Вольтамперометрический способ количественного определения альдостерона

Вольтамперометрический способ количественного определения альдостерона

Реферат

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к вольтамперометрическим способам количественного определения гормонов (катехоламинов, инсулина, кортикостероидов), и может быть использовано в диагностике гипертензии, почечной недостаточности, контроле за лечением сердечной недостаточности, а также при лечении препаратами, блокирующими адренергическую систему.

Альдостерон - главный минералокортикоид. Образуется в корковом слое надпочечников под контролем системы ренин-ангиотензин. Стимулирует транспорт натрия через почечные канальцы. По химической структуре представляет собой 11β, 21-дигидрокси-3,20-диоксипрегнен-4-аль-18 (18-оксокортикостерон) [Справочник биохимика / Под ред. Р.Досон, Д.Элиот, У.Элиот, К.Джонс. - М.: Издательство «Мир», 1991, - 167 с.].

На сегодняшний день в клинической практике для количественной оценки альдостерона в сыворотке крови используется иммуноферментный метод (прототип). Авторы не нашли работ по использованию данного метода для определения альдостерона в моче и слюне.

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на избирательности и специфичности иммунологических реакций «антиген-антитело». Аналитической мишенью для антител тест-систем могут быть иммуноглобулины, гормоны как белковой, так и стероидной природы, транспортные и структурные белки и другие высокомолекулярные биологические соединения. Далее фермент, присоединенный к антителам тест-систем, катализирует химическую реакцию окисления какого-либо пигмента-индикатора. Произошедшая цветовая реакция пропорциональна предшествующей иммунологической, что позволяет выявить и количественно измерить в исследуемом биоматериале искомый антиген или антитела [Современные методы лабораторной диагностики (ИФА, ПЦР) / Н.А.Кривенчук, О.В.Решетников, И.Ю.Зимина и соавт. - Новосибирск: Издательство «Нонпарель», 2004. - С.6-7].

Способ-прототип имеет высокую чувствительность, но не обеспечивает экспрессности определения (продолжительность одного анализа составляет 2 часа 15 минут), стоимость тест-набора для проведения ИФА от 9000 рублей.

Один набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контрольные образцы. Такое количество проб возможно только при большом потоке больных, нуждающихся в определении уровня альдостерона. Для исследования небольшой партии проб возможны 12 независимых постановок по 5 анализов каждая. Стрипы стабильны после вскрытия упаковки в течение 4 недель при 2-8°С, что ограничивает возможное количество определений. Внесение контрольных и исследуемых образцов необходимо проводить достаточно быстро, так как при длительном времени внесения образцов в лунки стрипа времена инкубации первого и последнего образцов значительно отличаются, что может привести к неправильной оценке результатов. Пробоподготовка: у большинства тест-наборов исследуемая сыворотка требует дополнительного разведения. Неточность разведения может дать неправильный результат. Сыворотку, содержащую осадок, необходимо перед анализом дополнительно центрифугировать. Необходимо каждый раз готовить раствор для отмывки планшета. Для каждого определения непосредственно перед использованием готовят: раствор конъюгата (срок хранения приготовленного раствора до 30 минут при 18-25°С); раствор тетраметилбензидина (при приготовлении следует исключить действие света, срок хранения раствора до 20 минут при 18-25°С в темном месте). В качестве раствора стоп-реагента используется серная кислота с концентрацией 1 моль/л, это требует дополнительной осторожности от лаборанта, т.к. кислота парит, что приводит к ее вдыханию и воздействию паров на кожу и слизистые.

Раскрытие изобретения

Предлагаемый способ характеризуется высокой чувствительностью (10^-10 мг/мл). Он позволяет определить альдостерон не только в сыворотке крови, но также в моче и слюне. Предлагаемый способ по сравнению с прототипом увеличивает экспрессность определения альдостерона, является менее затратным, более простым в осуществлении, в нем не используются ядовитые и сильнодействующие вещества.

Суть предлагаемого вольтамперометрического способа определения альдостерона [11β, 21-дигидрокси-3,20-диоксипрегнен-4-аль-18; 18-оксокортикостерон] состоит в том, что проводят электрохимическое концентрирование альдостерона на поверхности стеклоуглеродного электрода в течение 60 с (при 18-22°С) при потенциале электролиза 0,4 В на фоне 0,1 моль/л алюминия нитрата с последующей регистрацией анодных вольтамперных кривых при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с, а концентрацию альдостерона определяют по высоте волны при значении потенциала 0,7 В относительно хлорсеребряного электрода.

Определение альдостерона проводят на вольтамперометрическом анализаторе ТА-4.

Для электрохимического концентрирования альдостерона на поверхности стеклоуглеродного электрода через раствор при перемешивании пропускают газообразный азот с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с, для удаления кислорода из электрохимической ячейки и, не прекращая подачи азота и перемешивания раствора, проводят электролиз раствора при потенциале 0,4 В в течение 60 с.

Все условия определения альдостерона подобраны экспериментально. Приготовление фоновых и стандартных растворов альдостерона является общепринятым.

В процессе поиска оптимальных условий вольтамперометрического определения альдостерона было изучено влияние ряда факторов на высоту аналитического сигнала: индикаторного электрода; фонового электролита, его концентрация и рН; времени и потенциала электролиза; скорости и варианта развертки потенциала.

В качестве индикаторного (рабочего) электрода были исследованы стеклоуглеродный и ртутно-пленочный электроды. Для осуществления предлагаемого способа был выбран стеклоуглеродный электрод, представляющий собой стеклянный полый стержень, в который запакована под вакуумом медная проволока с прикрепленным серебряным стержнем, выполняющим функции проводника и служащим для закрепления электрода в приборе. Рабочей поверхностью является стеклоуглеродная подложка, которая находится на рабочем конце электрода и помещается в датчик. Преимуществом такого электрода является возможность получения более четкого аналитического сигнала альдостерона, служащего количественной характеристикой определяемого вещества, что повышает разрешающую способность метода. Альдостерон легко адсорбируется на рабочей поверхности стеклоуглерода, это позволяет концентрировать его на электроактивном электроде.

В качестве фоновых электролитов были исследованы растворы гидроксидов натрия, калия; хлоридов натрия, кальция; фосфата и гидрофосфата натрия; нитратов натрия, алюминия, аммония. Исходя из полученных результатов, в качестве фонового электролита был выбран раствор алюминия нитрата, так как при его использовании на вольтамперограмме наблюдалась четкая волна восстановления альдостерона. Кроме того, данный раствор обеспечивал широкую рабочую область, хорошую электропроводность и необходимую площадь для обработки сигнала, был прост в приготовлении.

Оптимальная концентрация раствора алюминия нитрата составила 0,1 моль/л. В более концентрированных растворах мы не наблюдали прироста величины волны вольтамперограммы от добавки стандартного раствора альдостерона, тогда как более разбавленный раствор не обеспечивал необходимую площадь для обработки сигнала.

Диапазон возможных значений рН фонового электролита составил 3,0-4,0. В нейтральной среде при подобранных условиях сигнал альдостерона отсутствовал, а в щелочной - резко сужалась рабочая область и возрастала величина остаточного тока, при этом невозможно было зафиксировать высоту волны альдостерона. Результаты эксперимента показали, что оптимальным решением является электролиз без добавления дополнительных буферных растворов, что соответствует необходимым границам рН 3,0-4,0.

Оптимальное время накопления альдостерона на электроде составило 60 с. При этом достигаются максимальное значение величины тока растворения накопленных осадков с поверхности стеклоуглеродного электрода и хорошая воспроизводимость результатов его количественного определения. При увеличении времени накопления более 60 с происходит насыщение осадка на электроде, аналитический сигнал альдостерона искажается и затрудняется обработка полярограмм. При времени накопления менее 60 с величина тока растворения не достигает максимального значения, что снижает чувствительность определения исследуемого вещества (табл.1).

Оптимальный потенциал электролиза составил 0,4 В. При значениях потенциала электролиза менее 0,4 В величина регистрируемого анодного тока значительно уменьшается, что снижает чувствительность определения, а при значениях потенциала электролиза более 0,4 В происходит частичное накопление осадка (неполное извлечение анализируемого вещества) (табл.2).

Экспериментально найденная оптимальная скорость развертки потенциала составила 90 мВ/с. Изменение скорости развертки потенциала в сторону увеличения или уменьшения заметно снижало высоту аналитического сигнала, при этом уменьшалась и разрешающая способность метода, что затрудняло обработку подпрограмм, увеличивало время анализа и не позволяло определять очень низкие концентрации альдостерона. Форма развертки потенциала была подобрана экспериментально. Для определения альдостерона оптимальной оказалась квадратно-волновая скорость развертки потенциала. При квадратно-волновой форме скорости развертки потенциала наиболее четко просматривался аналитический сигнал.

Чувствительность предлагаемого вольтамперометрического способа определения альдостерона в модельном растворе, в сыворотке крови, в моче и в слюне составляет 10^-10 мг/мл.

У здорового человека содержание альдостерона в крови составляет 20-220 пмоль/л (7,209·10^-9 мг/мл до 79,299·10^-9 мг/мл, или 7,9299·10^-8-7,209·10^-9 мг/мл). Предлагаемый способ позволяет определять альдостерон в диапазоне концентраций 10^-7-10^-10 мг/мл, что позволяет определять как пониженный, так и повышенный уровень альдостерона в указанных биологических средах.

Относительное стандартное отклонение для диапазона концентраций альдостерона 10^-7-10^-10 мг/мл не превышает 1,5% в модельном растворе; 2,2% в сыворотке крови; 2% в моче и 4,2% в слюне.

Предлагаемый способ не предполагает дополнительной пробоподготовки, как при иммуноферментном способе определения гормонов (приготовление раствора для отмывки планшета; приготовление раствора конъюгата; приготовление раствора тетраметилбензидина; дополнительного разведения сыворотки; сыворотка, содержащая осадок, не требует дополнительного очищения центрифугированием).

Время, необходимое для проведения единичного определения альдостерона, не превышает 10 мин.

Пример 1. Определение альдостерона методом анодной вольтамперометрии с накоплением в модельном растворе.

В стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,1 моль/л раствора алюминия нитрата. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой форме скорости развертки потенциала 90 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют 0,06 мл стандартного раствора альдостерона с концентрацией 10^-7 мг/мл. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с относительно хлорсеребряного электрода.

Аналитический сигнал регистрируют при значении потенциала 0,7 В.

Время единичного анализа не превышает 10 мин.

Правильность установленных параметров методики проверяли методом «введено-найдено» (табл.3; табл.3.1).

Аналогичное определение было проведено в модельном растворе с концентрацией введенного раствора альдостерона 10^-10 мг/мл (табл.4; табл.4.1)

Пример 2. Определение альдостерона методом анодной вольтамперометрии с накоплением в биологической среде (сыворотке крови).

В стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,1 моль/л раствора алюминия нитрата. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют 0,02 мл сыворотки крови, содержащей альдостерон. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с.

Затем добавляем 0,02 мл стандартного раствора альдостерона с концентрацией 10^-7 мг/мл. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с.

Аналитический сигнал регистрируют при значении потенциала 0,7 В. По высоте волны прибор определяет концентрацию альдостерона в сыворотке крови.

Правильность установленных параметров методики была проверена методом «введено-найдено» (табл.5; табл.5.1)

Аналогичное определение было проведено в сыворотке крови с концентрацией введенного раствора альдостерона 10^-10 мг/мл (табл.6; табл.6.1).

Пример 3. Определение альдостерона методом анодной вольтамперометрии с накоплением в биологической среде (суточном объеме мочи).

В стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,1 моль/л раствора алюминия нитрата. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют 0,04 мл мочи, содержащей альдостерон. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с.

Затем добавляем 0,04 мл стандартного раствора альдостерона с концентрацией 10^-7 мг/мл. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с.

Аналитический сигнал регистрируют при значении потенциала 0,7 В. По высоте волны прибор определяет концентрацию альдостерона в моче.

Правильность установленных параметров методики также были проверены методом «введено-найдено» (табл.7; табл.7.1).

Аналогичное определение было проведено в моче с концентрацией введенного раствора альдостерона 10^-10 мг/мл (табл.8; табл.8.1).

Пример 4. Определение альдостерона методом анодной вольтамперометрии с накоплением в биологической среде (слюне, взятой натощак).

В стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,1 моль/л раствора алюминия нитрата. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют 0,04 мл слюны, содержащей альдостерон. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с.

Затем добавляем 0,04 мл стандартного раствора альдостерона с концентрацией 10^-7 мг/мл. При потенциале 0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 60 с и, не прекращая перемешивания и подачи азота, проводят электролиз при потенциале 0,4 В в течение 60 с. Фиксируют вольтамперограмму при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с.

Аналитический сигнал регистрируют при значении потенциала 0,7 В. По высоте волны прибор определяет концентрацию альдостерона в слюне.

Правильность установленных параметров методики также были проверены методом «введено-найдено» (табл.9; табл.9.1).

Аналогичное определение было проведено в слюне с концентрацией введенного раствора альдостерона 10^-10 мг/мл (табл.10; табл.10.1).

Таблица 1Влияние времени электролиза на высоту аналитического сигнала
№ п/п	Концентрация раствора стандартного образца альдостерона в электролитической ячейке, мг/мл	Время электролиза, с	Высота аналитического сигнала, мкА
1	1·10-7	20	0,28
2	40	0,42
3	60	0,62
4	80	0,46
5	100	0,38
Примечание: потенциал электролиза составляет 0,4 В; границы развертки потенциала от 0,4 В (потенциал электролиза) до 1,6 В (потенциал растворения); скорость развертки потенциала составляет 90 мВ/с.

Таблица 2Влияние потенциала электролиза на высоту аналитического сигнала
№ п/п	Концентрация раствора стандартного образца ЛГ в электролитической ячейке, мг/мл	Потенциал электролиза, В	Высота аналитического сигнала, мкА
1	1·10-7	0,100	0,38
2	0,200	0,49
3	0,300	0,58
4	0,400	0,64
5		0,500	0,54
6		0,600	0,49
7		0,700	0,53
8		0,800	0,53
Примечание: время электролиза - 60 с; границы развертки потенциала от 0,4 В до 1,6 В; скорость развертки потенциала составляет 90 мВ/с.

Таблица 3Результаты теста «введено-найдено» количественного определения альдостерона в модельном растворе
Введено С·10-7 мг/мл	Найдено Сх·10-7 мг/мл
1	2	3	4	5	6	7	8
1·10-7	1,03	1,05	09,98	1,01	1,02	1,01	09,96	1,03
· - умножение

Таблица 3.1Расчет относительной ошибки метода (ε)
ε=(ΔХ/Хср)·100%=(0,000001521/0,0000001018)·100%=1,4942%
С·10-7	1,03; 1,05; 09,98; 1,01; 1,02; 1,01; 09,96; 1,03
n	8
Xcp	0,0000001018
S	0,000001823
ΔX	0,000001521
Xcp±ΔX	0,0000001018±0,000001521
ε	1,4942%

Таблица 4Результаты теста «введено-найдено» количественного определения альдостерона в модельном растворе
Введено С·10-10 мг/мл	Найдено Сх·10-10 мг/мл
1	2	3	4	5	6	7	8
1·10-10	1,02	1,01	09,99	09,99	1,03	1,02	1,04	1,01

Таблица 4.1Расчет относительной ошибки метода (ε); ε=(ΔХ/Хср)·100%=1,18%
С·10-10	1,02; 1,01; 09,99; 09,99; 1,03; 1,02; 1,04; 1,01
n	8
Xср	1,016·10-10
S	1,4412·10-12
ΔХ	1,2018·10-12
Хcp±ΔХ	1,016·10-10±1,4412·10-12
ε	1,18%

Таблица 5Результаты теста «введено-найдено» количественного определения альдостерона в сыворотке крови
Введено С·10-7 мг/мл	Найдено Сх·10-7 мг/мл
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1·10-7	9,96	1,08	9,98	1,01	1,08	9,89	1,03	1,03	9,86	1,05

Таблица 5.1Расчет относительной ошибки метода (ε)
ε=(ΔХ/Хср)-100%=(0,000002126/0,00000010189)·100%=2,086%
С·10-7 мг/мл	09,96; 1,08; 09,98; 1,01; 1,08; 09,89; 1,03; 1,03; 09,86; 1,05
n	10
Хср	0,00000010189
S	0,000002974
ΔХ	0,000002126 (Р=0,95)
Хcp±ΔХ	0,00000010189±0,000002126
ε	2,086%

Таблица 6Результаты теста «введено-найдено» количественного определения альдостерона в сыворотке крови
Введено C·10-10 мг/мл	Найдено Сх·10-10 мг/мл
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1·10-10	9,98	9,99	1,02	1,01	1,01	1,05	1,015	9,97	1,03	1,025

Таблица 6.1Расчет относительной ошибки метода (ε); ε=(ΔХ/Хcp)·100%=1,7%
С·10-10 мг/мл	09,98; 09,99; 1,02; 1,01; 1,01; 1,05; 1,015; 09,97; 1,03; 1,025
n	10
Xср	1,0154·10-10
S	1,664·10-12
ΔX	1,19·10-12 (Р=0,95)
Хср±ΔХ	1,0154·10-10±1,19·10-12
ε	1,17%

Таблица 7Результаты теста «введено-найдено» количественного определения альдостерона в моче
Введено С·10-7 мг/мл	Найдено Сх·10-7 мг/мл
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1·10-7	1,06	1,01	09,88	09,98	1,01	1,03	09,89	1,05	1,02

Таблица 7.1Расчет относительной ошибки метода (ε)
ε=(ΔX/Хср)·100%=(0,000001962/0,0000001017)·100%=1,93%
С·10-7 мг/мл	1,06; 1,01; 09,88; 09,98; 1,01; 1,03; 09,89; 1,05; 1,02
n	9
Xср	0,0000001017
S	0,000002549
ΔХ	0,000001962
Xcp±ΔХх	0,0000001017±0,000001962
ε	1,93%

Таблица 8Результаты теста «введено-найдено» количественного определения альдостерона в моче
Введено С·10-10 мг/мл	Найдено Сх·10-10 мг/мл
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1·10-10	1,04	1,02	9,95	09,97	1,015	1,02	1,02	1,05	1,01

Таблица 8.1Расчет относительной ошибки метода (ε); ε=(ΔX/Хср)·100%=1,36%
С·10-10 мг/мл	1,04; 1,02; 09,95; 09,97; 1,015; 1,02; 1,02; 1,05; 1,01
n	9
Хср	1,01816·10-10
S	1,80138·10-12
ΔХ	1,387·10-12 (Р=0,95)
Xcp±ΔX	1,01816·10-10±1,387·10-12
ε	1,36%

Таблица 9Результаты теста «введено-найдено» количественного определения альдостерона в слюне
Введено С·10-7 мг/мл	Найдено Сх·10-7 мг/мл
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1·10-7	1,01	9,58	1,01	1,01	1,02	1,17	9,85	1,09	1,02	1,05

Таблица 9.1Расчет относительной ошибки метода (ε)
ε=(ΔX/Хср)·100%=(0,000004271/0,00000010323)·100%=4,14%
C·10-7 мг/мл	1,01; 09,58; 1,01; 1,01; 1,02; 1,17; 09,85; 1,09; 1,02; 1,05
n	10
Xcp	0,00000010323
S	0,000005977
ΔX	0,000004271 (P=0,95)
Xср±ΔX	0,00000010323±0,000004271
ε	4,1379%

Таблица 10Результаты теста «введено-найдено количественного определения альдостерона в слюне
Введено С·10-10 мг/мл	Найдено Сх·10-10 мг/мл
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1·10-10	1,02	1,01	1,07	9,75	1,01	1,01	1,15	9,95	1,01	1,03

Таблица 10.1Расчет относительной ошибки метода (ε); t=(ΔХ/Хср)·100%=3,43%
C·10-10 мг/мл	1,02; 1,01; 1,07; 09,75; 1,01; 1,01; 1,15; 09,95; 1,01; 1,03
n	10
Xср	1,028·10-10
S	4,934·10-12
ΔХ	3,5287·10-12 (Р=0,95)
Xcp±ΔX	1,028·10-10±3,5287·10-12
ε	3,43%

Способ вольтамперометрического определения альдостерона, характеризующийся тем, что проводят электрохимическое концентрирование альдостерона на поверхности стеклоуглеродного электрода в течение 60 с при потенциале электролиза 0,4 В на фоне 0,1 моль/л алюминия нитрата, затем регистрируют анодные вольтамперные кривые при квадратно-волновой скорости развертки потенциала 90 мВ/с и определяют концентрацию альдостерона по высоте волны при значении потенциала 0,7 В относительно хлорсеребряного электрода.