было проведено сравнение с введением высокой однократной дозы радиоиммуноконъюгата с точки зрения безопасности и эффективности. Поскольку первая «дозиметрическая» доза с ¹¹¹In содержала 100 мг антитела и каждая последующая инъекция также содержала дозу этого простого антитела, то также было невозможно определить, не вызывают ли эти дозы, при общем количестве эпратузумаба не менее 300 мг, эффект предварительного введения дозы, как предполагалось в других цитированных исследованиях, включающих антитела CD20. Следовательно, из данных исследований невозможно было понять, является ли необходимым для подобной радиоиммунотерапии любое введение предварительной дозы, в особенности с антителами CD22.

В настоящем изобретении в противоположность другим опубликованным исследованиям и патенту Каминского (Патент Соединенных Штатов № 5595721), было обнаружено, что есть возможность не применять введение предварительной дозы для насыщения антигенных участков нормальных тканей и селезенки, как это делалось в предыдущей технике. Конкретно описанное здесь изобретение показывает, что нет необходимости во введении высокой предварительной дозы антитела, как это было принято в предыдущем уровне техники.

Сущность изобретения

Соответственно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы разработать способы лечения заболеваний у млекопитающих путем введения терапевтической композиции, для которой не осуществляется предварительное введение не меченного радиоактивной меткой антитела, фрагмента или слитого белка.

Помимо этого, цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы сделать упомянутые выше композиции не только простыми и легкими для применения, но к тому же сделать так, чтобы они сами по себе оставались терапевтически активными и имели сходную степень эффективности, не имея в своем составе высоких доз простых антител, воздействующих на опухоль.

Еще одной целью изобретения является разработка способов, которые более эффективны в лечении агрессивной неходжкинской лимфомы, в противоположность предыдущей технике, которая давала результаты только для неактивных форм лимфомы.

Эти и другие цели настоящего изобретения достигнуты в соответствии со способом реализации настоящего изобретения путем предоставления способа лечения заболевания у млекопитающих, включающего в себя одновременное или последовательное введение млекопитающим терапевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и, по меньшей мере, одно конъюгированное антитело или его фрагмент, или слитый белок конъюгированного антитела или его фрагмент, и при этом не осуществляется введение предварительной дозы не меченных радиоактивной меткой антитела, фрагмента или слитого белка. Неконъюгированное антитело, фрагмент или слитый белок необязательно добавляют к конъюгированному антителу, фрагменту или слитому белку в качестве поддерживающей терапии для того, чтобы опухолевым клеткам не удалось избежать роли мишени для основной терапии.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на способ лечения таких заболеваний, как злокачественные заболевания, связанные с B-клетками. Кроме этого упомянутый способ пригоден для лечения аутоиммунных заболеваний, а также злокачественных заболеваний, связанных с T-клетками.

В другом предпочтительном варианте осуществления конъюгированные и неконъюгированные антитела, фрагменты и слитые белки согласно изобретению могут быть нацелены на антиген, выбранный из группы, состоящей из CD3, CD4, CD5, CD8, CD11c, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, Ia, HMI.24, HLA-DR, тенасцина, MUC1 и антигенов, ассоциированных с опухолями B-клеток, включая антигены сосудистого эндотелия, такие как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и плацентарный фактор роста (PIGF). В смежных воплощениях конъюгированные и/или неконъюгированные антитела, фрагменты или слитые белки согласно изобретению могут быть одинаковыми или различными. Такие антитела могут быть также человеческими, мышиными, химерными, приматизированными или гуманизированными. Более того, эти антитела, фрагменты или слитые белки могут быть выбраны из группы, состоящей из интактных IgG, F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, scFvs, диантител, триантител или тетраантител и могут сочетаться, по меньшей мере, с одним терапевтическим средством.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, как описано выше, предложен способ, согласно которому пациенты из числа млекопитающих, таких как человек, а также домашние или сопутствующие человеку животные, подвергаются лечению одним или несколькими антителами, сопряженными с одним или несколькими терапевтическими средствами, выбранными из группы, состоящей из лекарственного средства, токсина, иммуномодулятора, хелатообразователя, соединений бора, фотодинамического агента и радионуклидов.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления терапевтическая композиция содержит слитый белок или упомянутое сочетание антител или антител с иммуномодуляторами. Объединенные антитела могут включать в себя антитела против различных антигенов, а также антитела против различных эпитопов одного и того же антигена.

Настоящее изобретение предполагает упомянутый выше способ, в котором конъюгированное или неконъюгированное антитело представляет собой моноклональное антитело против CD22, которое вводят млекопитающему парентерально при предпочтительной дозировке 20-600 миллиграммов белка на дозу, более предпочтительно 20-150 миллиграммов белка на дозу и наиболее предпочтительно 20-100 миллиграммов белка на дозу. Дополнительно млекопитающее может получать антитело против CD22 в виде повторного парентерального введения предпочтительно 20-150 миллиграммов белка на дозу и более предпочтительно 20-100 мг белка на дозу. Важно осознавать, что такие дозы даются в качестве действующих терапевтических доз, и не требуется какого бы то ни было введения предварительной дозы как с целью улучшения нацеливания на опухоль, так и для дозиметрических целей, как это делалось ранее, например, Juweid et al., Clin. Cancer Res. 5:3292s-3303s, 1999 (где требовалась предварительная доза 50 мг CD22-Mab, сопряженного с ¹¹¹In или другим диагностическим изотопом). В этих исследованиях не было предпринято попыток добиться того, чтобы радиоиммуноконъюгат с различными белковыми дозами антитела был эффективен непосредственно, без режима введения предварительной дозы.

В другом предпочтительном варианте осуществления способ лечения заболевания млекопитающих включает в себя введение млекопитающему терапевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и полиспецифическое поливалентное антитело, фрагмент или конъюгат слитого белка, который связывается, по меньшей мере, с одним целевым антигеном, а также терапевтическое средство, причем не осуществляется предварительное введение дозы антитела, не меченного радиоактивной меткой.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления способ лечения заболевания млекопитающих включает в себя

(a) введение млекопитающему композиции, которая содержит полиспецифическое поливалентное антитело, фрагмент или слитый белок, который связывается, по меньшей мере, с одним целевым антигеном;

(b) необязательно применение очищающего средства, чтобы дать возможность композиции вывести из циркуляции нелокализованные антитела; и

(c) введение млекопитающему фармацевтически эффективного количества терапевтического конъюгата, который связывается с полиспецифическим поливалентным антителом, фрагментом или слитым белком

и при этом не осуществляется предварительное введение дозы антитела, не меченного радиоактивной меткой.

Прочие цели, отличительные особенности и преимущества настоящего изобретения станут ясны из следующего подробного описания и приложенной формулы изобретения.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Если не указано иначе, употребление единственного числа означает «один или более».

1. Определения

В следующем ниже описании используется ряд терминов, причем приведенные ниже определения призваны облегчить понимание настоящего изобретения.

Термин неходжкинская лимфома (NHL) относится к семейству заболеваний, которое включает в себя лимфомы лимфатических узлов, селезенки, других органов и часто костного мозга. Существует, по меньшей мере, 30 различных типов NHL. Два общих типа представляют собой фолликулярную лимфому (низкой степени или неактивную) и агрессивную, диффузную, крупноклеточную лимфому (промежуточной или высокой степени).

Термин антитело в рамках настоящего изобретения относится к полноразмерной (т.е. появившейся естественным путем или образовавшейся в результате процесса рекомбинации фрагмента нормального гена иммуноглобулина) молекуле иммуноглобулина (например, антителу IgG) или к части молекулы иммуноглобулина, проявляющей иммуноглобулиновую активность, такой как фрагмент антитела.

Фрагмент антитела представляет собой часть антитела, такую как F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, sFv и т.п. Независимо от структуры фрагмент антитела связывается с тем же самым антигеном, который опознается интактным антителом. Например, фрагмент анти-CD22-моноклонального антитела связывается с эпитопом CD22. Термин «фрагмент антитела» включает в себя также любой синтетический белок или белок, полученный с помощью генной инженерии, который действует как антитело при связывании со специфическим антигеном для формирования комплекса. Например, фрагменты антитела включают в себя выделенные фрагменты, состоящие из вариабельных областей, такие как фрагменты «Fv», состоящие из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей молекул рекомбинантных одноцепочечных полипептидов, в которых тяжелые и легкие вариабельные области связаны пептидным линкером («белки scFv»), а также минимальные опознающие фрагменты, состоящие из остатков аминокислот, которые имитируют гипервариабельную область.

Простое или холодное антитело в общем представляет собой целостное антитело, которое не сопряжено (не конъюгировано) с терапевтическим средством. Это происходит потому, что Fc-часть молекулы антитела обеспечивает такие функции эффектора, как связывание комплемента и ADCC (зависимая от антител клеточная цитотоксичность), т.е. функции, запускающие механизмы, которые могут приводить к лизису клеток. Однако возможно, что Fc-часть не потребуется для реализации терапевтической функции с приведением в действие других механизмов, таких как апоптоз. Кроме этого простые антитела представляют собой антитела, не меченные радиоактивной меткой, которые подразумевают как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также определенные рекомбинантные антитела, такие как приматизированные антитела, химерные, гуманизированные или человеческие антитела.

Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит вариабельные области, включая участки, определяющие комплементарность (CDR) антитела, характерного для одного вида живых существ, предпочтительно антитела грызунов, в то время как константные области молекулы антитела являются производными соответствующих областей человеческого антитела. Для применения в ветеринарии константные области химерного антитела могут происходить из антител других видов животных, таких как кошка или собака.

Гуманизированное антитело представляет собой рекомбинантный белок, в котором CDR из антитела одних видов, например, антитела грызунов, перенесено из тяжелой и легкой вариабельных цепей антитела грызунов в тяжелые и легкие вариабельные области человеческого антитела. Константные области молекулы антитела происходят из константных областей человеческого антитела.

Человеческое антитело представляет собой антитело, полученное из трансгенных мышей, которые были «спроектированы», для получения специфических антител человека в качестве ответа на введение антигенов. В этой методике элементы расположения тяжелой и легкой цепей человека введены в линию мышей, полученную из линий эмбриональных клеток, которые содержат целевое нарушение местоположений тяжелой и легкой цепей. Трансгенные мыши могут синтезировать человеческие антитела, специфичные для человеческих антигенов, и эти мыши могут быть использованы для получения гибридом, секретирующих человеческие антитела. Способы получения человеческих антител из трансгенных мышей описаны Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature368:856 (1994) и Taylor et al., Int. Immun.6:579 (1994). Кроме этого полностью человеческое антитело может быть сконструировано способами генной или хромосомной трансфекции, а также с помощью технологии фагового дисплея, причем все эти способы известны в технике. См., например, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990) для ознакомления с получением человеческих антител и их фрагментов in vitro из набора вариабельных областей иммуноглобулина неиммунизированных доноров. В данной методике гены вариабельных доменов антител клонируют в каркасе внутри либо мажорного, либо минорного гена покровного белка нитевидного бактериофага, и выводят на поверхность частицы фага в виде функциональных фрагментов антител. Поскольку нитевидные частицы содержат копию ДНК генома фага, состоящую из одной цепи, отбор, основанный на функциональных свойствах антитела, также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, которое проявляет те же свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств B-клетки. Способ фагового дисплея может быть реализован в различных форматах, обзор этих форматов, см., например, Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology3:5564-571 (1993).

Человеческие антитела также могут вырабатываться активированными B-клетками in vitro. См. патенты Соединенных Штатов №№ 5567610 и 5229275, которые во всей полноте включены в настоящую заявку с помощью ссылки.

Терапевтическое средство представляет собой молекулу или атом, которые вводят отдельно, одновременно или последовательно с фрагментом антитела, или же терапевтическое средство конъюгировано с фрагментом антитела, т.е. антителом или фрагментом антитела, или субфрагментом антитела, причем терапевтическое средство применимо для лечения заболевания. Примеры терапевтических средств включают антитела, фрагменты антител, лекарственные препараты, токсины, нуклеазы, гормоны, иммуномодуляторы, хелатообразователи, соединения бора, фотоактивные агенты или красители и радиоактивные изотопы.

Иммуномодулятор представляет собой терапевтическое средство в соответствии с тем, как это определено в настоящем изобретении, которое своим присутствием изменяет, подавляет или стимулирует иммунную систему организма. Как правило, иммуномодулятор, применимый в настоящем изобретении, такой как макрофаги, B-клетки и/или T-клетки, стимулирует размножение иммунных клеток или становится активным в последовательном механизме иммунного ответа.

Иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитела с терапевтическим или диагностическим средством. Диагностическое средство может включать в себя радиоактивную или нерадиоактивную метку и контрастное средство (как например, для создания изображений в магнитном резонансе, компьютерной томографии или ультразвуковой технике), причем радиоактивная метка может быть изотопом, испускающим гамма-, бета-, альфа-излучение, Аугеровские электроны или позитроны.

Вектор экспрессии представляет собой молекулу ДНК, содержащую ген, который экспрессируется в клетке-хозяине. Как правило, экспрессия гена происходит под управлением определенных регуляторных элементов, включая конститутивные или индуцируемые промоторы, тканеспецифические регуляторные элементы и энхансеры. Про такие гены говорят, что они являются «функционально связанными» с регуляторными элементами.

Рекомбинантный хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой, которая содержит либо вектор клонирования, либо вектор экспрессии. Помимо этого, данный термин включает в себя такие прокариотические или эукариотические клетки, а также трансгенных животных, которые были созданы с помощью генной инженерии, с тем, чтобы в их хромосомах или геноме содержался клонированный ген (гены) хозяйской клетки или клеток клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают в себя клетки миеломы, такие как клетки SP2/0 и клетки NSO, а также клетки яичника китайского хомячка (CHO), линии клеток гибридомы и другие клетки-хозяева млекопитающих, применимые для экспрессирования антител. Для экспрессирования Mab и других слитых белков частично применима человеческая линия клеток PER.C6, описанная в WO 0063403 A2, которая вырабатывает рекомбинантные белки в количестве от 2 до 200 раз большем, чем обычные линии клеток млекопитающих, такие как линии клеток CHO, COS, Vero, Hela, BHK и SP2. Специальные трансгенные животные с измененной иммунной системой особенно применимы для получения полностью человеческих антител.

В рамках настоящего изобретения термин слитый белок антитела представляет собой рекомбинантно полученную связывающую антиген молекулу, в которой соединены два или несколько одинаковых или различных одноцепочечных антител или сегментов фрагментов антител с одинаковой или различной специфичностью. Валентность слитого белка показывает, каким количеством связывающих плеч или участков по отношению к одному антигену или эпитопу обладает слитый белок, т.е. является ли он моновалентным, бивалентным, трехвалентным или мультивалентным. Мультивалентность слитого белка, являющегося антителом, означает, что он может иметь преимущество многократного взаимодействия в процессе связывания с антигеном, повышая, таким образом, авидность связывания с антигеном. Специфичность показывает, насколько большое число антигенов или эпитопов способен связать слитый белок, являющийся антителом, т.е. является ли он моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим, мультиспецифическим. При использовании этих определений природное антитело, например IgG, является бивалентным, т.к. оно имеет два связывающих плеча, но моноспецифическим, т.к. оно связывается с одним эпитопом. Моноспецифические мультивалентные белки слияния имеют более чем один связывающий участок для эпитопа, но связываются только с одним эпитопом, например диантитело с двумя связывающими участками, которые взаимодействуют с одним и тем же антигеном. Белки слияния могут включать в себя компонент одного антитела, мультивалентное или мультиспецифическое сочетание компонентов различных антител или несколько копий одного и того же компонента антитела. Слитый белок может дополнительно содержать антитело или фрагмент антитела и терапевтическое средство. Примеры терапевтических средств, которые являются подходящими для слитых белков, включают в себя иммуномодуляторы («слитый белок антитело-иммуномодулятор») и токсины («слитый белок антитело-токсин»). Один предпочтительный токсин включает в себя рибонуклеазу (РНКазу), предпочтительно рекомбинантную РНКазу.

Мультиспецифическое антитело представляет собой антитело, которое может одновременно связываться, по меньшей мере, с двумя мишенями, которые различаются по своей структуре, например, двумя различными антигенами, двумя различными эпитопами на одном антигене, или с гаптеном и/или антигеном или эпитопом. Одинаковая специфичность будет иметь место для антигенов или эпитопов B-клеток, T-клеток, миелоидных клеток, плазмацитов и мастоцитов. Еще одна специфичность могла бы наблюдаться на том же типе клеток для других антигенов, таких как CD3, CD4, CD5, CD8, CD11c, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, Ia, HMI.24, HLA-DR, тенасцин, MUC1 и антигены, ассоциированные с опухолями B-клеток, включая антигены сосудистого эндотелия, такие как VEGF и PIGF. Мультиспецифические, мультивалентные антитела представляют собой конструкции, которые содержат более чем один участок связывания, причем участки связывания отличаются по своей специфичности. Например, диантитело, в котором один участок связывания взаимодействует с одним антигеном, а другой участок - с другим антигеном.

Биспецифическое антитело представляет собой антитело, которое может связываться одновременно с двумя мишенями, которые обладают различной структурой. Биспецифические антитела (bsAb) и биспецифические фрагменты антител (bsFab) имеют, по меньшей мере, одно плечо, которое специфически связывается, например, с антигеном или эпитопом B-клетки, T-клетки, миелоидной клетки, плазмацита и мастоцита, и, по меньшей мере, еще одно отличающееся плечо, которое специфически связывается с направленным на мишень конъюгатом, который имеет в своем составе терапевтическое или диагностическое средство. Разнообразные биспецифические белки слияния можно получить, применяя молекулярную инженерию. В одной форме биспецифический белок слияния является моновалентным, состоящим, например, из scFv с одним участком связывания для одного антигена и фрагмента Fab с одним участком связывания для второго антигена. В другой форме биспецифический белок слияния является дивалентным, состоящим, например, из IgG с участком связывания для одного антигена и двух scFv с двумя участками связывания для второго антигена.

Антитела, которые созданы наподобие собачьих или кошачьих, представляют собой рекомбинантные белки, в которых принадлежащие грызунам (или другим видам) области моноклональных антител, определяющие комплементарность, перенесены из тяжелых и легких вариабельных цепей иммуноглобулина грызунов (или других видов) соответственно в вариабельные области иммуноглобулина собак или кошек.

Антитела, которые созданы наподобие антител человекообразных приматов, представляют собой рекомбинантные белки, в которых области моноклонального антитела, определяющие комплементарность и принадлежащие приматам, отличным от человека (например, обезьянам), были перенесены из тяжелых и легких вариабельных цепей иммуноглобулина грызунов (или других видов) в вариабельные области иммуноглобулина приматов, отличных от человека.

Домашние животные включают в себя крупных животных, таких как лошади, крупный рогатый скот, овцы, козы, ламы, альпаки и свиньи, а также сопутствующих человеку животных. В предпочтительном варианте осуществления домашнее животное представляет собой лошадь.

Сопутствующие человеку животные включают в себя животных, которые содержатся в качестве комнатных животных. В основном это собаки и кошки, хотя к этой группе также относятся небольшие грызуны, такие как морские свинки, хомяки, крысы и хорьки, а также приматы, такие как обезьяны. В предпочтительном варианте осуществления сопутствующее животное представляют собой собаку или кошку.

Термин «очищающее средство» относится к антителу, которое заполняет участки связывания целевого фрагмента, причем целевой фрагмент может представлять собой антитело, фрагмент антитела, связывающийся с антигеном, или целевой фрагмент, который не является антителом. В более предпочтительном способе очищающее средство представляет собой моноклональное антитело, которое является антиидиотипическим по отношению к моноклональному антителу конъюгата, используемому на первой стадии, как описано в заявке Соединенных Штатов Сер.№ 08/486166. В другом предпочтительном варианте осуществления очищающее средство замещено многочисленными остатками углеводов, таких как галактоза, которые дают возможность быстро вывести очищающее средство из циркуляции за счет асиалогликопротеиновых рецепторов в печени.

2. Получение моноклональных антител, включая химерные, гуманизированные и человеческие антитела

Моноклональные антитела (Mab) являются однородной популяцией антител к отдельному антигену, причем антитела содержат только один тип участков, связывающих антиген, и связываются лишь с одним эпитопом на антигенной детерминанте.

Моноклональные антитела грызунов к отдельным антигенам могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. См., например, Kohler and Milstein, Nature256:495 (1975) и Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [здесь и далее «Coligan»]. Вкратце, моноклональные антитела могут быть получены путем инъекции мышам состава, включающего в себя антиген, подтверждения наличия выработки антител за счет взятия образца сыворотки, удаления селезенки для получения B-лимфоцитов, объединения B-лимфоцитов с клетками миеломы для получения гибридом, клонирования гибридом, отбора положительных клонов, которые вырабатывают антитела к антигену, культивирования клонов, которые вырабатывают антитела к антигену, и выделения антител из культур гибридомы.

Моноклональные антитела могут быть выделены из культур гибридомы и очищены с помощью целого ряда хорошо разработанных методик. Эти методики выделения включают в себя аффинную хроматографию с протеин-А сефарозой, эксклюзионную хроматографию с исключением по размеру и ионообменную хроматографию. См., например, Coligan на стр. 2.7.1-2.7.12 и стр. 2.9.1-2.9.3. См., также, Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" в METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).

После первоначального появления антител к иммуногену антитела можно секвенировать и впоследствии получать их согласно рекомбинантным методикам. Гуманизация и химеризация мышиных антител и фрагментов антител хорошо известны специалистам в данной области. Например, гуманизированныемоноклональные антитела получают, перенося мышиные, определяющие комплементарность области из тяжелой и легкой вариабельных цепей мышиного иммуноглобулина в человеческие вариабельные области и затем замещая человеческие остатки в областях каркаса мышиных эквивалентов. Применение компонентов антител, полученных из гуманизированныхмоноклональных антител, устраняет потенциальные проблемы, связанные с иммуногенностью мышиных константных областей.

Общие методики клонирования вариабельных областей мышиного иммуноглобулина описаны, например, в публикации Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:3833 (1989), которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки. Методики создания химерных антител хорошо известны специалистам в данной области. В качестве примера Leung et al., Hybridoma13:469 (1994) описывают получение химеры LL2 путем сочетания последовательностей ДНК, закодированных V_κ- и V_H-доменами моноклонального антитела LL2, т.е. антитела против CD22, с соответствующими человеческими областями константных регионов κ и IgG₁. Кроме этого данная публикация предоставляет последовательность нуклеотидов вариабельных областей легкой и тяжелой цепи LL2, т.е. соответственно V_κ и V_H. Методики получения гуманизированныхMab описаны, например Jones et al., Nature321:522 (1986), Riechmann et al., Nature332:323 (1988), Verhoeyen et al., Science239:1534 (1988), Carter et al., Proc. Natl Acad. Sci USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech.12:437 (1992) и Singer et al., J. Immun.150:2844 (1993), причем каждый из этих источников включен в настоящую заявку с помощью ссылки.

Химерное антитело представляет собой рекомбинантный белок, который содержит вариабельные области, включая CDR, полученные из антител одного вида животных, как например, из антител грызунов, в то время как остальная часть молекулы антитела, т.е. константные области, получены из человеческих антите