Оптимизированные fc-варианты, имеющие измененное связывание с fc r, и способы их получения

Оптимизированные fc-варианты, имеющие измененное связывание с fc r, и способы их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Эта заявка является частичным продолжением заявки под №10/672280, зарегистрированной в США 26 сентября 2003 года, которая заявляет права в соответствии с 35 U.S.С. §119(е) на все преимущества предварительной заявки под №60/477839, зарегистрированной в США 12 июня 2003 года, предварительной заявки под №60/467606, зарегистрированной в США 2 мая 2003 года, предварительной заявки под №60/414433, зарегистрированной в США 27 сентября 2002 года, и предварительной заявки под №60/442301, зарегистрированной в США 23 января 2003 года, и является частичным продолжением заявки под №10/379392, зарегистрированной в США 3 марта 2003 года. Содержание этих заявок включено сюда путем отсылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Это изобретение имеет отношение к новым оптимизированным вариантам Fc, к конструкторским способам их получения и к их применению, в особенности, в терапевтических целях.

Уровень техники

Антитела представляют собой иммунологические белки, которые связывают специфический антиген. У большинства млекопитающих, включая людей и мышей, антитела построены из спаренных тяжелых и легких полипептидных цепей. Каждая цепь собирается из индивидуальных доменов иммуноглобулина (Ig), и, таким образом, для таких белков используют родовое понятие «иммуноглобулин». Каждая цепь собирается из двух различных участков, относящихся к вариабельной и константной областям. Легкая и тяжелая цепи вариабельной области демонстрируют значительное различие между антителами в последовательности и отвечают за связывание с антигеном-мишенью. Константные области демонстрируют меньшие различия в последовательности и отвечают за связывание с большим количеством природных белков для достижения значимых биохимических эффектов. У человека существуют пять классов антител, включающих IgA (которые включают подклассы IgA1 и IgA2), IgD, IgE, IgG (которые включают подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) и IgM. Характерной особенностью этих классов антител являются их константные области, хотя более тонкие различия могут существовать и в V-области. Фигура 1 показывает антитело IgG1, используемое здесь в качестве примера, чтобы описать основные структурные черты иммуноглобулинов. Антитела IgG представляют собой тетрамерные белки, состоящие из двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Тяжелая цепь IgG состоит из четырех иммуноглобулиновых доменов, соединенных от N-конца к С-концу в порядке V_H-Сγ1-Сγ2-Сγ3, относящихся к вариабельному домену тяжелой цепи, константному домену гамма-1, константному домену гамма-2 и константному домену гамма-3 соответственно. Легкая цепь IgG состоит из двух иммуноглобулиновых доменов, соединенных от N-конца к С-концу в порядке V_L-C_L, относящихся к вариабельному домену легкой цепи и константному домену легкой цепи соответственно.

Вариабельная область антитела содержит антиген-связывающие детерминанты молекулы и, таким образом, обуславливает специфичность антитела в отношении антигена-мишени. Вариабельная область называется так потому, что она наиболее сильно различается по последовательности от других антител внутри одного и того же класса. Наибольшие различия в последовательности обнаруживаются в гипервариабельных участках (участках, определяющих комплементарность (CDR)). Всего существует 6 участков CDR, по три на каждую тяжелую и легкую цепи, обозначаемые как V_HCDR1, V_HCDR2, V_HCDR3, V_LCDR1, V_LCDR2 и V_LCDR3. Вариабельный участок, находящийся вне участков CDR, относится к каркасному участку (FR). Среди различных антител наблюдают различия последовательности в участках FR, хотя и не такие существенные, как в участках CDR. В целом, это характерное строение антител обеспечивает стабильный каркас (участок FR), на основе которого значительное разнообразие связывания антигенов (CDR) может использоваться иммунной системой для достижения специфичности для широкого множества антигенов. Для множества фрагментов вариабельных областей различных организмов доступно некоторое количество структур, определенных с высоким разрешением, некоторые из них находятся в свободном виде, а некоторые находятся в комплексе с антигенами. Последовательность и структурные особенности вариабельных областей антител хорошо охарактеризованы (Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279), консервативные свойства антител позволили разработать множество инженерных технологий для производства антител (Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376). Например, возможно пересадить CDR от одного антитела, например, мышиного антитела, на каркасный участок другого антитела, например, человеческого антитела. Этот процесс, называемый в этой области техники «гуманизацией», позволяет получить менее иммуногенные терапевтические антитела из антител, не имеющих отношения к человеческим. Фрагменты, включающие вариабельную область, могут существовать в отсутствие других областей антитела; такие фрагменты включают, например, антиген-связывающий фрагмент (Fab), включающий V_H-Cγ1 и V_H-C_L; вариабельный фрагмент (Fv), включающий V_H и V_L; одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), включающий V_H и V_L, связанные между собой в одну и ту же цепь, а также множество других фрагментов вариабельной области (Little et al., 2000, Immunol Today 21:364-370).

Участок антитела Fc взаимодействует с различными рецепторами Fc и лигандами, которые сообщают ему множество важных функциональных возможностей, так называемых эффекторных функций. В иммуноглобулинах IgG участок Fc, как показано на Фигуре 1, включает иммуноглобулиновый домен Сγ2 и Сγ3 и N-концевой шарнир, ведущий в Cγ2. Важное семейство рецепторов Fc класса IgG включает рецепторы Fc-гамма (FcγR). Эти рецепторы осуществляют связь между антителами и клеточными механизмами иммунной системы (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). У людей это семейство белков включает FcγRI (CD64), включающий изоформы FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRII (CD32), включающий изоформы FcγRIIa (включающий аллотипы Н131 и R131), FcγRIIb (включающий FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) и FcγRIIc; FcγRIII (CD16), включающий изоформы FcγRIIIa (включающий аллотипы V158 и F158), и FcγRIIIb (включающий аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Эта рецепторы обычно имеют внеклеточный домен, который опосредует связывание с Fc, мембранно-связанный участок и внутриклеточный домен, который может опосредовать некоторые сигнальные события внутри клетки. Эти рецепторы экспрессируются в различных иммунных клетках, включающих моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, В-клетки, большие зернистые лимфоциты, клетки Лангерганса, натуральные киллеры и γγ Т-клетки. Образование комплекса Fc/FcγR направляет эти эффекторные клетки к местам связывания антигенов, что обычно приводит к передаче сигнала в клетках и важным последующим иммунным ответам, таким как высвобождение воспалительных медиаторов, активация В-клеток, эндоцитоз, фагоцитоз и цитотоксическая атака. Способность опосредовать цитотоксическую и фагоцитарную эффекторные функции является потенциальным механизмом, с помощью которого антитела разрушают клетки-мишени. Опосредованная клетками реакция, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие FcγR, узнают антитело, связанное с клеткой-мишенью, и затем вызывают лизис клетки-мишени, называется зависимой от антител цитотоксичностью в отношении клеток-мишеней (ADCC) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Gheitie ey al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). Опосредованную клетками реакцию, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирущие FcγR, узнают антитело, связанное с клеткой-мишенью, и затем вызывают фагоцитоз клетки-мишени, называют зависимым от антител фагоцитозом клеток-мишеней (ADCP). Был определен ряд структур внеклеточных доменов FcγR человека, включающих FcγRsIIa (код доступа в базе данных PDB 1H9V) (Sonderman et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749) FcγRsIIIa (код доступа в базе данных PDB 1FCG) (Maxwell et al., 1999, Nat Struc Biol 6:437-442), FcγRsIIb (код доступа в базе данных PDB 2FCB) (Sondennann et al., 1999, Embo J 18:1095-1103); и FcγRsIIIb (код доступа в базе данных PDB 1E4J) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273). Все FcγR связывает один и тот же участок Fc в N-концевом участке домена Сγ2 и предшествующего шарнирного участка, показанных на фигуре 2. Это взаимодействие хорошо охарактеризовано структурно (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749), и было определено несколько структур Fc человека, связывающихся с внеклеточным доменом FcγRsIIIb человека (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273) (код доступа в базе данных PDB 1IIS и 1IIX) (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477), а также структура комплекса человеческого IgE Fc/FcεRIα (код доступа в базе данных PDB 1F6A) (Garman et al., 2000, Nature 406:259-266).

Различные подклассы IgG обладают различным сродством к FcγR, обычно IgG1 и IgG3 лучше связываются с рецепторами, чем IgG2 и IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett. 82:57-65). Все FcγR связываются с одним и тем же участком Fc IgG, но с различным сродством: FcγRI, связывающий с самой высокой аффинностью, имеет K_d для IgG1, равную 10^-8 М, тогда как рецепторы с низкой аффинностью, FcγRII и FcγRIII, связываются при 10^-6 М и 10^-5 М соответственно. Внеклеточные домены FcγRIIIa и FcγRIIIb идентичны на 96%, однако FcγRIIIb не имеет внутриклеточного сигнального домена. Кроме того, поскольку FcγRI, FcγRIIa/c и FcγRIIIa являются положительными регуляторами активации, запускаемой иммунным комплексом, они характеризуются наличием внутриклеточного домена, в состав которого входит мотив иммунорецепторной тирозин-зависимой активации (ITAM), FcγRIIb имеет в своем составе мотив иммунорецепторного тирозин-зависимого ингибирования (ITIM) и поэтому является ингибитором. Таким образом, первые рецепторы относятся к активирующим рецепторам, а FcγRIIb относится к ингибирующим рецепторам. Рецепторы также различаются по характеру и уровням экспрессии на различных иммунных клетках. Еще один уровень сложности состоит в существовании полиморфизма FcγR в человеческом протеоме. Особенно важным полиморфизмом с клиническим значением являются формы V158/F158 FcγRIIIa. IgG1 человека связывается с более высокой аффинностью с аллотипом V158 по сравнению с аллотипом F158. Показано, что различие в аффинности и предположительно влияние этого различия на ADCC и/или ADCP являются существенным показателем эффективности антитела к CD20 ритуксимаба (Rituxan®, зарегистрированная торговая марка корпорации IDEC Pharmaceuticals Corporation). Пациенты с аллотипом V158 благоприятно реагируют на лечение ритуксимабом, однако пациенты с аллотипом F158, обладающим более низкой аффиностью, слабо отвечают на такое лечение (Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758). Приблизительно 10-20% людей являются гомозиготами V158/V158, 45% являются гетерозиготами V158/F158 и 35-45% людей являются гомозиготами F158/F158 (Lehmbecher et al., 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758). Таким образом, 80-90% людей являются слабо реагирующими, так как у них есть, по меньшей мере, одна аллель F158 FcγRIIIa.

Перекрывающийся, но индивидуальный участок на Fc, показанный на фигуре 1, служит контактной поверхностью при взаимодействии с белком комплемента C1q. Тем же самым способом, при котором связывание Fc/FcγR опосредует ADCC, связывание Fc/C1q опосредует зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC). Чтобы сформировать комплекс С1, C1q образует комплекс с сериновыми протеазами С1r и C1s. C1q способен к связыванию с шестью антителами, хотя для активации каскада комплемента достаточно связывания с двумя IgG. Подобно взаимодействию Fc с FcγR различные подклассы IgG обладают различной аффинностью к C1q, обычно IgG1 и IgG3 лучше связываются с FcγR, чем IgG2 и IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett. 82:57-65). В настоящее время сведения о структуре комплекса Fc/C1q отсутствуют, однако, в результате мутагенезных исследований было картировано место связывания IgG человека с C1q для участка, включающего остатки D270, К322, К326, Р329 и Р331 и Е333 (Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178-4184; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571-2575).

Участок на Fc между доменами Cγ2 и Сγ3, показанный на фигуре 1, опосредует взаимодействие с неонатальным рецептором FcRn, связывание которого приводит к рециркуляции эндоцитированного антитела из эндосомы обратно в кровяное русло (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). Этот процесс, сопряженный с исключением почечной фильтрации из-за большого размера полноразмерной молекулы, приводит к тому, что время полужизни антител в сыворотке благоприятно составляет диапазон от одной до трех недель. Связывание Fc с FcRn также играет ключевую роль в транспорте антител. Участок связывания для FcRn на Fc также является участком, в котором связываются бактериальные белки А и G. Прочное связывание с помощью этих белков обычно используется в качестве способа очистки антител при применении белок А- или белок G-аффинной хроматографии во время очистки белков. Таким образом, точное воспроизведение этого участка на Fc очень существенно как для клинических свойств антител, так и для их очистки. Имеющиеся в распоряжении структуры крысиного комплекса Fc/FcRn (Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877) и комплексов с белками А и G (Deisenhofer et al., 1981, Biochemistry 20:2361-2370; Sauer-Eriksson et al., 1995, Structure 3:265-278; Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481) обеспечивают понимание того, как происходит взаимодействие Fc с этими белками.

Ключевой чертой Fc-участка является консервативное N-гликозилирование, показанное на фигуре 1, которое обнаруживают на остатке N297. Этот углевод или олигосахарид, как его иногда называют, играет особую структурную и функциональную роль в антителе, что является одной из принципиальных причин, по которой антитела должны продуцироваться с применением экспрессионных систем млекопитающих. Без намерения быть ограниченными определенной теорией, полагают, что структурная роль этого углевода состоит в стабилизации или солюбилизации Fc, так как он определяет специфический угол или степень гибкости между доменами Cγ3 и Сγ2, удерживает два домена Сγ2 от агрегации с еще одним через центральную ось; или в комбинации этих эффектов. Для эффективного связывания Fc с FcγR и C1q эта модификация необходима, и изменения в составе углевода при остатке N297 или его удаление влияет на связывание с этими бежами (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26773-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147). Однако углевод образует малый (если вообще образует) специфический контакт с FcγR (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477), что указывает на то, что функциональная роль углевода при N297 в опосредовании Fc/FcγR связывания может осуществляться через структурную роль, которую он играет в определении конформации Fc. Это подтверждается набором кристаллических структур четырех различных гликоформ Fc, которые показывают, что состав олигосахарида сильно воздействует на конформацию Сγ2 и, как результат этого, на взаимодействие Fc/FcγR (Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979-989).

Характерные черты антител, обсужденные выше, - специфичность по отношению к мишени, способность опосредовать иммунные эффекторные механизмы и большое полувремя жизни в сыворотке крови - делают антитела мощным терапевтическим средством. Моноклональные антитела применяются в терапевтических целях для лечения многих состояний, включающих рак, воспаление и сердечно-сосудистые заболевания. В настоящее время на рынке существует свыше десятка продуктов антител и сотни продуктов в стадии разработки. В дополнение к антителам имеется антитело-подобный белок, представляющий собой слитый Fс, роль которого в исследованиях и терапии все время увеличивается (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). Слитый Fc представляет собой белок, в котором один или несколько полипептидов функционально связаны с Fc. Слитый Fc объединяет Fc-участок антитела и, следовательно, его благоприятные эффекторные функции и фармакокинетику со связывающим мишень участком рецептора, лиганда или другого белка или белкового домена. Роль последнего состоит в том, что он опосредует узнавание мишени, и, таким образом, он является функциональным аналогом вариабельной области антитела. Из-за структурного и функционального перекрывают слитых с Fc белков с антителами обсуждение антител в настоящем изобретении прямо распространяется на слитые с Fc белки.

Несмотря на такое широкое применение, антитела не оптимизированы для клинического использования. Двумя существенными недостатками антител являются их субоптимальная противораковая эффективность и высокие производственные требования. На устранение этих недостатков было направлено настоящее изобретение.

Сγществует ряд возможных механизмов, с помощью которых антитела разрушают опухолевые клетки, включающих антипролиферацию посредством блокирования необходимых для роста метаболических путей; внутриклеточную передачу сигнала, приводящую к апоптозу; усиленную понижающую регуляцию и/или усиленный оборот рецепторов; CDC, ADCC, ADCP и стимуляцию адаптивного иммунного ответа (Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Giennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410). Противоопухолевая эффективность может быть обусловлена комбинацией этих механизмов, и оказывается, что их относительная важность в клинической терапии является зависящей от рака. Несмотря на этот арсенал противоопухолевых средств, активность антител в качестве противоопухолевых средств является неудовлетворительной, в частности, из-за их высокой стоимости. Данные о реакции пациентов, страдающих опухолями, показывают, что моноклональные антитела обеспечивают лишь незначительное улучшение в терапевтическом успехе по сравнению с обычной цитотоксической химиотерапией одним-единственным средством. Например, только половина из всех пациентов с рецидивной неходжкинской лимфомой начальной стадии чувствительны к терапии антителом к CD20 ритуксимабом (McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825-2833). Из 166 клинических пациентов 6% продемонстрировали полную чувствительность и 42% продемонстрировали частичную чувствительность со средней продолжительностью ответа, составляющей приблизительно 12 месяцев. Трастузумаб (Herceptin®, зарегистрированная торговая марка фирмы Genentech), антитело к HER2/neu, применяемое для лечения метастатического рака молочной железы, обладает меньшей эффективностью. Доля полного ответа при использовании трастузумаба для 222 протестированных пациентов составила только 15%, где было 8 полных и 26 частичных ответов, а средняя продолжительность ответа и выживания составила от 9 до 13 месяцев (Cobleigh et al., 1999, J Clin Oncol 17:2639-2648). В настоящее время для противораковой терапии любое небольшое улучшение в уровне смертности определяется как успех. Таким образом, существует значительная необходимость в увеличении способности антител разрушать раковые клетки-мишени.

Многообещающим способом увеличения противоопухолевой активности антител является усиление их способности опосредовать цитотоксические эффекторные функции, такие как ADCC, ADCP и CDC. Важность эффекторных функций, опосредованных FcγR, для противораковой активности была продемонстрирована на мышах (Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:652-656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443-446), и аффинность связывания Fc с определенными FcγR коррелировала в клеточных исследованиях с целевой цитотоксичностью (Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740). Кроме того, наблюдали корреляцию между клинической эффективностью у людей и их аллотипам по полиморфным формам FcγRIIIa с высокой (V158) и низкой (F158) аффинностью (Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758). Вместе эти данные позволяют предположить, что антитело с участком Fc, оптимизированным под связывание с определенными FcγR, может лучше опосредовать эффекторные функции и, таким образом, более эффективно разрушать раковые клетки пациентов. Баланс между активирующими и ингибирующими рецепторами заслуживает особого внимания, и оптимальная эффекторная функция может быть обусловлена участием Fc с увеличенной аффиностью по отношению к активирующим рецепторам, например, FcγRI, FcγRII/c и FcγRIIIa и, кроме того, с пониженной аффиностью к ингибирующему рецептору FcγRIIb. Кроме того, так как FcγR могут опосредовать поглощение антигена и процессинг с помощью антигенпрезентирующих клеток, увеличенная аффинность Fc/FcγR также может улучшить эффективность терапии антителами, вызывая адаптивный иммунный ответ.

Для различных целей на Fc проводили мутагенные исследования с помощью обычно производимых замен на аланин (так называемое аланиновое сканирование) или с помощью замен, определяемых гомологией последовательностей (Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 129:2613-2624; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65) (US 5624821; US 5885573; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572). Большинство замен уменьшает или ликвидирует связывание с FcγR. Однако при получении вариантов Fc с высокой аффинностью к FcγR (см., например, US 5624821 и PCT WO 00/46072) был достигнут некоторый успех. Например, Winter et al. заменяли аминокислотный остаток в положении 235 мышиного антитела IgG2b (мутация глутаминовой кислоты на лейцин), что увеличивало связывание мышиного антитела с человеческим FcγRI в 100 раз (Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564) (US 5624821). Shields et al. использовали аланиновый сканирующий мутагенез, чтобы картировать остатки Fc, важные для связывания с FcγR, с последующей заменой выбранных остатков с помощью неаланиновых мутаций (Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490) (PCT WO 00/42072). Несколько мутаций, подробно описанных в этом исследовании и включающих S298A, Е333А и K334А, показали улучшенное связывание с активирующим рецептором FCγRsIIIa и уменьшенное связывание с ингибирующим рецептором FCγRIIb. Эти мутации были объединены, чтобы получить варианты с двойной и тройной мутацией, которые демонстрируют аддитивное улучшение в связывании. Наилучший вариант, раскрытый в этом исследовании, - тройной мутант S298A/E333A/K334A с приблизительно 1,7-кратным увеличением связывания с F158 FcγRIIIa, с 5-кратным уменьшением связывания с FcγRIIb и 2,1-кратным увеличением ADCC.

Увеличенная аффинность Fc к FCγR также была достигнута при применении сконструированных гликоформ, созданных с помощью экспрессии антител в сконструированных или вариантных клеточных линиях (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J boil Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473). Этот подход приводил к значительному увеличению способности антител связываться с FcγRIIIa и опосредовать ADCC. Хотя существуют практические ограничения, такие как эффективность роста экспрессирующих линий в условиях крупномасштабного производства, этот подход для увеличения аффинности Fc/FcγR и эффекторной функции очень обнадеживает. Действительно, объединение этих альтернативных технологий производства гликоформ с вариантами Fc настоящего изобретения может обеспечить аддитивные или синергические эффекты для оптимальной эффекторной функции.

Хотя существует необходимость в более значительной эффекторной функции, для некоторых видов терапии антителами было бы желательно иметь сниженную или полностью ликвидированную эффекторную функцию. Это часто бывает в случае терапевтических антител, механизм действия которых включает блокирование или антагонизм, но не гибель клеток, несущих антиген-мишень. В этих случаях уменьшение количества клеток-мишеней нежелательно и может рассматриваться как побочный эффект. Например, способность антител к CD4 блокировать CD4-рецепторы на Т-клетках делает их эффективным противовоспалительным средством, помимо этого, их способность рекрутировать FcγR-рецепторы также направляет иммунную атаку против клеток-мишеней, что приводит к уменьшению количества Т-клеток (Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933). Эффекторная функция также может быть проблемой для антител с радиоактивной меткой, называемых радиоконъюгатами, и антител, конъюгированных с токсинами, называемых иммунотоксинами. Эти лекарственные средства можно применять для разрушения раковых клеток, но рекрутирование иммунных клеток посредством взаимодействия Fc с FcγR-рецепторами приводит здоровые иммунные клетки в непосредственную близость к летальной нагрузке (радиация или токсин), что приводит к истощению нормальной лимфоидной ткани наравне с раковыми клетками-мишенями (Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11980-11984; White et al., 2001, Annu Rev Med 52:125-145). Эту проблему можно обойти, используя изотипы IgG, которые плохо связывают комплемент или эффекторные клетки, например IgG2 и IgG4. Альтернативным решением является разработка вариантов Fc с пониженным или полностью ликвидированным связыванием (Alegre et al., 1994, Transplantatio 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11980-11984; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 129:2613-2624; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604) (US 6194551; US 5885573; PCT WO 99/58572). Критическое соображение для уменьшения или ликвидации эффекторной функции состоит в том, что другие важные свойства антител не должны быть нарушены. Варианты Fc должны конструироваться таким образом, чтобы в них не только исчезало связывание с FcγR и/или Cq1, но также поддерживалась стабильность антител, растворимость и структурная целостность, а также способность взаимодействовать и с другими важными лигандами Fc, такими как FcRn и белками А и G.

Настоящее изобретение направлено на исправление другого большого недостатка антител, а именно на высокие требования, предъявляемые к их производству (Garber et al., 2001, Nat Biotechnol 19:184-185; Dove et al., 2002, Nat Biotechnol 20:777-779). Антитела должны экспрессироваться в клетках млекопитающих, и в настоящее время антитела, имеющиеся в продаже, вместе с другими биотерапевтическими средствами, пользующимися высоким спросом, по существу, поглощают всю доступную производственную мощность. Несмотря на создание сотен биопрепаратов, большую часть которых составляют антитела, существует срочная необходимость в более действенных и более дешевых способах производства. Последствия недостаточной производственной мощности при выпуске антител трояки. Во-первых, это драматическим образом повышает стоимость товаров для поставщиков, которая затем будет перенесена на пациента. Во-вторых, она мешает промышленному производству апробированных продуктов на основе антител, ограничивая доступность высоковостребованной терапии для пациентов. И, наконец, так как клинические испытания требуют большого количества белка, который пока еще не является прибыльным, недостаточное обеспечение задерживает прогресс нарастающего поступления антител на рынок.

При попытке смягчить эту проблему были исследованы альтернативные способы производства. Трансгенные растения и животные рассматриваются как более дешевые и более производительные продуцирующие системы (Chad et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:188-194). Такие экспрессионные системы, однако, могут продуцировать профили гликозилированные, отличающиеся существенным образом от человеческих гликопротеинов. Это может привести к снижению или даже полной потере эффекторной функции, потому что, как было описано выше, структура углевода может существенным образом воздействовать на связывание FcγR и комплемента. Потенциально более серьезной проблемой с гликоформами, не имеющими отношения к человеку, может быть иммуногенность; углеводы являются ключевым источником антигенности для иммунной системы, и присутствие гликоформ, не имеющих отношения к человеку, дает значительный шанс появления антител, которые нейтрализуют терапию или, еще хуже, вызывают неблагоприятные иммунные реакции. Таким образом, эффективность и безопасность антител, продуцированных трансгенными растениями и животными, остается неясной. Экспрессия бактериями является другим привлекательным способом решения проблемы продукции антител. Экспрессия в бактериях, например в Е.coli, обеспечивает доходный и высокоемкий способ продуцирования белков. Для сложных белков, таких как антитела, существует несколько препятствий для бактериальной экспрессии, включающих фолдинг и сборку этих сложных молекул, образование правильных дисульфидных связей и растворимость, стабильность и функциональность в отсутствие гликозилирования, так как белки, экспрессированные в бактериях, не гликозилируются. Полноразмерные негликозилированные антитела, которые связывают антиген, были успешно экспрессированы в Е.coli (Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147), и, таким образом, фолдинг, сборка и образование правильных дисульфидных связей в антителах, экспрессированных в бактериях, возможны в отсутствие эукариотического аппарата шаперонов. Однако максимальная выгода экспрессированных в бактериях антител в терапии затруднена из-за потери гликозилирования, что приводит к потере эффекторной функции и может привести к плохой стабильности и растворимости. Это может создавать проблему для композиций при высоких концентрациях, применяемых в течение продолжительного периода, необходимого для клинического использования.

Агликозилированный Fc с подходящими свойствами в растворе и способностью опосредовать эффекторные функции мог бы обеспечить возможность альтернативных способов продукции, описанных выше. После преодоления структурных и функциональных недостатков агликозилированного Fc антитела могут продуцироваться в бактериях и трансгенных растениях и животных с уменьшенным риском иммуногенности и с эффекторной функцией для клинических применений, в которых цитотоксичность является желаемой, как, например, при раке. Настоящее изобретение описывает применение способов конструирования белков для разработки стабильных растворимых вариантов Fc с эффекторными функциями. В настоящее время такие варианты Fc не существуют в этой области техники.

Подведем краткий итог: существует потребность в антителах с улучшенными терапевтическими свойствами. Конструирование оптимизированных или улучшенных вариантов Fc является перспективным подходом для удовлетворения этой потребности. Тем не менее, значительной помехой для конструирования вариантов Fc с желаемыми свойствами является трудность прогнозирования того, какие аминокислотные модификации из огромного числа возможностей приведут к желаемой цели, это также сопряжено с неэффективной продукцией и способами скрининга антител. Действительно, одна из принципиальных причин для недостаточного успеха предшествующих исследований состояла в том, что до сих пор подходы к конструированию Fc включали выбранные наугад способы, такие как аланиновое сканирование или продукцию гликоформ с использованием различных экспрессионных штаммов. В этих исследованиях сделанные модификации Fc были выполнены полностью или частично случайным образом в надежде получить варианты с выгодными свойствами. Настоящее изобретение обеспечивает разнообразие способов конструирования, многие из которых основаны на более сложных и результативных технологиях, которые могут применяться для того, чтобы преодолеть эти помехи в целях разработки вариантов Fc, оптимизированных в отношении желаемых свойств. Описанные способы конструирования обеспечивают желаемую стратегию для руководства модификацией Fc, способы компьютерного скрининга для разработки пригодных вариантов Fc, подходов для создания библиотеки для определения перспективных вариантов для экспериментального исследования и набор способов экспериментального производства и скрининга для определения вариантов Fc с пригодными свойствами.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает варианты Fc, оптимизированные в отношении целого ряда терапевтически значимых свойств. Эти варианты Fc обычно включены в состав вариантного белка, который преимущественно включает антитело или слитый Fc.

Цель настоящего изобретения состоит в обеспечении новых положений в последовательности Fc, в которых можно осуществить аминокислотные модификации для того, чтобы получить оптимизированные варианты Fc. Указанные положения в Fc включают остатки 230, 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 273, 275, 299, 302, 313, 323, 325, 328 и 332, в которых нумерация остатков в Fc-участке соответствует индексу EU в базе данных Kabat. Настоящее изобретение описывает любые аминокислотные модификации в любом из указанных новых положений в последовательности Fc, сделанные для того, чтобы получить оптимизированный вариант Fc.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение вариантов Fc, которые были отобраны с помощью расчетов. Отобранный с помощью вычислений вариант Fc представляет собой вариант, прогнозированный с помощью расчетов вычислительного скрининга, описанных здесь, который обладает значительно более высоким потенциалом по сравнению с вариантом, оптимизированным для желаемых свойств, но выбранным случайным образом. В этом случае расчеты вычислительного скрининга выполняют функцию предварительного исследования или служат суррогатной заменой экспериментального отбора и, таким образом, указанные отобранные с помощью вычислений варианты Fc рассматриваются как новаторские.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение вариантов Fc, которые были охарактеризованы с помощью одного или нескольких экспериментальных способов, описанных здесь. В одном из воплощений указанные варианты Fc включают, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, состоящей из: 230, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 283, 296, 297, 298, 299, 302, 313, 318, 320, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334 и 335, где нумерация остатков в Fc-участке соответствует индексу EU в базе данных Kabat. В одном из воплощений указанные варианты Fc включают, по меньшей мере, одну аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, состоящей из: 221, 222, 224, 227, 228, 230, 231, 223, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 258, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 283, 285, 286, 288, 290, 291, 293, 294, 295, 296, 297, 298,299, 300, 302, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 и 428, где нумерация остатков в Fc-участке соответствует индексу EU в базе данных Kabat. В предпочтительном воплощении указанные варианты Fc включают, по меньшей мере, одну замену, выбранную из группы, состоящей из: Р230А, E233D, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239T, S239H, S239Y, V240I, V240A, V240T, V240M, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L, F243Y, F243R, F243Q, Р244Н, Р245А, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M, V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264Y, V264E, D265G, D265N, D265Q, D265Y, D265F, D265V, D265I, D265L, D265H, D265T, V266I, V266A, V266T, V266M, S267Q, S267L, S267T, S267H, S267D, S267N, Е269Н, E269Y, E269F, E269R, Е269Т, E269L, E269N, D270Q, D270T, D270H, E272S, Е272К, E272I, E272Y, V273I, К274Т, К274Е, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276S, N276E, N276R, N276L, N276Y, Y278T, Y278E, Y278K, Y278W, E283R, Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E, А298Н, T299I, T299L, Т299А, T299S, T299V, Т299Н, T299F, Т299Е, V302I, W313F, E318R, К320Т, K320D, K320I, К322Т, К322Н, V323I, S324T, S324D, S324R, S324I, S324V, S324L, S324Y, N325Q, N325L, N325I, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, K326L, K326I, К326Т, A327N, A327L, A327D, А327Т, L328M, L328D, L328E, L328N, L328Q, L328F, L328I, L328V, L328T, L328H, L328A, P329F, A330L, A330Y, A330V, A330I, A330F, A330R, А330Н, A330S, A330W, А330М, P331V, Р331Н, I332D, I332E, I332N, I332Q, I332T, I332H, I332Y, I332A, ЕЗЗЗТ, Е333Н, E333I, E333Y, K334I, К334Т, K334F, T335D, T335R и T335Y, где нумерация остатков в Fc-участке соответствует индексу EU в базе данных Kabat. В наиболее предпочтительном воплощении указанные варианты Fc выбраны из группы, состоящей из: V264L, V264I, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V264I, F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, I332E, L328MA332E, Р244Н, Р245А, P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G; V264M332E, F241E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, 8298А/I332Е, 8239Е/I332Е, S239Q/I332E, S239E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T299I, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, A330Y, I332D, N297S, N297D, N297S/I332E, N297D/I332E, N297E/I332E, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, D265F/N297E/I332E, L328I/I332E, L328Q/I332E, I332N, I332Q, V264T, V264F, V240I, V263I, V266I, T299A, T299S, T299V, N325Q, N325L, N3251, S239D, S239N, S239F, S239D/I332D, S239D/I332Е, 8239D/I332Н, S239D/I332Q, 8239Е/I332Q, 8239Е/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, 8239Н/I332Е, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332D, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, Y296D, Y296N, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, А330L/I332Е, V264I/А330L/I332Е, А330L/I332Е, V264I/A330L/I332E, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239T, S239H, S239Y, V240A, V240T, V240M, V263A, V263T, V263M, V264M, V264Y, V266A, V266T, V266M, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, A298H, T299H, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, L328D/I332E, L328Е/I332Е, L328N/I332Е, L328Q/I332Е, L328V/I332E, L328Т/I332Е, L328Н/I332Е, L328I/I332E, L328A, I332T, I332H, I332Y, I332A, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239Е/N297D/I332Е, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E, S239D/D265L/N297D/I332E, S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, S239D/D265T/N297D/1332E, V264E/N297D/I332E, Y296D/N297D/I332E, Y296E/N297D/I332E, Y296N/N297D/I332E, Y296Q/N297D/I332E, Y296H/N297D/I332E,