Способ отбора белых мышей и золотистых хомячков для моделирования экспериментальной чумной инфекции

Способ отбора белых мышей и золотистых хомячков для моделирования экспериментальной чумной инфекции

Реферат

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к методике отбора лабораторных животных для возможности дифференциального изучения реакции живого организма на развитие экспериментального чумного процесса.

Общепринятые подходы к стандартизации биологических моделей базируются на оценке генетического и микробиологического статуса организма. Известен способ отбора лабораторных животных, основанный на подборе определенных групп объективно здоровых без внешних признаков заболевания (Рак Л.А. «Кормление, содержание, разведение и профилактика заболеваний морских свинок», метод. рекомендации. Ставрополь, 1981, МЗ СССР).

Недостатком этого способа является недостоверность полученных результатов в связи с различными данными по патогенезу экспериментального чумного процесса.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является «Способ отбора морских свинок и крыс линии Фишер для моделирования заболевания бруцеллезом», основанный на подборе животных по результатам биохимического исследований, в частности по данным неспецифической реактивности организма (Сафронова В.М., Руднев С.М., Ляпустина Л.В. Патент РФ №2064201 от 20.07.1996 г.).

Недостатком этого способа является то, что в качестве критерия используют только один показатель, характеризующий состояние ферментной системы нейтрофилов крови, а именно кислую фосфатазу, которая активизируется только на втором этапе реакции фагоцитоза.

Целью данного изобретения является обеспечение полноценного отбора особей для моделирования экспериментального чумного процесса, дифференцированное изучение течения экспериментального чумного процесса у животных с различной чувствительностью к возбудителю по результатам цитоэнзимохимических исследований.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что отбор животных осуществляется по цитохимическим показателям периферической крови и степени полноценности особей. В качестве биохимического показателя используется состояние ферментных систем, а именно кислой фосфатазы и катионных белков.

Процесс фагоцитоза является основным звеном неспецифической защиты организма от воздействия различных факторов окружающей среды. Одно из основных значений имеет первая фаза фагоцитоза - киллинг, сущность которого составляют действие кислородзависимых и кислороднезависимых микробицидных систем. Метод оценки функционирования кислородзависимого метаболизма в настоящее время используют для определения степени киллерной активности фагоцитирующих клеток. В результате функционирования кислородзависимых механизмов происходит образование перекиси водорода, синглетного кислорода, гидроксильного радикала и других веществ, токсичных для микроорганизмов (Маянский А.Н., Маянский Д.Н. 1989). Главным антимикробным агентом кислороднезависимой системы являются лизосомальные катионные белки (КБ). От состояния иммунной системы зависит работа кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов клетки, что делает фагоцитирующую клетку неспособной к завершенному фагоцитозу. На втором этапе фагоцитоза происходит гидролиз умерщвленных воздействием КБ, лизоцимом, лактоферином бактерий, в этом случае одна из ведущих ролей отводится энзимам, в частности кислой фосфатазе (КФ). КФ является уникальным маркером лизосом, играющих важную роль в реакции фагоцитоза и бласттрансформации лимфоцитов. Изменение активности КФ в лейкоцитах и макрофагах связывают с лизисом тканевых компонентов. В ряде опубликованных работ подчеркивается значимость исследования ферментативной активности нейтрофилов, поскольку последняя является высоко информативным тестом, характеризующим тяжесть и исход заболевания.

Для отбора высокочувствительных белых мышей уровень активности кислой фосфатазы в нейтрофилах крови должен соответствовать 2,23-2,38 единиц Кэплоу, содержание катионных белков 1,63-1,76 единиц Кэплоу. Для отбора относительно резистентных к чуме золотистых хомячков уровень активности кислой фосфатазы 1,95-2,03 единиц Кэплоу, содержание катионных белков 2,05-2,15 единиц Кэплоу.

Отличительные признаки заявляемого объекта заключаются в том, что в качестве биохимического показателя используют два показателя состояния ферментной системы, а именно кислую фосфатазу и катионные белки, исследуется кровь животных, высокочувствительных и относительно резистентных к возбудителю чумы.

Для отбора высокочувствительных к чуме белых мышей уровень активности кислой фосфатазы в полиморфноядерных нейтрофилах периферической крови должен соответствовать 2,23-2,38 единиц Кэплоу, содержание катионных белков 1,63-1,76 единиц Кэплоу. Для отбора относительно резистентных к чуме золотистых хомячков уровень кислой фосфатазы должен составлять 1,95-2,03 единиц Кэплоу, содержание катионных белков 2,05-2,15 единиц Кэплоу. Результаты исследования отражены в таблице. Из данных таблицы видно, что искомый уровень катионных белков и кислой фосфатазы у белых мышей соответствует данным бактериологических исследований.

Способ осуществляется следующим образом.

Для отбора животных при моделировании экспериментального чумного процесса берут две группы животных - высокочувствительных к чуме белых мышей и относительно резистентных золотистых хомячков.

От каждого животного в каждой группе производят забор крови путем надрезания фаланги пальца у золотистого хомячка и хвостовой вены у белой мыши ножницами. На предметном стекле готовят мазки с помощью шлифовального стекла, после чего их высушивают при комнаткой температуре с последующей фиксацией в холодном (+4°С) 10% формалине на 96-градусная этиловом спирте в течение 1 мин с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде. Препараты для определения уровня катионных белков фиксируют в холодном метиловом спирте (+4°С) в течение 5 мин, после чего сушат на воздухе. Затем мазки крови инкубируют с соответствующим субстратом.

Инкубационный раствор для кислой фосфатазы готовят следующим образом: раствор «А» - 20 мг нафтола AS - Bi фосфата + 0,5 мл диметилформамида + 40 мл холодного 0,1 н. раствора уксуснокислого натрия; раствор «В» - 8 капель 2% фуксина для фуксинсернистой кислоты на 1 н. растворе соляной кислоты + 8 капель 4% раствора азотистокислого натрия. Смешивают раствор «А» с раствором «В», фильтруют. При помощи 1 н. соляной кислоты доводят рН полученного раствора до значения 5,2-5,4. Раствор готовят ех tempore. После инкубации мазки споласкивают в дистиллированной воде, докрашивают ядра клеток крови 2% раствором метилового зеленого 15 мин.

Инкубационный раствор для катионных белков готовят следующим образом: 605 мг трис-буфера растворяют в 25 мл дистиллированной воды, добавляют 22,5 мл 0,1 н. соляной кислоты, 52,5 мл метилового спирта. В 100 мл раствора растворяют 100 мг прочного зеленого. Доводят рН полученного раствора до значения 8,1-8,2.

Мазки споласкивают в дистиллированной воде, ядра полиморфноядерных нейтрофилов докрашивают 0,2% раствором азура «А» в течение 20 сек.

Результаты реакций учитывают методом Кеплоу (1955) в модификации Астальди и Берга (1957). Если продукт реакции занимал всю цитоплазму клетки - 111 степень активности, если есть участки, свободные от гранул фермента, - 11 степень, единичные гранулы в цитоплазме клетки - 1 степень активность и если гранулы или диффузное прокрашивание цитоплазмы отсутствует - 0 степень. Степень окрашивания определяют в 100 полиморфноядерных нейтрофилах. Единицу Кеплоу определяют следующим образом.

Например:

О степень активности -	50 клеток
I степень активности -	10 клеток
II степень активности -	20 клеток
III степень активности -	20 клеток
	100 клеток

Степень активности умножают на количество клеток с этой активностью, суммируют и делят на 100. В нашем примере уровень активности 1, единиц Кэплоу.

По результатам наших исследований для белых мышей уровень катионных белков составлял 1,63-1,76 единиц Кэплоу, кислой фосфатазы 2,23-2,38 единиц Кэплоу; для золотистых хомячков катионные белки 2,05-2,15 единиц Кэплоу, кислой фосфатазы 1,95-2,03 единиц Кэплоу.

Отобранные группы животных по уровню активности кислой фосфатазы и содержанию катионных белков позволяют моделировать чумную инфекцию по степени резистентности.

Пример 1. Брали группу белых мышей, 40 штук, в возрасте 40-45 суток (начало периода половой зрелости). Готовили мазки крови из хвостовой вены на предметном стекле, подсушивали на воздухе при комнатной температуре. Последующую обработку проводили по методике, изложенной в описании способа.

У 9 белых мышей активность кислой фосфатазы составляла 1,85-1,92 единиц Кэплоу, у 27 - 2,23-2,28 единиц Кэплоу, у 4 - 2,31-2,38 единиц Кэплоу. Уровень катионных белков у 9 зверьков 1,23-1,3 единиц Кэплоу, у 27 - 1,63-1,67 единиц Кэплоу, у 4 - 1,72-1,76 единиц Кэплоу. Отобранных животных заражали подкожно вирулентной культурой Y.pestis 461 в дозе 1 DCL (что соответствовало 100 м.к.). Цитоэнзимохимические и бактериологические исследования проводили через сутки, трое после заражения. У белых мышей с уровнем активности кислой фосфатазы 2,23-2,38 единиц Кэплоу и содержанием катионных белков 1,63-1,76 единиц Кэплоу на первые сутки после заражения возбудитель высевался не у всех особей и не из всех органах. У животных с низким уровнем активности исследуемых цитохимических показателей уже на первые сутки исследования наблюдался падеж зверьков, возбудитель чумы выделялся из всех исследуемых органов.

Следовательно, из 40 белых мышей, взятых в опыт, для моделирования экспериментального чумного процесса у животных с высокой чувствительностью к этой инфекции пригодны зверьки с уровнем активности кислой фосфатазы 2,23-2,38 единиц Кэплоу и содержанием катионных белков 1,63-1,76 единиц Кэплоу

Пример 2. Брали группу золотистых хомячков, 40 животных, в возрасте 60 суток (начало периода половой зрелости). Готовили мазки крови из фаланги пальца на предметных стеклах, подсушивали при комнатной температуре. Последующую фиксацию и окраску мазков проводили, как в предыдущем эксперименте.

У 2 золотистых хомячков активность кислой фосфатазы составляла 1,85-1,92 единиц Кэплоу, у 20 - 1,99-2,03 единиц Кэплоу, у 18 - 1,95-1,97 единиц Кэплоу. Содержание катионных белков соответственно было у 18 животных 2,05-2,08 единиц Кэплоу, у 20 - 2,1-2,15 единиц Кэплоу, у 2 - 1,95-2,0 единиц Кэплоу. Животных заражали вирулентным штаммом Y.pestis 461 в дозе 2 млн м.к. Цитоэнзимохимические и бактериологические исследования проводили через 1,3, 10 суток после введения инфекта.

У 2 животных с активностью КФ 1,85-1,92 единиц Кэплоу и содержанием КБ 1,95-2,0 единиц Кэплоу из печени и паховых лимфатических узлов (с места введения инфекта) на 3 сутки высевалась культура возбудителя, на 10 сутки возбудитель Y.pestis обнаруживался в паховых лимфатических узлах только одного животного. У золотистых хомячков с более высокими цитохимическими показателями возбудитель из внутренних органов не выделялся.

Таким образом, из 40 золотистых хомячков 38 особей пригодны для моделирования чумного процесса у животных с относительной резистентностью к чумной инфекции.

Обоснование использования уровня катионных белков и активности кислой фосфатазы в нейтрофилах крови как критерия при отборе экспериментальных животных для моделирования экспериментальной чумной инфекции по степени резистентности
Экспериментальные животные	Уровень активности кислой фосфатазы	Уровень содержания катионных белков	Бактериологические показатели у зараженных чумой животных
1 сут	3 сут	10 сут
Белые мыши	1,85	1,23	+	*	*
1,92	1,3	+	*	*
2,23	1,63	±	+	*
2,27	1,65	±	+	*
2,28	1,67	±	+	*
2,31	1,72	±	+	*
2,31	1,74	±	+	*
2,38	1,76	±	+	*
Золотистые хомячки	1,85	1,95	-	±	±
1,92	2,0	-	±	-
1,95	2,05	-	-	-
1,97	2,08	-	-	-
1,99	2,1	-	-	-
2,03	2,15	-	-	-
± - рост возбудителя не у всех исследуемых животных+ - есть рост возбудителя- - роста возбудителя нет* - животные пали

Способ отбора белых мышей и золотистых хомячков для моделирования экспериментальной чумной инфекции путем исследования цитохимических показателей крови отличающихся тем, что определяют уровень катионных белков и активность кислой фосфатазы в полиморфноядерных лейкоцитах крови и при содержании катионных белков 1,63-1,76 единиц Кэплоу и активности кислой фосфатазы 2,23-2,38 единиц Кэплоу отбирают белых мышей чувствительных к возбудителю чумы, а при содержании катионных белков 2,05-2,15 единиц Кэплоу и при активности кислой фосфатазы 1,95-2,03 единиц Кэплоу отбирают золотистых хомячков относительно резистентных к чуме.