Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам

Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 60/311282, поданной 9 августа 2001 г.

Область техники

Настоящее изобретение относится в целом к растениям с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам. В частности настоящее изобретение относится к растениям пшеницы, полученным при помощи мутагенеза, кроссбридинга и трансформации, которые обладают повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам.

Предпосылки изобретения

Синтаза ацетогидроксикислоты (AHAS; EC 4.1.3.18) является первым ферментом, катализирующим биохимический синтез валина, лейцина и изолейцина в аминокислотах с разветвленной цепью (Singh B.K., 1999, Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine in: Singh B.K. (Ed) Plant amino acids. Marcel Dekker Inc. New York, New York. Pg 227-247). На AHAS воздействуют четыре разных в структурном отношении семейства гербицидов, включающих сульфонилмочевины (LaRossa RA and Falco SC, 1984 Trends Biotechnol 2:158-161), имидазолиноны (Shaner et al., 1984 Plant Physiol 76:545-546), триазолопиримидины (Subramanian and Gerwick, 1989 Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines in (ed) Whitaker JR, Sonnet PE Biocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C. Pg 277-288) и пиримидилоксибензоаты (Subramanian et al., 1990 Plant Physiol 94: 239-244). Гербициды на основе имидазолинона и сульфонилмочевины широко применяются в современном сельском хозяйстве благодаря их эффективности при очень низких нормах внесения и относительной нетоксичности для животных. Подавляя активность AHAS, указанные семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие восприимчивых к ним растений, включая многие виды сорняков. Несколькими примерами промышленно производимых имидазолиноновых гербицидов являются PURSUIT® (имазетапир), SCEPTER® (имазахин) и ARSENAL® (имазапир). Примеры гербицидов на основе сульфонилмочевины включают хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронэтил, тифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, никосульфурон, этаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примисульфуронметил, циносульфурон, амидосульфурон, флузасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфуронэтил и галогенсульфурон.

Благодаря высокой эффективности и низкой токсичности имидазолиноновые гербициды применяют для опрыскивания растительности на больших площадях. Возможность опрыскивания гербицидом растительности на больших площадях сокращает затраты, связанные с возделыванием и содержанием сельскохозяйственных культур, и уменьшает потребность в подготовке участка к использованию таких химикатов. Кроме того, опрыскивание желательных устойчивых видов растений позволяет максимально увеличить урожайность требуемых культур благодаря отсутствию конкурирующих видов. Однако возможность применения таких методов опрыскивания зависит от наличия устойчивых к имидазолинону видов растительности на опрыскиваемом участке.

Среди главных сельскохозяйственных культур некоторые бобовые культуры, такие как соя, обладают природной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам благодаря их способности быстро метаболизировать гербицидные соединения (Shaner and Robinson, 1985 Weed Sci. 33:469-471). Другие сельскохозяйственные культуры, такие как кукуруза (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol. 100:882-886) и рис (Barrette et al., 1989 Crop Safeners for Herbicides, Academic Press Nes York, pp. 195-220), в некоторой степени восприимчивы к воздействию имидазолиноновых гербицидов. Различная восприимчивость к имидазолиноновым гербицидам зависит от химической природы конкретного гербицида и разного превращения соединения из токсичной в нетоксичную форму, происходящего в каждом растении в процессе обмена веществ (Shaner et al., 1984 Plant Physiol. 76:545-546; Brown et al., 1987 Pestic. Biochim. Physiol. 27:24-29). Другие физиологические различия растений, такие как поглощение и передвижение веществ, также имеют важное значение для восприимчивости к определенным веществам (Shaner and Robinson, 1985 Weed Sci. 33:469-471).

Сорта сельскохозяйственных культур, устойчивые к имидазолинонам, сульфонилмочевинам и триазолопиримидинам, успешно получены при помощи мутагенеза семян, микроспор, пыльцы и каллюсов в таких видах, как Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max и Nicotiana tabacum (Sebastian et al., 1989 Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse et al., 1991 Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al., 1991 Plant Physiol. 97: 1044-1050; Mourand et al., 1993 J. Heredity 84:91-96). Во всех случаях устойчивость вызывает один частично доминантный ядерный ген. В результате мутагенеза семян Triticum aestivum L. сорта Fidel (Newhouse et al., 1992 Plant Physiol. 100:882-886) ранее были выделены четыре вида растений пшеницы, устойчивых к имидазолинону. Исследования наследственности подтвердили, что устойчивость придает один, частично доминантный ген. В результате исследования аллелей авторы пришли к выводу, что мутации в четырех идентифицированных линиях расположены в одном и том же локусе. Один из генов устойчивости в сорте Fidel получил название FS-4 (Newhouse et al., 1992 Plant Physiol. 100:882-886).

Компьютерное моделирование трехмерной структуры комплекса AHAS-ингибитор позволяет прогнозировать наличие нескольких аминокислот в предполагаемом "кармане" связывания ингибитора в качестве сайтов, где индуцированные мутации, по-видимому, вызывают избирательную устойчивость к имидазолинонам (Ott et al., 1996 J. Mol. Biol. 263:359-368). Растения пшеницы, полученные в результате некоторых из указанных рационально программируемых мутаций на предполагаемых сайтах связывания фермента AHAS, действительно обладают специфической устойчивостью к одному классу гербицидов (Ott et al., 1996 J. Mol. Biol. 263:359-368).

Устойчивость растений к имидазолиноновым гербицидам описана также в ряде патентов. В патентах США №№ 4761373, 5331107, 5304732, 6211438, 6211439 и 6222100 дано общее описание применения измененного гена AHAS для создания растений, устойчивых к гербицидам, и, в частности, рассмотрены некоторые сорта зерновых культур, устойчивые к имидазолинону. В патенте США № 5013659 описаны растения с устойчивостью к гербицидам, которые имеют мутации, по меньшей мере, одной аминокислоты в одной или более консервативных областях. Мутации, описанные в вышеуказанном патенте, кодируют перекрестную устойчивость к имидазолинонам и сульфонилмочевинам или специфическую устойчивость к сульфонилмочевине, но в данном патенте не рассмотрена специфическая устойчивость к имидазолинону. Кроме того, в патентах США №№ 5731180 и 5767361 описан выделенный ген с заменой одной аминокислоты в аминокислотной последовательности AHAS однодольных растений дикого типа, который определяет специфическую устойчивость к имидазолинону.

До настоящего времени не были известны устойчивые к имидазолинону растения пшеницы, имеющие более одного измененного гена AHAS. В научной литературе ранее также не были описаны устойчивые к имидазолинону растения пшеницы, имеющие мутации в геномах, не являющихся геномом, из которого выделен ген FS-4. Поэтому необходимо идентифицировать гены устойчивости к имидазолинону из дополнительных геномов. Кроме того, необходимо получить растения пшеницы, обладающие повышенной устойчивостью к гербицидам, таким как имидазолинон, и содержащие более одного измененного гена AHAS. Существует потребность также в способах борьбы с сорняками, произрастающими рядом с такими растениями пшеницы. Такие композиции и способы позволяют применять методы опрыскивания при внесении гербицидов на участки, засеянные пшеницей.

Краткое ОПИСАНИЕ изобретения

Настоящее изобретение относится к растениям пшеницы, содержащим нуклеиновые кислоты IMI, которые обладают повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа. Растения пшеницы могут содержать одну, две, три или большее число нуклеиновых кислот IMI. В одном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает множество нуклеиновых кислот IMI, расположенных в разных геномах. Нуклеиновые кислоты IMI предпочтительно кодируют белки, включающие мутацию в консервативной аминокислотной последовательности, выбираемой из группы, состоящей из домена А, домена В, домена С, домена D и домена Е. Более предпочтительно мутация находится в консервативном домене Е или консервативном домене С. Кроме того, настоящее изобретение относится к частям растения и семенам растения, полученным из описанных растений пшеницы. В другом варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает нуклеиновую кислоту IMI, которая не является нуклеиновой кислотой Imi1. Например, нуклеиновая кислота IMI может быть нуклеиновой кислотой Imi2 или Imi3.

Нуклеиновые кислоты IMI по настоящему изобретению могут включать нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из полинуклеотида SEQ ID NO: 1; полинуклеотида SEQ ID NO: 3; полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 2; полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 4; полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, 60 последовательно расположенных нуклеотидов любого из вышеуказанных полинуклеотидов; и полинуклеотида, комплементарного любым вышеуказанным полинуклеотидам.

Растения по настоящему изобретению могут быть трансгенными или нетрансгенными. Примеры нетрансгенных растений пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам включают растение пшеницы, представленное под идентификационным номером патентного депозитария АТСС РТА-3953 или РТА-3955; или мутантное, рекомбинантное или генетически сконструированное производное растения, представленного под идентификационным номером патентного депозитария АТСС РТА-3953 или РТА-3955; или любое потомство растения, представленного под идентификационным номером патентного депозитария АТСС РТА-3953 или РТА-3955; или растение, являющееся потомством любого из указанных растений.

Помимо композиций в объем настоящего изобретения входят несколько способов. В данной заявке на патент описаны способы модификации устойчивости растения к имидазолиноновому гербициду, включающие модификацию экспрессии нуклеиновой кислоты IMI в растении. Кроме того, в данной заявке описаны способы получения трансгенного растения с повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду, включающие трансформацию растительной клетки экспрессирующим вектором, содержащим одну или более нуклеиновых кислот IMI, и выращивание растения из растительной клетки. Данное изобретение далее относится к способу борьбы с сорняками, произрастающими рядом с растениями пшеницы, который включает нанесение имидазолинонового гербицида на сорняки и растение пшеницы, при этом растение пшеницы обладает повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа пшеницы, при этом растение содержит одну или более нуклеиновых кислот IMI. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления указанных способов растения содержат множество нуклеиновых кислот IMI, находящихся в разных геномах пшеницы.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена таблица, в которой приведены результаты оценки устойчивости к имазамоксу для одного вида растений в исходной популяции и популяции F₁, полученной в результате реципрокного скрещивания устойчивых линий с CDC Teal. Указанные величины означают число растений, подвергнутых оценке в каждом фенотипическом классе. Родительские линии выделены жирным шрифтом. Число исследованных родительских линий включает линии, исследованные в популяциях F₂.

На фиг.2 представлена таблица, в которой показана реакция на имазамокс в популяциях F₂ и BCF₁, полученных в результате скрещивания устойчивых линий с CDC Teal, и результаты проверок на соответствие по критерию хи-квадрат однолокусной и двухлокусной моделей (15А × Teal) для оценки устойчивости. Символы, использованные на фиг.2, имеют следующие значения: а - значение Р критерия хи-квадрат (1 степень свободы) означает вероятность того, что отклонения от соотношения испытанных растений являются случайными. Значения Р критерия хи-квадрат выше 0,05 указывают на то, что полученные значения не отличаются на значимом уровне от ожидаемых результатов; b - значение Р критерия хи-квадрат означает вероятность того, что отклонения в популяциях F₂, полученных в результате реципрокного скрещивания CDC Teal с устойчивыми линиями, являются случайными. Значения критерия хи-квадрат выше 0,05 указывают на то, что реципрокные популяции F₂ являются гомогенными, и данные для двух реципрокных популяций объединены; с - CDC Teal использован в качестве родительской формы, с которой гибрид скрещивается вновь; d - соотношения испытанных растений основаны на результатах поколения F₂; и е - значение Р критерия хи-квадрат (1 степень свободы) для соотношения BCF₁.

На фиг.3 представлена таблица, в которой приведены результаты оценки устойчивости к имазамоксу в семействах F_2:3, полученных в результате скрещивания устойчивых линий с CDC Teal, и результаты проверок на соответствие по критерию хи-квадрат однолокусной и двухлокусной моделей (15А × Teal) для оценки устойчивости. Символы, использованные на фиг.3, имеют следующие значения: а - исследованные соотношения расщепления семейства основаны на результатах популяций F₂ и BCF₁; b - значение Р критерия хи-квадрат (2 степени свободы) представляет вероятность того, что отклонения от соотношения испытанных растений являются случайными. Значения Р критерия хи-квадрат выше 0,05 указывают на то, что полученные значения не отличаются на значимом уровне от ожидаемых результатов.

На фиг.4 представлена таблица, в которой приведены результаты оценки устойчивости к имазамоксу для одного растения в поколениях F₂, полученных в результате интеркросса устойчивых линий. Соотношения испытанных растений, вычисленные по критерию хи-квадрат, основаны на результатах для семейств F₂ и F_2:3, полученных путем скрещивания устойчивых линий с CDC Teal. Соотношение испытанных растений, равное 15:1, относится к двухлокусной модели, и соотношение испытанных растений, равное 63:1, относится к трехлокусной модели. Символ "a", использованный на фиг.4, имеет следующее значение: значение Р критерия хи-квадрат (1 степень свободы) представляет вероятность того, что отклонения от соотношения испытанных растений являются случайными. Значения Р критерия хи-квадрат выше 0,05 указывают на то, что полученные значения не отличаются на значимом уровне от ожидаемых результатов.

На фиг.5 представлена таблица, в которой приведены результаты оценки устойчивости к имазамоксу в семействах F_2:3, полученных в результате расщепления интеркроссов устойчивых линий. Символы, использованные на фиг.5, имеют следующие значения: а - соотношения испытанных растений в процессе расщепления семейства основаны на результатах исследованных популяций F₂; b - значение Р критерия хи-квадрат (2 степени свободы) представляет вероятность того, что отклонения от соотношения испытанных растений являются случайными. Значения Р критерия хи-квадрат выше 0,05 указывают на то, что полученные значения не отличаются на значимом уровне от ожидаемых результатов.

На фиг.6 представлена таблица, в которой сравнивают процентные значения неингибированной активности AHAS in vitro в четырех линиях пшеницы в присутствии возрастающих концентраций имазамокса, являющегося имидазолиноновым гербицидом. Teal представляет линию дикого типа, не имеющую устойчивости к имидазолиноновым гербицидам, в то время как линия BW755 содержит мутантный ген FS4.

На фиг.7 представлена таблица, в которой сравнивают результаты повреждения, выявленные у трех генотипов пшеницы после обработки 10-кратной или 30-кратной нормой имазамокса. Однократная норма составляет 20 г/га. BW755 содержит мутантный ген FS4. 15А/11А представляет основную массу самоопыленного потомства, полученного в результате скрещивания Teal11A и Teal15A. Данная популяция не является еще гомозиготной во всех трех неаллельных локусах.

На фиг.8 показано сопоставление последовательностей ДНК частичных генов пшеницы Als1 и Imi1, амплифицированных из геномной ДНК: CDC Teal (ряд 2; SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16), BW755 (ряд 3; SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18), TealIMI 10A (ряд 4; SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20), TealIMI 11A (ряд 5; SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22) и TealIMI 15A (ряд 6; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24). Частичные последовательности сопоставляют с полной последовательностью гена ALS риса (ряд 1; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14), полученной из банка генов GenBank (№ доступа АВО49822) и транслированной в белковые последовательности (представленные над последовательностями ДНК). Пять высококонсервативных аминокислотных доменов, которые, как известно, включают мутации, придающие устойчивость к ингибиторам AHAS, указаны жирным шрифтом. Следует отметить, что замена гуанина аденином в BW755, TealIMI 10A и TealIMI 15A вызывает замену серина аспарагином (серин627 в рисе) в домене IPSGG (домен Е) гена Als1. Поэтому гены устойчивости, присутствующие в растениях BW755, TealIMI 10A и TealIMI 15A, представлены в виде части класса Imi1. Указанные гены устойчивости Teal определяются как TealIMI1 10А и TealIMI1 15A.

На фиг.9 показано сопоставление последовательностей ДНК частичных генов пшеницы Als2 и Imi2, амплифицированных из геномной ДНК: CDC Teal (ряд 2; SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26), BW755 (ряд 3; SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28), TealIMI 10A (ряд 4; SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30), TealIMI 11A (ряд 5; SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32) и TealIMI 15A (ряд 6; SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34). Частичные последовательности AHAS сопоставляют с полной последовательностью AHAS риса (ряд 1; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14), полученной из банка генов GenBank (№ доступа АВ049822) и транслированной в белковые последовательности (представленные над последовательностями ДНК). Пять высококонсервативных доменов, которые, как известно, включают мутации, придающие устойчивость к ингибиторам AHAS, указаны жирным шрифтом. Следует отметить, что замена гуанина аденином в TealIMI 11A вызывает замену серина аспарагином (серин627 в рисе) в домене IPSGG гена Als2. Поэтому ген устойчивости, присутствующий в растении TealIMI 11A, представлен в виде части класса нуклеиновых кислот Imi2. Указанный ген устойчивости Teal определяется как TealIMI2 11A.

На фиг.10 показана частичная последовательность ДНК TealIMI1 15A (SEQ ID NO: 1) и выведенная аминокислотная последовательность указанной последовательности (SEQ ID NO: 2).

На фиг.11 показана частичная последовательность ДНК TealIMI2 11А (SEQ ID NO: 3) и выведенная аминокислотная последовательность указанной последовательности (SEQ ID NO: 4).

На фиг.12 показана последовательность нуклеиновых кислот дикого типа Teal ALS1 ORF (SEQ ID NO: 5), Teal ALS2 ORF (SEQ ID NO: 6), Teal ALS3 ORF (SEQ ID NO: 7).

На фиг.13 показано схематическое изображение консервативных аминокислотных последовательностей в генах AHAS, определяющих устойчивость к разным ингибиторам AHAS. Специфический аминокислотный сайт, ответственный за устойчивость, подчеркнут. (Modified from Devine, M.D. and Eberlein, C.V., 1997 Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites in Herbicide Activity: Toxicity, Biochemistry, and Molecular Biology, IOS Press Amsterdam, p. 159-185).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к растениям пшеницы, частям и клеткам растений пшеницы, обладающим повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам. В объем настоящего изобретения входят также семена, продуцируемые растениями пшеницы, и способы борьбы с сорняками, произрастающими рядом с описанными растениями пшеницы. Следует понимать, что в данном описании изобретения и формуле изобретения используемый в единственном числе термин в зависимости от контекста, так, например, ссылка на клетку, означает, что может использоваться, по меньшей мере, одна клетка.

В используемом здесь значении термин "растение пшеницы" означает растение, относящееся к роду Triticum. Растения пшеницы по настоящему изобретению могут быть членами рода Triticum, включающего, не ограничиваясь ими, T. aestivum, T. turgidum, T. timopheevii, T. monococcum, T. zhukovskyi, T. urartu и их гибриды. Примерами подвидов T. aestivum, входящих в объем настоящего изобретения, являются aestivum (пшеница обыкновенная), compactum (пшеница плотная), macha (пшеница мача), vavilovi (пшеница вавилонская) spelta и sphaecrococcum (пшеница карликовая). Примерами подвидов T. turgidum, входящих в объем настоящего изобретения, являются turgidum, carthlicum, dicoccon, durum, paleocolchicum, polonicum, turanicum и dicoccoides. Примерами подвидов T. monococcum, входящих в объем настоящего изобретения, являются monococcum (пшеница однозернянка) и aegilopoides. В одном варианте осуществления настоящего изобретения растение пшеницы относится к виду Triticum aestivum и, в частности, представляет культурный сорт CDC Teal.

Термин "растение пшеницы" охватывает растения пшеницы на любой стадии зрелости или развития, а также любые ткани или органы (части растения), полученные из любого такого растения, за исключением особо оговоренных случаев. Части растения включают, не ограничиваясь ими, стебли, корни, цветки, семяпочки, тычинки, листья, завязи, меристематические области, каллюсную ткань, пыльники, гаметофиты, спорофиты, пыльцу, микроспоры, протопласты и тому подобные. В объем настоящего изобретения входят также семена, полученные из растений пшеницы по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления изобретения семена используют для истинной селекции для получения повышенной устойчивости к имидазолиноновому гербициду по сравнению с семенами сорта дикого типа пшеницы.

В настоящем изобретении описано растение пшеницы, содержащее одну или более нуклеиновых кислот IMI, которое обладает повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа. В используемом здесь значении термин "нуклеиновая кислота IMI" означает нуклеиновую кислоту, мутированную из нуклеиновой кислоты AHAS в растении пшеницы дикого типа, которая придает повышенную устойчивость к имидазолинону растению, в котором она транскрибирована. Нуклеиновые кислоты AHAS пшеницы Teal дикого типа показаны в SEQ ID NO: 5 (Teal ALS1 ORF), SEQ ID NO: 6 (Teal ALS2 ORF) и SEQ ID NO: 7 (Teal ALS3 ORF). В одном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает множество нуклеиновых кислот IMI. При использовании для описания нуклеиновых кислот IMI термин "множество" относится к нуклеиновым кислотам IMI, имеющим разные нуклеотидные последовательности, а не к простому увеличению числа одной нуклеиновой кислоты IMI. Например, нуклеиновые кислоты IMI могут отличаться вследствие того, что они получены из разных геномов или находятся в разных геномах пшеницы.

Растения пшеницы по настоящему изобретению могут иметь множество нуклеиновых кислот IMI из разных геномов, так как указанные растения могут содержать более одного генома. Например, растение пшеницы Triticum aestivum имеет три генома, которые иногда определяют как геномы А, В и D. Так как AHAS является необходимым метаболическим ферментом, можно предположить, что каждый геном имеет, по меньшей мере, один ген, кодирующий фермент AHAS, обычно обнаруживаемый вместе с другими метаболическими ферментами в картированной гексаплоидной пшенице. Нуклеиновая кислота AHAS в каждом геноме может и обычно отличается своей нуклеотидной последовательностью от нуклеиновой кислоты AHAS в другом геноме. Специалист в данной области может определить геном происхождения каждой нуклеиновой кислоты AHAS методами генетического скрещивания и/или секвенирования или расщепления экзонуклеазой, известными в данной области и описанными в нижеследующем примере 2. В соответствии с целями данного изобретения нуклеиновые кислоты IMI, полученные из геномов А, В или D, получили названия нуклеиновых кислот Imi1, Imi2 или Imi3.

В данном описании изобретения не утверждается, что какой-либо определенный класс нуклеиновых кислот Imi связан с каким-либо определенным геномом А, В или D. Например, здесь не утверждается, что нуклеиновые кислоты Imi1 связаны с нуклеиновыми кислотами генома А, что нуклеиновые кислоты Imi2 связаны с нуклеиновыми кислотами генома В и т.д. Названия Imi1, Imi2 и Imi3 просто показывают, что нуклеиновые кислоты IMI в каждом таком классе не расщепляются независимо, в то время как две нуклеиновые кислоты IMI из разных классов расщепляются независимо и поэтому могут быть получены из разных геномов пшеницы. Класс нуклеиновых кислот Imi1 включает ген FS-4, описанный Newhouse et al. (1992 Plant Physiol. 100:882-886), и ген TealIMI1 15A, который более подробно рассмотрен ниже. Класс нуклеиновых кислот Imi2 включает рассматриваемый ниже ген TealIMI2 11A. Каждый класс Imi может включать члены из разных видов пшеницы. Поэтому каждый класс Imi включает нуклеиновые кислоты IMI, которые отличаются своей нуклеотидной последовательностью, но, тем не менее, происходят или находятся в одном и том же геноме пшеницы, о чем свидетельствуют результаты исследований наследственности, приведенные в нижеследующих примерах и известные специалистам в данной области.

Таким образом, в объем настоящего изобретения входит растение пшеницы, включающее одну или более нуклеиновых кислот IMI, которое обладает повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа и в котором одна или более нуклеиновых кислот IMI выбраны из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты Imi1, Imi2 и Imi3. В одном варианте осуществления изобретения растение включает нуклеиновые кислоты Imi1 и Imi3. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота Imi1 включает полинуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления изобретения указанное растение включает нуклеиновую кислоту Imi2. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота Imi2 включает полинуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.

При использовании применительно к нуклеиновым кислотам термин "полученная из" относится к нуклеиновой кислоте, "расположенной в" определенном геноме или "полученной из" определенного генома. Термин "расположенный в" относится к нуклеиновой кислоте, находящейся в пределах данного определенного генома. При использовании применительно к геному термин "полученный из" относится к нуклеиновой кислоте, которая извлечена или выделена из генома. Термин "выделенный" более подробно рассматривается ниже.

В другом варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает нуклеиновую кислоту IMI, которая не является нуклеиновой кислотой Imi1. Термин "не является Imi1" означает нуклеиновую кислоту IMI, которая не относится к вышеописанному классу нуклеиновых кислот Imi1. Примеры нуклеиновых кислот класса Imi1 приведены в рядах 3, 4 и 5 на фиг.8. Один пример нуклеиновой кислоты, не являющейся Imi1, показан в ряду 5 на фиг.8. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает нуклеиновую кислоту IMI, включающую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид SEQ ID NO: 4. Полинуклеотидная последовательность может включать последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.

Настоящее изобретение включает растения пшеницы, содержащие одну, две, три или большее число нуклеиновых кислот IMI, которые обладают повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа. Нуклеиновые кислоты IMI могут включать нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из полинуклеотида SEQ ID NO: 1, полинуклеотида SEQ ID NO: 3, полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 2, полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид SEQ ID NO: 4, полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, 60 последовательно расположенных нуклеотидов из любых вышеуказанных полинуклеотидов, и полинуклеотида, комплементарного любым из вышеуказанных полинуклеотидов.

Имидазолиноновые гербициды включают, не ограничиваясь ими, PURSUIT® (имазетапир), CADRE® (имазапик), RAPTOR® (имазамокс), SCEPTER® (имазахин), ASSERT® (имазетабенз), ARSENAL® (имазапир), производное любого вышеуказанного гербицида или смесь двух или большего числа вышеуказанных гербицидов, например имазапир/имазамокс (ODYSSEY®). Более конкретно имидазолиноновые гербициды включают, не ограничиваясь ими, 2-(4-изопропил)-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновую кислоту, 2-(4-изопропил)-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновую кислоту, 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновую кислоту, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновую кислоту, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновую кислоту и смесь метил 6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата. 5-Этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновая кислота и 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновая кислота являются предпочтительными для использования. 2-(4-Изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновая кислота является особенно предпочтительной для использования.

В одном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает две нуклеиновые кислоты IMI, полученные из или находящиеся в разных геномах пшеницы. Одна из двух нуклеиновых кислот предпочтительно является нуклеиновой кислотой Imi1 и более предпочтительно включает полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает одну нуклеиновую кислоту IMI, которая включает одну полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает три или более нуклеиновых кислот IMI, которые получены из разных геномов. По меньшей мере, одна из трех нуклеиновых кислот IMI предпочтительно включает полинуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения одна или более нуклеиновых кислот IMI, содержащихся в растении, кодируют аминокислотную последовательность, включающую мутацию в домене, который является консервативным для нескольких белков AHAS. Указанные консервативные домены определяются как домен А, домен В, домен С, домен D и домен Е. На фиг.13 показано общее расположение каждого домена в белке AHAS. В используемом здесь значении домен А содержит аминокислотную последовательность AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO: 8); домен В содержит аминокислотную последовательность QWED (SEQ ID NO: 9); домен С содержит аминокислотную последовательность VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO: 10); домен D содержит аминокислотную последовательность AFQETP (SEQ ID NO: 11); домен Е содержит аминокислотную последовательность IPSGG (SEQ ID NO: 12). Настоящее изобретение также предполагает, что консервативные домены могут иметь незначительные вариации, например в растениях куколя посевного остаток серина в домене Е заменен остатком аланина.

Таким образом, настоящее изобретение включает растения пшеницы, включающие нуклеиновую кислоту IMI, кодирующую аминокислотную последовательность с мутацией в консервативном домене, выбираемом из группы, состоящей из домена А, домена В, домена С, домена D и домена Е. В одном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает нуклеиновую кислоту IMI, кодирующую аминокислотную последовательность с мутацией в домене Е. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения мутации в консервативных доменах локализованы на подчеркнутых участках: AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO: 8); QWED (SEQ ID NO: 9); VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO: 10); AFQETP (SEQ ID NO: 11) и IPSGG (SEQ ID NO: 12). Одной предпочтительной заменой является замена серина аспарагином в домене Е (SEQ ID NO: 12).

Рассматриваемые растения пшеницы могут быть трансгенными или нетрансгенными растениями пшеницы. В используемом здесь значении термин "трансгенный" относится к любому растению, растительной клетке, каллюсу, растительной ткани или части растения, которые содержат, по меньшей мере, один полный или частичный рекомбинантный полинуклеотид. Во многих случаях осуществляют стабильную интеграцию полного или частичного рекомбинантного полинуклеотида в хромосому или в стабильный внехромосомный элемент, так чтобы он передавался последующим поколениям. В соответствии с целями данного изобретения термин "рекомбинантный полинуклеотид" означает полинуклеотид, который изменен, перестроен или модифицирован методами генной инженерии. Примеры указанного полинуклеотида включают любой клонированный полинуклеотид или полинуклеотиды, связанные или присоединенные к гетерологичным последовательностям. Термин "рекомбинантный" не относится к изменениям полинуклеотидов, возникающим в результате природных явлений, таких как спонтанные мутации, или неспонтанного мутагенеза последующим селекционным размножением. Растения, имеющие мутации, возникающие вследствие неспонтанного мутагенеза и селекционного размножения, определяются в данном описании изобретения как нетрансгенные растения и входят в объем настоящего изобретения. В вариантах осуществления изобретения, где растение пшеницы является трансгенным и включает множество нуклеиновых кислот IMI, нуклеиновые кислоты могут быть получены из разных геномов или из одного генома. Альтернативно в вариантах осуществления изобретения, где растение пшеницы является нетрансгенным и включает множество нуклеиновых кислот IMI, нуклеиновые кислоты находятся в разных геномах.

Примером нетрансгенного растения пшеницы, включающего одну нуклеиновую кислоту IMI, является сорт, депонированный в АТСС под идентификационным номером патентного депозитария РТА-3953 и определяемый здесь как сорт пшеницы TealIMI 11A. Сорт пшеницы TealIMI 11A содержит нуклеиновую кислоту Imi2. Частичная нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности, соответствующие гену TealIMI2 11A, представлены соответственно в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. Единственную часть последовательностей, не входящих в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, представляют последовательности, кодирующие и соответствующие сигнальной последовательности, отщепляемой от зрелого белка TealIMI2 11A.

Соответственно в SEQ ID NO: 4 представлена полноразмерная выведенная последовательность зрелого белка TealIMI2 11A.

Примером сорта растения пшеницы, включающего две нуклеиновые кислоты IMI в разных геномах, является сорт, депонированный в АТСС под идентификационным номером патентного депозитария РТА-3955 и определяемый здесь как сорт пшеницы TealIMI 15A. Сорт пшеницы TealIMI 15A содержит нуклеиновые кислоты Imi1 и Imi3. Нуклеиновая кислота Imi1 включает мутацию, которая вызывает замену серина аспарагином в белке IMI, кодируемом указанной нуклеиновой кислотой. Мутированные гены AHAS обозначены здесь как TealIMI1 15A и TealIMI3 15A. Частичные нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности, соответствующие гену TealIMI1 15A, представлены соответственно в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Единственную часть последовательностей, не входящих в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, представляют последовательности, кодирующие и соответствующие примерно 100-150 парам оснований у 5'-конца и примерно 5 парам оснований у 3'-конца кодирующей области.

В Американскую коллекцию типовых культур, Manassas, Virginia, 3 января 2002 г. было отдельно депонировано 2500 семян сортов пшеницы TealIMI 11A и TealIMI 15A. Указанные депозиты созданы в соответствии с нормами и правилами Будапештского договора о депонировании микроорганизмов. Депонирование было осуществлено на срок не менее тридцати лет и, по меньшей мере, на пять лет после последнего запроса к АТСС о предоставлении образца из хранилища. Депонированные семена представлены под идентификационными номерами патентных депозитариев РТА-3953 (TealIMI 11A) и РТА-3955 (TealIMI 15A).

В объем настоящего изобретения входит растение пшеницы, представленное под идентификационным номером патентного депозитария РТА-3953 или РТА-3955; мутантное, рекомбинантное или генетически сконструированное производное растения, представленного под идентификационным номером патентного депозитария РТА-3953 или РТА-3955; любое потомство растения, представленного под идентификационным номером патентного депозитария РТА-3953 или РТА-3955; и растение, являющееся потомством любого из указанных растений. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение пшеницы по настоящему изобретению дополнительно имеет характеристики устойчивости к гербицидам, присущие растению, представленному под идентификационным номером патентного депозитария РТА-3953 или РТА-3955.

В объем настоящего изобретения входят также гибриды вышеописанных сортов пшеницы TealIMI 11A и TealIMI 15A. В примере 5 рассмотрены гибриды TealIMI 11A/TealIMI 15A, обладающие повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду. Настоящее изобретение далее относится к гибридам сортов пшеницы TealIMI 11A или TealIMI 15A и других сортов пшеницы. Другие сорта пшеницы включают, не ограничиваясь ими, T. aestivum L. сорта Fidel и любой сорт пшеницы, содержащий мутантный ген FS-1, FS-2, FS-3 или FS-4 (См. патент США № 6339184 и заявку на патент США № 08/474832). В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение пшеницы предста