Способ доставки днк в макроорганизм для разработки вакцин и соматической генной терапии

Способ доставки днк в макроорганизм для разработки вакцин и соматической генной терапии

Реферат

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии ДНК-вакцин и по своей сути принадлежит к технологиям соматической генной терапии. Адресную доставку генетического материала (нуклеиновой кислоты) в макроорганизм осуществляют в биосовместимых и биодеградируемых микрокапсулах, состоящих из мультислойных полимерных оболочек (альгинат-полилизин), которые предохраняют ДНК от расщепления нуклеазами в процессе ее доставки в клетки организма.

Изобретение может быть использовано для повышения эффективности ДНК-вакцин и в области соматической генной терапии.

При разработке генно-инженерных вакцин (ДНК-вакцин, или вакцин 3 поколения) плазмидную ДНК (вектор) с встроенным геном протективного белка вводят непосредственно в организм животного. Иммунный ответ индуцируется посредством инъекции «голой» ДНК в солевом растворе либо в комплексе с липидами. При этом плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,1-0,2%), а большая ее часть быстро разрушается. Чтобы получить иммунный ответ, вводят значительные количества ДНК - около 100 мкг плазмид на мышь [1, 2].

В современной биотехнологии разрабатывают различные способы доставки генетического материала в макроорганизм. Известен способ доставки ДНК в цитоплазму клетки с помощью бактериофага [3]. Другой путь повышения эффективности адресной доставки биоматериала заключается в применении микрокапсул. Для микрокапсулирования лекарственных средств и белков применяют кальций карбонатные (СаСО₃) микросферы, покрытые полимером [4]. В качестве оболочек использовали альгинат кальция и желатин. Такие микрогранулы не эффективны для микрокапсулирования органических кислот. Этот способ авторы использовали для иммобилизации белков, в процессе предусматривалась обработка кислотами, образование капсул, подобных микрогелевым структурам.

Известен способ микрокапсулирования для доставки нуклеиновой кислоты и адъюванта, включающий в себя микросферы, состоящие из растворимого полимера. Нуклеиновую кислоту вносили в раствор полимера, затем экстрагировали растворитель из эмульсии нуклеиновой кислоты с полимером, вызывая образование микросфер, содержащих нуклеиновую кислоту и/или нуклеиновую кислоту с адъювантом. Процесс инкапсулирования протекал при 37°С. В дальнейшем предусматривались процессы отмывания, замораживания и высушивания микросфер. Эффективность этого метода микрокасулирования составляла 50% [5].

Однако известные способы микрокапсулирования являются достаточно сложными, малоэффективными и не позволяют получать препараты ДНК, легко деградируемые в организме животного и стабильные при длительном хранении, что является обязательным условием для вакцинных препаратов (ДНК-вакцин).

Наиболее близким аналогом является способ доставки ДНК для разработки вакцин, включающий в себя микрокапсулирование ДНК путем ее сорбции в течение 1 часа при 22°С пористыми СаСО₃ микрочастицами с последующим покрытием их мультислойными оболочками: поли-L-лизин - альгинат натрия и растворением внутреннего ядра СаСО₃ [6].

Однако эффективность микрокапсулирования ДНК была низкой и составляла всего от 2 до 25% от исходного количества, в результате иммунный ответ на введение микрокапсулированной ДНК был очень слабым по сравнению с контролем.

Целью изобретения является разработка и усовершенствование способа доставки ДНК для вакцин и соматической генной терапии.

Поставленная цель достигается тем, что способ включает сорбцию ДНК микрочастицами СаСО₃, образование слоев мультислойной полимерной оболочки из поли-L-лизина (PLL) - альгината (Alg) путем их поочередного наслоения и растворения внутреннего ядра СаСО₃, введение полученных микрокапсул в клетки животных путем инъекции, при этом сорбцию ДНК микрочастицами СаСО₃ проводят 20-22 часа при 4°С, для формирования первого слоя мультислойной оболочки микрочастицы центрифугируют и переносят в раствор низкомолекулярного (15000-30000) поли-L-лизин-альгината (2 мг/см³), инкубируют в течение 15 мин при встряхивании и дважды отмывают в физиологическом растворе, а для формирования второго и последующих, вплоть до шестого слоев, частицы помещают в раствор поли-L-лизин-альгината (1-2 мг/см³ в 0,2 М NaCl), инкубируют при встряхивании в течение 15 мин, отмывают дважды дистиллированной водой и переносят в раствор 0,1 М ЭДТА, интенсивно перемешивают и наносят седьмой заключительный слой, состоящий из поли-L-лизина.

Технический результат - увеличивается количество сорбированной ДНК до 90% от исходного количества вместо 25% и улучшаются ее биологические свойства. Использование низкомолекулярного поли-L-лизин с мол.м. 15000-30000 вместо высокомолекулярного (150000-300000) обеспечивает получение более плотной оболочки, в связи с чем увеличивается механическая прочность микрокапсул. После формирования мультислойной оболочки путем поочередного наслоения полимеров поли-L-лизина и альгината внутреннее ядро, состоящее из СаСО₃, растворяют, помещая микрокапсулы в раствор 0,1 М ЭДТА, и интенсивно перемешивают до полного растворения из СаСО₃. После чего трижды промывают водой. Окончательно микрокапсулы состоят из 6-8 слоев полиэлектролитов и заключенной в них ДНК. Эллюция ДНК из микрокапсул в водном или спиртовом растворе не превышает 1% в первые сутки, и в дальнейшем выход ДНК из микрокапсул прекращается (срок наблюдения 14 дней). Исключена обработка микрокапсул ультразвуком в целях сохранения целостности ДНК. ДНК, заключенную в микрокапсулы, вводят в организм животного путем инъекции.

Пример конкретного выполнения.

ДНК вируса болезни Ауески (ВБА) используют в качестве модели для оценки предлагаемого способа доставки ДНК в клетки животных. Вирус болезни Ауески является патогенным для кроликов и вызывает заболевание или гибель животных, а ДНК этого вируса является инфекционной.

20 мкг ДНК ВБА инкубируют 22 часа с пористыми микрочастицами 50-100 мг СаСО₃, имеющими размер 1-3 m. при 4°С. Концентрация ДНК после инкубации составляет 84% от исходной концентрации ДНК, а именно 17,15 мкг. После адсорбции ДНК микрочастицы дважды отмывают дистиллированной водой. Для образования 1-го слоя оболочки микрочастицы центрифугируют и переносят в раствор низкомолекулярного (15000-30000) поли-L-лизина (2 мг/см³) в 0,2 M NaCl, инкубируют в течение 15 мин при встряхивании и дважды отмывают в физиологическом растворе. Для получения второго полимерного слоя частицы помещают в раствор альгината (1-2 мг/см³ в 0,2 М NaCl), инкубируют при встряхивании в течение 15 мин отмывают дважды дистиллированной водой и переносят в раствор 0,1 М ЭДТА, интенсивно перемешивают в течение 15 мин на шейкере со скоростью вращения 60-100 об/мин, для растворения внутреннего ядра СаСО₃ и снова отмывают водой (1000 об 5 мин). Такую последовательность операций повторяют до образования 7 слоев: PLL-Alg-PLL-Alg-PLL-Alg-PLL. Последняя 7-я оболочка наносится аналогично, как и предыдущие. После формирования микрокапсул с мультислойной мембраной концентрация иммобилизованной ДНК составляет 15,27 мкг/см³.

Двум кроликам вводили внутримышечно по 6,1 мкг ДНК, заключенной в микрокапсулы. Двум кроликам вводили нативную ДНК в водном растворе в том же количестве. Кролики, которым вводили ДНК в микрокапсулах, пали на 3 и 4 сутки, в то время как контрольные (инокулированные нативной ДНК) остались живы и не проявляли признаков заболевания в течение 20 дней (срок наблюдения). У павших животных были отобраны органы (печень, легкие, мозг, кровь), из которых была приготовлена 10% суспензия в физиологическом растворе. В чувствительную к ВБА культуру клеток ПСГК-60 вносили по 1 см³ суспензии каждого органа и культивировали при 37°С. На 4-5 сутки было обнаружено характерное цитопатическое действие в культуре клеток, в которой вносили суспензию печени и мозга павших животных. Это свидетельствовало о том, что ДНК в микрокапсулах была защищена от внутренней среды организма (нуклеаз и других ферментных систем), достигла чувствительные клетки и вызвала инфекционный процесс у животных. ДНК вне микрокапсул (контрольная группа) не вызвала заболевания, и в сыворотках, полученных от животных, не было выявлено вируснейтрализующих антител. Исследования суспензии органов павших кроликов методом ПЦР подтвердили наличие в печени и мозге ДНК вируса болезни Ауески. У контрольных кроликов, которые были забиты и чьи органы взяты для приготовления супензии, ДНК ВБА в суспензии органов методом ПЦР не обнаружили. Это свидетельствовало о доставке генетического материала (ДНК ВБА) в микрокапсулах в макроорганизм (кроликам).

Сравнительная характеристика предлагаемого способа ДНК и прототипа представлена в таблице 1.

Таблица 1
Сравнительная характеристика способов доставки ДНК
Этапы работы	Предлагаемый способ	Прототип
Сорбция ДНК микрочастицами СаСО3	20-22 часа при 4°С	1 час при 18-20°С
Количество сорбированной ДНК от исходной (%)	80-90	2-25
обработка ультразвуком	нет	обработка 10 мин
покрытие мультислойной оболочкой поли-L-лизин (PLL) - альгинат (Alg)	Мол..м. низкомолекулярного поли-L-лизина 15000-30000	Мол.м. высокомолекулярного поли-L-лизина 150000-300000

Использование предлагаемого способа доставки ДНК в макроорганизм по сравнению с существующим способом имеет следующие преимущества:

1. Уменьшает расход ДНК за счет увеличения ее сорбции микрочастицами более чем на 60%.

2. Сохраняет биологические свойства ДНК за счет отмены обработки ультразвуком.

3. Мультислойная оболочка микрокапсул более прочная за счет использования низкомолекулярного поли-L-лизина. "Утечка" ДНК из таких микрокапсул практически исключена, в то время как у аналога она составляла 30%.

Источники информации

1. Гендон Ю.З. Прогресс в разработке вирусных полинуклеотидных (ДНК) вакцин, Вопросы вирусологии, 1999, №4, С.148-154.

2. Супотницкий М.В. ДНК-иммунизация в профилактике инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. Ветеринария, №5, 1998, С.18-21.

3. Jason R Clark John В March, Expert Rev. Vaccines 3 (4), p.463-476.

4. Microgel-Based Engineered Nanostructures and Their application with Template-directed Layer-by-Layer Polyelectrolyte Assembly in Protein Encapsu-lation. Macromol. Bioschi. 2005, 12; 5(5): 451-458.

5. Mark E. Johnson, Sally Mossman, Tricia Cecil, Lawrence Evans, US 2002/0032165 A1 Mar. 14, 2002.

6. E.A.Markvicheva, E.Svrshchevskay, D.Volodkin, O.Selin, М.Gerstenberger, A.Batkoviak, G.Sukhorukov. Encapsulated protein and DNA delivery system for the development of vaccines against intracellular pathogens XII International Workshop on bioencapsulation, Vitoria, 2004, p.319-322.

Способ доставки ДНК в макроорганизм для разработки вакцин и соматической генной терапии, включающий сорбцию ДНК микрочастицами СаСО₃, образование мультислойной полимерной оболочки из поли-L-лизина (PLL) - альгината (Alg) путем их поочередного наслоения и растворения внутреннего ядра СаСО₃, введение полученных микрокапсул в клетки животных путем инъекции, отличающийся тем, что сорбцию ДНК микрочастицами СаСО₃ проводят 20-22 ч при 4°С, для формирования первого слоя мультислойной оболочки микрочастицы центрифугируют и переносят в раствор низкомолекулярного (15000-30000) поли-L-лизин-альгината (2 мг/см³), инкубируют в течение 15 мин при встряхивании и дважды отмывают в физиологическом растворе, а для формирования второго и последующих, вплоть до шестого слоев частицы помещают в раствор поли-L-лизин-альгината (1-2 см/м³ в 0,2 М NaCl), инкубируют при встряхивании в течение 15 мин, отмывают дважды дистиллированной водой и переносят в раствор 0,1 М ЭДТА, интенсивно перемешивают и наносят седьмой заключительный слой, состоящий из поли-L-лизина.