Способ определения качественного состава фосфолипидного комплекса

Способ определения качественного состава фосфолипидного комплекса

Реферат

Изобретение относится к области аналитической биохимии, а именно к способам анализа веществ, и может быть использовано для определения качественного состава фосфолипидного комплекса при проведении аналитических и научно-исследовательских работ. Изобретение направлено на расширение арсенала способов определения качественного состава фосфолипидного комплекса.

Известны способы определения качественного состава смеси фосфолипидов с помощью хроматографических методов. Эти способы включают в себя получение раствора фосфолипидов из пищевых, растительных или животных объектов, хроматографическое разделение раствора фосфолипидов на отдельные фракции фосфолипидов и детектирование хроматографических зон специфическими реагентами. Виды используемого хроматографического разделения различны, чаще всего используется метод тонкослойной хроматографии и хроматографии на колонках, также различаются используемые реагенты-обнаружители и системы растворителей для элюирования.

Известен способ определения состава смеси фосфолипидов, полученной из сливочного масла, заключающийся в нанесении ее капилляром на тонкий слой сорбента ТСХ, разделении ее хроматографическим методом в системе растворителей на отдельные фракции фосфолипидов, проявлении хроматографической пластины реактивом Васьковского и Костецкого с целью обнаружения индивидуальных фосфолипидов (RU №567133, МПК G01N 33/04, 1977).

Известен способ определения качественного состава смесей фосфолипидов, полученных из различных биологических объектов, в котором сочетаются элементы афинной и ионообменной хроматографии, а также используются специально подобранные различные системы растворителей для элюирования, что позволяет разделить смеси фосфолипидов на индивидуальные фосфолипиды (RU №1284981, МПК 4 C07F 9/10, G01N 33/50, 1987).

Известен способ разделения спиртового раствора смеси фосфолипидов, заключающийся в пропускании ее через неионогенный сорбент МХДЭ-100, который предварительно подвергают модификации путем насыщения его этиловым спиртом, элюирования сорбированного продукта этиловым спиртом и затем разделении фосфолипидов хроматографическим методом (RU №2169734, МПК C07F 09/09, 2001).

Известен способ качественного определения фосфолипидов, в котором их определяют колориметрически после разделения методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и обнаружения специфическим молибдатным реагентом (заявка RU №93042346, МПК⁶ G01N 33/48, G01N 33/15, 1996.10.10).

Недостатками этих способов является их трудоемкость, а также то, что на их осуществление требуются значительные затраты времени, оборудования и реактивов.

Технический результат заключается в упрощении способа определения качественного состава фосфолипидного комплекса для аналитических исследований, его экспрессности, снижении материальных затрат и трудоемкости на его проведение, повышении точности определения.

Технический результат достигается тем, что в способе определения качественного состава фосфолипидного комплекса, заключающемся в том, что фосфолипидный концентрат, полученный из исследуемых образцов, сушат при 30-35°С под вакуумом, затем растворяют в хлороформе до 1% концентрации, наносят пробы хлороформного раствора фосфолипидов на пропитанную цитратным буферным раствором хроматографическую бумагу в оптимальном объеме 1 и 2 мкл, проводят зональный высоковольтный электрофорез при 600 В в течение 60 мин, после завершения электрофореза бумагу высушивают при 110°С в течение 20-30 минут, высушенные полоски бумаги обрабатывают в 0,0012% растворе Родамина, затем сушат при комнатной температуре, проводят обнаружение зон в УФ-свете и определяют качественный состав фосфолипидного комплекса путем сравнения с электрофореграммой стандартных растворов фосфолипидов.

Предлагаемый способ определения качественного состава фосфолипидных комплексов позволяет значительно упростить процесс анализа, сократить время его проведения, уменьшить ошибку определения вследствие сокращения целого ряда операций предпоготовки проб хлороформных растворов фосфолипидного комплекса после его разделения на индивидуальные фосфолипиды для дальнейшего их определения.

Отработку предлагаемого способа определения качественного состава фосфолипидного комплекса с помощью метода электрофоретического разделения проводили на стандартных растворах фосфатидных кислот (ФК), фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилинозитола (ФИ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА), фосфатидилсерина (ФС) и фосфатидилглицерина (ФГ) фирм «Sigma», «ICN Biomedical» в хлороформе. Разделение фосфолипидной смеси проводили на приборе марки LFG (Венгрия) с горизонтальной камерой и двумя электродами из платиновой проволоки. Электрофоретическое разделение проводилось по следующей схеме:

1. Подготовка носителя (среды);

2. Выбор и подготовка проводящей жидкости;

3. Подготовка анализируемых образцов;

4. Нанесение веществ, подлежащих разделению;

5. Проведение электрофореза;

6. Обнаружение и качественная оценка фосфолипидов.

Подготовка носителя.

Фильтровальная бумага для электрофореза должна содержать, по крайней мере, 96% а-целлюлозы, нерастворимой в концентрированном растворе NaOH. В процессе электрофореза она пропитывается проводящей жидкостью. Разные марки бумаги обладают неодинаковой впитывающей способностью - свойством, имеющим большое значение, так как электропроводимость влажной фильтровальной бумаги зависит от объема содержащегося в ней проводящей жидкости.

В работе использовалась хроматографическая бумага (ГОСТ №10395-63) форматом 52×65 и плотностью 85. На бумагу размером 25×10 см в центре наносили стартовую линию и смачивали проводящей жидкостью всю поверхность бумаги, за исключением полоски размером 1,5 см с обеих сторон от стартовой линии (для предотвращения размывания анализируемой пробы).

Выбор и подготовка проводящей жидкости.

На практике в качестве проводящей жидкости чаще всего используются буферные растворы. Состав и кислотность буфера являются важнейшими условиями электрофоретического процесса.

В качестве проводящей жидкости нами были рассмотрены три буферных раствора (на 1 л): цитратный (17,5 г лимонной кислоты, 8,2 г NaOH, рН 3,41), фосфатный (11,9 г Na₂HPO₄×2H₂O, 9,0 г KH₂PO₄, рН 7,79), аммиачный (10,0 г NH₄Cl, pH 11,78).

Электродные кюветы заполняли соответствующим буферным раствором и соединяли кюветы полосками фильтровальной бумаги. Следует обратить внимание на тот факт, что после проведения электрофореза уменьшается концентрация буферных растворов (особенно аммиачного) и, следовательно, меняется величина рН. Поэтому буферные растворы нельзя использовать дважды.

Подготовка образцов.

Фосфолипидный концентрат, полученный из исследуемых образцов, сушили в чашке Петри под вакуумом при 30-35°С под вакуумом, затем растворяли в хлороформе до 1%-ной концентрации. Подготовленный таким способом образец использовали для дальнейшего разделения.

Нанесение пробы.

Подготовленный образец наносили микрошприцем МШ-10 (Россия) на стартовую линию на расстояние не менее 1 см от края бумаги и не менее 2,5 см друг от друга. Бумагу подсушивали и помещали на электрофоретический столик таким образом, чтобы концы бумаги были погружены на 1 см в кюветы с проводящей жидкостью. Для предотвращения чрезмерного испарения проводящей жидкости, которое может привести к снижению ее концентрации и изменению величины рН, всю систему помещали в закрытую камеру и проводили электрофорез. Экспериментально было установлено, что объем наносимой пробы существенно влияет на процесс разделения и качество электрофоретических зон. Поэтому предварительно был установлен оптимальный объем наносимой пробы для ФХ, так как его количество в любом фосфолипидном концентрате доминирует.

Для выяснения этого влияния стандартный раствор ФХ в хлороформе наносили микрошприцем на стартовую линию в объеме 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 5,0 и 10 мкл. После проведения электрофореза и детектирования полученных зон были установлены оптимальные объемы наносимой пробы. Они составили 1 и 2 мкл. Большое количество наносимого вещества значительно ухудшает картину разделения, и основная масса вещества остается на старте.

Проведение электрофореза.

Для выбора оптимального напряжения проводили электрофорез стандартного раствора ФХ при 400, 500 и 600 В. Лучшее разделение и качество зон для всех трех буферных систем наблюдалось при 600 В.

Время экспонирования также устанавливалось экспериментально. Оно составило 30 мин для аммиачного буфера и 60 мин для фосфатного и цитратного буферных растворов.

После завершения электрофоретического процесса бумагу как можно быстрее переносили в термостат и высушивали при температуре 110°С в течение 20-30 мин. Быстрая фиксация разделенных веществ проводится для того, чтобы предотвратить диффузию молекул, продолжающуюся и после отключения электрического тока, что приводит к ухудшению картины разделения.

Обнаружение и качественная оценка оценка.

Детектирование электрофоретических зон после разделения проводили следующим образом. Высушенные полоски бумаги помещали в сухие кюветы, заливали раствором проявителя и оставляли на 30-60 мин. Затем полоски бумаги вывешивали на раму и сушили при комнатной температуре. В качестве реагентов-обнаружителей использовали следующие растворы:

1) 0,0012% раствор Родамина 6Ж. Является неспецифическим обнаружителем. Используется для определения кислых (голубые и пурпурные зоны) и нейтральных (желтые и оранжевые зоны) липидов. Это наиболее распространенный обнаружитель. После обработки электрофореграмм этим реагентом обнаружение зон проводят в УФ-свете.

2) 5% спиртовой раствор фосфорно-молибденовой кислоты (ФМК). Этот реактив широко используется для обнаружения всех фосфолипидов.

3) 0,25% раствор нингидрина в ацетоне. Специфический обнаружитесь для фосфолипидов, имеющих свободные аминогруппы.

Отработку методики проводили на модельных смесях фосфолипидов фосфатидилихолина (ФХ). Полученные результаты представлены на чертеже.

При этом было установлено, что:

1) Наилучшее разделение и качество электрофоретических зон получается при напряжении 600 В, времени экспонирования - 60 мин, при использовании в качестве проводящей жидкости цитратного буферного раствора, приготовленного согласно стандартной прописи.

2) Объем наносимых проб стандартных хлороформных растворов фосфолипидов существенно влияет на процесс разделения и качество электрофоретических зон. Большое количество наносимых проб значительно ухудшает картину разделения, и основная масса фосфолипидов остается на старте. Экспериментально были установлены оптимальные объемы наносимых проб хлороформных растворов фосфолипидов, которые составили 1 и 2 мкл.

3) Наиболее предпочтительным реагентом - обнаружителем является 0,0012% раствор Родамина 6Ж, так как в случае его использования определяется наибольшее число индивидуальных фосфолипидов.

В соответствии с данными чертежа в цитратном и фосфатной буферной системах ФХ и ФЭА существуют в виде положительно заряженных частиц, т.к. под действием электрического тока они движутся в катодную область. Следовательно, в кислой и нейтральной средах ФХ и ФЭА существуют в виде катионов. ФС, ФК, ФГ и ФИ в цитратном буфере обнаруживаются в анодной области, т.е. они имеют суммарный заряд и являются анионными фосфолипидами. В аммиачном буфере (щелочная среда) ФИ, ФС и ФЭА существуют в виде анионов, а ФХ остается на линии старта. Это можно объяснить тем, что вблизи величины рН 12,05 находится изоэлектрическая точка ФХ. Обнаружить ФК, ФС и ФИ при использовании фосфатного буфера не удалось. Проверка отдельных электрофоретических зон на наличие золы показала отсутствие минеральных компонентов (менее 0,001%), что свидетельствует о разрушении комплекса металл - ФЛК при использовании этого способа.

Пример. 0,05-0,07 г фосфолипидного комплекса, полученного из масла семян амаранта, переносили количественно в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем раствора до метки хлороформом. Получали хлороформный раствор исследуемых фосфолипидов с концентрацией 2-3 мг/см³.

Затем путем последовательного разведения готовили серию стандартных растворов фосфолипидов с концентрациями 60, 40 и 20 мг/см³.

На стартовую линию хроматографической бумаги размером 25×10 см наносили при помощи микрошприца МШ (Россия) по 2 мкл исследуемых хлороформных растворов фосфолипидов масла семян амаранта и по 2 мкл стандартных растворов фосфолипидов: ФХ, ФИ, ФЭА, ФГ, ФС и ФК. Проводили электрофоретическое разделение при 600 В в цитратном буферном растворе в течение 60 мин. Детектирование электрофоретических зон после разделения проводили следующим образом. Высушенные полоски бумаги помещали в сухие кюветы, протягивали через 0,0012% раствор Родамина 6Ж. Затем полоски бумаги вывешивали на раму и сушили при комнатной температуре. Обнаружение электрофоретических зон проводили в УФ-свете. Идентификацию индивидуальных фосфолипидов хлороформного раствора исследуемого фосфолипидного комплекса проводили при помощи сравнительного анализа электрофореграмм стандартных растворов фосфолипидов и хлороформного раствора исследуемого фосфолипидного комплекса. Установлено, что в состав фосфолипидного комплекса масла семян амаранта входят ФХ, ФИ.

Способ определения качественного состава фосфолипидных комплексов, заключающийся в том, что фосфолипидный концентрат, полученный из исследуемых образцов, сушат при 30-35°С под вакуумом, затем растворяют в хлороформе до 1% концентрации, наносят пробы хлороформного раствора фосфолипидов на пропитанную цитратным буферным раствором хроматографическую бумагу в оптимальном объеме 1 и 2 мкл, проводят зональный высоковольтный электрофорез при 600 В в течение 60 мин, после завершения электрофореза бумагу высушивают при 110°С в течение 20-30 мин, высушенные полоски бумаги обрабатывают в 0,0012% растворе Родамина 6Ж, затем сушат при комнатной температуре, проводят обнаружение зон в УФ-свете и определяют качественный состав фосфолипидного комплекса путем сравнения с электрофореграммой стандартных растворов фосфолипидов.