Способ моделирования возрастной катаракты

Способ моделирования возрастной катаракты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для моделирования катаракты с целью последующего исследования антикатарактальной эффективности лекарственных препаратов.

Уровень техники

В последние десятилетия в литературе встречаются описания большого количества различных моделей катаракт на животных: наследственные, вызванные механическим повреждением хрусталика, радиационные, токсические (нафталиновая, селенитовая катаракты), возникающие в результате нарушения углеводного обмена («сахарные» катаракты). Однако при использовании этих моделей могут возникать определенные трудности в дифференцировке индуцированных катарактальных процессов от возрастных (Мальцев Э.В., Павлюченко К.П. Биологические особенности и заболевания хрусталика. - Одесса: «Астропринт», - 2002. - С.265-295).

Для изучения антикатарактальных свойств препарата in vivo используемая экспериментальная модель должна быть максимально приближенной к естественным условиям возникновения катаракты. Этим требованиям в большей степени отвечает только модель ультрафиолетовой катаракты, так как УФ-облучение (В-спектра) служит фактором, способствующим инициированию и дальнейшему прогрессированию патологических изменений в хрусталике (Azzam N., Dovrat A. Long-term lens organ culture system to determine age-related effects of UV irradiation on the eye lens // Exp Eye Res. - 2004. - Vol.79, №6. - P. 903-911; Nai-Teng Yu., Bando M., Kuck J. Localization of UV-induced changes in mouse lens // Exp. Eye Res. - 1990. - Vol.50, №3. - P.327-329).

Известен способ моделирования катаракты на крысах. Для формирования катаракты животные были подвергнуты однократному УФ-облучению В-спектра (пик волны 302,6 нм) в различных дозах 2,5, 5,0 и 7,5 кДж/м² в течение 15 минут. В данной модели для формирования катаракты были однократно использованы высокие дозы УФ облучения, что приводило к острому повреждению хрусталика глаза (Risa О., Saether О., Lofgren S., Soderberg P.G., Krane J., Midelfart A. Metabolic changes in rat lens after in vivo exposure to ultraviolet irradiation: measurements by high resolution MAS1H NMR spectroscopy // Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 2004. - Vol.45, №6. - P.1916-1921).

Известно моделирование катаракты путем однократного облучения крыс УФ излучением В-спектра (300 нм) в течение различных временных интервалов (7,5, 15, 30, 60 и 120 минут) различными дозами (0, 1, 2, 4, 8 кДж/м²). (Dong X., Söderberg P.G., Ayala M., Löfgren S. The Effect of Exposure Time on maximum acceptable dose for avoidance of ultraviolet radiation-induced cataract // Ophthalmic Res. - 2005. - №37. - P.197-201).

Таким образом, существующие ультрафиолетовые модели катаракт требуют совершенствования, так как дозы излучения УФ, используемые для их воспроизведения, значительно высоки, по сравнению с теми, которые получает хрусталик в естественных условиях. Кроме того, УФ-индуцированная катаракта в подобных моделях формируется при относительно кратковременной суммарной экспозиции повреждающего фактора. Эти особенности не позволяют полностью соотнести формируемую УФ-индуцированную катаракту с достаточно растянутыми во времени процессами развития возрастной катаракты, а также не позволяют изучать антикатарактальную эффективность препаратов на различных стадиях формирования помутнений в хрусталиках в условиях, наиболее приближенных к естественным.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ того же назначения, включающий моделирование УФ-индуцированной катаракты. Проводилось формирование катаракты у крыс путем однократного УФ облучения (длина волны 300 нм) дозами 5 и 20 кДж/м² в течение 15 минут. Спустя 1, 4, 8, 16 и 32 недели после облучения животных выводили из эксперимента и оценивали развитие катаракты (Michael R., Soderberg P., Chen E. Long-term development of lens opacities after exposure to ultraviolet radiation at 300 nm. Ophthalmic Res. - 1996. - Vol.28. №4. - P.209-18). Однако способ также не лишен недостатков. Несмотря на то, что авторы длительное время, до 32 недель, изучают последствия УФ облучения, повреждение глаза крысы осуществлялось высокими дозами облучения кратковременно и однократно, что не соответствует естественному процессу формирования катаракты.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка высокоэффективной модели УФ-индуцированной катаракты.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является формирование катаракты, близкой к возрастной катаракте, с активацией процессов фотоокисления и агрегации водорастворимых белков и кумуляцией продуктов фотолиза, которые служат патогенетическим фактором развития возрастной катаракты.

Технический результат достигается за счет воздействия на крыс определенным режимом УФ облучения длиной волны 313 нм в течение 10 месяцев по 16 минут 1 раз в сутки через день, мощность облучения 23,7 Дж/сек·м².

Данный режим УФ облучения малыми дозами в течение длительного периода времени был подобран для формирования катаракты, наиболее приближенной к физиологической катаракте, возникающей в естественных условиях.

Наблюдения показали, что уже через месяц после начала эксперимента определяются помутнения хрусталиков в виде незначительного уплотнения наружного кортикального слоя под передней капсулой, что отмечается как в опытной, так и в контрольной необлученной группе, что отражает естественные процессы, происходящие в хрусталиках крысы. В опытной группе оптическая прозрачность кортикальных слоев и ядра, оцениваемая биомикроскопически, сохраняется до полутора месяцев, затем развивается слабовыраженное диффузное помутнение в ядре и появляется зернистость в передних и задних кортикальных слоях. Далее, под воздействием УФ излучения помутнения в ядре прогрессируют быстрее, чем в коре. Через 10 месяцев в опытной группе диагностируется однородное облакоподобное помутнение ядра средней степени, менее выраженное однородное помутнение отмечается в передних и задних кортикальных слоях. Это подтверждает формирование полноценной катаракты.

В контрольной группе клиническая картина развития катаракты не отличается от опытной группы, однако помутнение развивается с меньшей скоростью и к концу эксперимента обнаруживается только умеренно выраженное диффузное помутнение в ядре и однородное слабовыраженное помутнение в передних и задних кортикальных слоях хрусталика.

Инструментальную оценку степени помутнения хрусталика осуществляли с помощью микроденситометрии биомикроскопических оптических срезов хрусталиков при помощи специализированной компьютерной программы для анализа офтальмологических цифровых изображений.

Данные микроденситометрии свидетельствуют, что оптическая плотность всех слоев хрусталика у животных опытной группы значительно увеличивается в первые три месяца от начала облучения, после чего темпы этого прироста несколько снижаются. Динамика развития помутнения, таким образом, может быть описана логарифмической функцией (см. линии на рисунках, экстраполирующие экспериментальные точки). Следует отметить, что показатель оптической плотности (ПОП) передней капсулы хрусталика за все время эксперимента практически не меняется, увеличиваясь всего на 10 ед. как в опытной, так и в контрольной группе, что офтальмоскопически проявляется в виде уплотнения капсулы. Наиболее выраженное увеличение ПОП к концу эксперимента отмечено в слоях ядра, прирост его в средних ядерных слоях составил 115 ед.

Динамика развития помутнений в передних кортикальных слоях хрусталика у животных опытной и контрольной группы в единицах показателя оптической плотности (метод микроденситометрии) показана на Фиг.1. Данные представлены в виде среднего значения по группе с указанием 95% доверительного интервала.

В передних и задних кортикальных слоях нарастание помутнений проходило практически одинаково, более медленными темпами, чем в ядре. Прирост ПОП в этих слоях составил 95-100 ед. Динамика развития помутнений в средних ядерных слоях хрусталика у животных опытной и контрольной группы в единицах показателя оптической плотности (метод микроденситометрии) показана на Фиг.2. Данные представлены в виде среднего значения по группе с указанием 95% доверительного интервала.

В контрольной группе в течение всего периода наблюдения диагностировано небольшое равномерное увеличение ПОП во всех исследованных слоях (с 85-90 ед. в начале исследования до 115-120 ед. на завершающем этапе), что может являться свидетельством естественного процесса развития возрастных изменений хрусталика у животного этого вида (Фиг.1, 2).

По данным морфологического исследования у животных контрольной группы не были отмечены нарушения процесса формирования новых волокон хрусталика, кортикальные слои полностью сохраняли свою структуру. Обнаружены незначительные изменения архитектоники и структуры волокон под передней капсулой, где межволоконный отек сопровождался локальной вакуолизацией клеток хрусталика. В области ядра хрусталика отмечены уплотнение и гомогенизация волокон, выражающиеся в нивелировании границ между ними.

В хрусталиках животных облучаемой группы обнаружено расслоение наружных кортикальных слоев, разрушение и отделение передней капсулы хрусталика в результате ослабления межволоконных связей, фрагментация части волокон и их расхождение. В промежуточных кортикальных слоях деструктивные изменения хрусталиковых волокон проявлялись в виде их гомогенизация и отсутствия ядер в результате кариолизиса.

Таким образом, в опытной группе нарушение прозрачности хрусталика в результате длительного воздействия УФ излучения связывают с развитием выраженных структурных нарушений, которые проявляются в виде ослабления межволоконных связей, фрагментации части волокон и межклеточного отека практически во всех отделах хрусталика.

Осуществление изобретения

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве источника УФ излучения использованы ультрафиолетовые кварцевые облучатели, излучающие в диапазоне 280-400 нм и выпускаемые отечественной промышленностью серийно (ОУФК-01 «Солнышко»). Из диапазона была выбрана длина 313 нм. После достижения максимального мидриаза (2-кратная инстилляция Sol. Atropini sulfatis 1%) экспериментальных животных в возрасте 20 -23 дней помещали в клетки. Затем два ультрафиолетовых излучателя располагали над клеткой на специальном штативе, что позволяло соблюсти постоянное расстояние от объекта облучения (0,3 м). Сеансы облучения проводили 1 раз в сутки через день в течение 10 месяцев. Продолжительность сеанса облучения была равна 16 минутам. При соблюдении вышеуказанных условий для данного типа излучателя мощность излучения в плоскости облучаемой структуры для длины волны 313 нм составляет 23,7 Дж/сек·м².

Пролонгированную экспериментальную модель ультрафиолет-индуцированной катаракты можно использовать для исследования антикатарактальной эффективности лекарственных препаратов.

Пример 1.

Крысу №1 в возрасте 20 дней с массой тела 40 г после достижения максимального мидриаза (2-кратная инстилляция Sol. Atropini sulfatis 1%) помещали в клетку. Два ультрафиолетовых излучателя ОУФК-01 «Солнышко» располагали над клеткой на специальном штативе на расстоянии 0,3 м от крысы. Сеансы облучения проводили через день в течение 10 месяцев. Продолжительность сеанса облучения была равна 16 минутам.

Инструментальную оценку степени помутнения хрусталика осуществляли с помощью микроденситометрии биомикроскопических оптических срезов хрусталиков при помощи специализированной компьютерной программы для анализа офтальмологических цифровых изображений.

Биомикроскопию выполняли на щелевой лампе SL-75 (Opton, ФРГ) при угле наклона осветителя 45° и открытии диафрагмы 0,1 мм.

Оценку динамики развития катаракты проводили также при помощи метода экспертных оценок цифровых фотографий хрусталика по бальной системе.

Статистический анализ результатов проводили с использованием непараметрических статистик (U-тест Манна и Уитни и R коэффициент ранговой корреляции Спирмана).

Через 10 месяцев животное забивали передозировкой хлорформного наркоза согласно ARVO Resolution "Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research".

Индуцируемая катаракта характеризовалась относительно длительным месячным скрытым периодом формирования, в течение которого не удается обнаружить ее биомикроскопических клинических признаков. Далее постепенно волокна хрусталика становились неоднородными по своей структуре, формируя более плотную гомогенную ядерную часть, а затем однородное облакоподобное помутнение ядра средней степени выраженности. В передних и задних кортикальных слоях отмечалось менее выраженное однородное помутнение. Передняя капсула хрусталика за все время эксперимента практически не менялась, незначительно уплотняясь. Динамика помутнений хрусталика представлена на Фиг.3. Эти данные подтверждают формирование полноценной катаракты у крысы.

Таким образом, была разработана эффективная экспериментальная модель УФ-индуцированной катаракты, которая в дальнейшем может быть использована для изучения эффективности действия антикатарактальных препаратов.

Способ моделирования катаракты у крыс, включающий ультрафиолетовое облучение, отличающийся тем, что общее облучение начинают у крыс в возрасте 20-23 дней, перед облучением осуществляют медикаментозный мидриаз, облучение проводят при длине волны 313 нм мощностью облучения 23,7 Дж/с·м² в течение 16 мин 1 раз в сутки через день в течение 10 месяцев.