Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам

Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США с регистрационным номером 60/311180, поданной 9 августа 2001 года.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в целом к растениям с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам. Более конкретно, данное изобретение относится к растениям пшеницы, полученным мутагенезом, кроссбридингом и трансформацией, которые обладают повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Синтаза ацетогидроксикислоты (AHAS; EC 4.1.3.18) является первым ферментом, катализирующим биохимический синтез валина, лейцина и изолейцина в аминокислотах с разветвленной цепью (Singh B.K., 1999, Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine in: Singh B.K. (Ed) Plant amino acids. Marcel Dekker Inc. New York, New York, p. 227-247). На AHAS воздействуют четыре разных в структурном отношении семейства гербицидов, включающих сульфонилмочевины (LaRossa RA and Falco SC, 1984, Trends Biotechnol. 2:158-161), имидазолиноны (Shaner et al., 1984, Plant Physiol., 76:545-546), триазолопиримидины (Subramanian and Gerwick, 1989, Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines in (ed) Whitaker JR, Sonnet PE, Biocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., p. 277-288) и пиримидилоксибензоаты (Subramanian et al., 1990, Plant Physiol. 94: 239-244). Гербициды на основе имидазолинона и сульфонилмочевины широко применяются в современном сельском хозяйстве благодаря их эффективности при очень низких уровнях внесения и относительной нетоксичности для животных. Подавляя активность AHAS, указанные семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие восприимчивых к ним растений, включая многие виды сорняков. Несколькими примерами промышленно производимых имидазолиноновых гербицидов являются PURSUIT® (имазетапир), SCEPTER® (имазахин) и ARSENAL® (имазапир). Примеры гербицидов на основе сульфонилмочевины включают хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронэтил, тифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, никосульфурон, этаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примисульфуронметил, циносульфурон, амидосульфурон, флузасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфуронэтил и галогенсульфурон.

Благодаря высокой эффективности и низкой токсичности имидазолиноновые гербициды применяют для опрыскивания растительности на больших площадях. Возможность опрыскивания гербицидом растительности на больших площадях сокращает затраты, связанные с возделыванием и содержанием сельскохозяйственных культур, и уменьшает потребность в подготовке участка к использованию таких химикатов. Кроме того, опрыскивание желательных устойчивых видов растений позволяет максимально увеличить урожайность требуемых культур благодаря отсутствию конкурирующих видов. Однако возможность применения таких методов опрыскивания зависит от наличия устойчивых к имидазолинону видов растительности на опрыскиваемом участке.

Среди главных сельскохозяйственных культур некоторые бобовые культуры, такие как соя, обладают природной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам благодаря их способности быстро метаболизировать гербицидные соединения (Shaner and Robinson, 1985, Weed Sci., 33:469-471). Другие сельскохозяйственные культуры, такие как кукуруза (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol., 100:882-886) и рис (Barrette et al., 1989, Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, Nes York, p. 195-220) в некоторой степени восприимчивы к воздействию имидазолиноновых гербицидов. Различная восприимчивость к имидазолиноновым гербицидам зависит от химической природы конкретного гербицида и разного превращения соединения из токсичной в нетоксичную форму, происходящего в каждом растении в процессе обмена веществ (Shaner et al., 1984, Plant Physiol., 76:545-546; Brown et al., 1987, Pestic. Biochim. Physiol., 27:24-29). Другие физиологические различия растений, такие как поглощение и передвижение веществ, также имеют важное значение для восприимчивости к определенным веществам (Shaner and Robinson, 1985 Weed Sci. 33:469-471).

Сорта сельскохозяйственных культур, устойчивые к имидазолинонам, сульфонилмочевинам и триазолопиримидинам, успешно получены при помощи мутагенеза семян, микроспор, пыльцы и каллюсов в таких видах, как Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max и Nicotiana tabacum (Sebastian et al., 1989, Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson et al., 1989, Theor. Appl. Genet., 78:525-530; Newhouse et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al., 1991, Plant Physiol., 97: 1044-1050; Mourand et al., 1993, J. Heredity, 84:91-96). Во всех случаях устойчивость вызывает один частично доминантный ядерный ген. В результате мутагенеза семян Triticum aestivum L. сорта Fidel (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol., 100:882-886) ранее были выделены четыре вида растений пшеницы, устойчивых к имидазолинону. Исследования наследственности подтвердили, что устойчивость придает один, частично доминантный ген. В результате исследования аллелей авторы пришли к выводу, что мутации в четырех идентифицированных линиях расположены в одном и том же локусе. Один из генов устойчивости в сорте Fidel получил название FS-4 (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol., 100:882-886).

Компьютерное моделирование трехмерной структуры комплекса AHAS-ингибитор позволяет прогнозировать наличие нескольких аминокислот в предлагаемом "кармане" связывания ингибитора в качестве сайтов, где индуцированные мутации, по-видимому, вызывают избирательную устойчивость к имидазолинонам (Ott et al., 1996, J. Mol. Biol., 263:359-368). Растения пшеницы, полученные в результате некоторых из указанных рационально программируемых мутаций на предлагаемых сайтах связывания фермента AHAS, действительно обладают специфической устойчивостью к одному классу гербицидов (Ott et al., 1996, J. Mol. Biol., 263:359-368).Устойчивость растений к имидазолиноновым гербицидам описана также в ряде патентов. В патентах США № 4761373, 5331107, 5304732, 6211438, 6211439 и 6222100 дано общее описание применения измененного гена AHAS для создания растений, устойчивых к гербицидам, и, в частности, рассмотрены некоторые сорта зерновых культур, устойчивые к имидазолинону. В патенте США № 5013659 описаны растения с устойчивостью к гербицидам, которые имеют мутации, по меньшей мере, одной аминокислоты в одной или более консервативных областях. Мутации, описанные в вышеуказанном патенте, кодируют перекрестную устойчивость к имидазолинонам и сульфонилмочевинам или специфическую устойчивость к сульфонилмочевине, но в данном патенте не рассмотрена специфическая устойчивость к имидазолинону. Кроме того, в патентах США № 5731180 и 5767361 описан выделенный ген с заменой одной аминокислоты в аминокислотной последовательности AHAS однодольных растений дикого типа, который определяет специфическую устойчивость к имидазолинону.

До настоящего времени не были известны устойчивые к имидазолинону растения пшеницы, имеющие более одного измененного гена AHAS. В научной литературе ранее также не были описаны устойчивые к имидазолинону растения пшеницы, имеющие мутации в геномах, не являющихся геномом, из которого выделен ген FS-4. Поэтому необходимо идентифицировать гены устойчивости к имидазолинону из дополнительных геномов. Кроме того, необходимо получить растения пшеницы, обладающие повышенной устойчивостью к гербицидам, таким как имидазолинон, и содержащие более одного измененного гена AHAS. Существует потребность также в способах борьбы с сорняками, произрастающими рядом с такими растениями пшеницы. Такие композиции и способы позволяют применять методы опрыскивания при внесении гербицидов на участки, засеянные пшеницей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к растениям пшеницы, содержащим нуклеиновые кислоты IMI, которые обладают повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа. Растения пшеницы могут содержать одну, две, три или большее число нуклеиновых кислот IMI. В одном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает множество нуклеиновых кислот IMI, расположенных в разных геномах. Нуклеиновые кислоты IMI предпочтительно кодируют белки, включающие мутацию в консервативной аминокислотной последовательности, выбираемой из группы, состоящей из домена А, домена В, домена С, домена D и домена Е. Более предпочтительно мутация находится в консервативном домене Е или консервативном домене С. Кроме того, настоящее изобретение относится к частям растения и семенам растения, полученным из описанных растений пшеницы. В другом варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает нуклеиновую кислоту IMI, которая не является нуклеиновой кислотой Imi1. Например, нуклеиновая кислота IMI может быть нуклеиновой кислотой Imi2 или Imi3.

Нуклеиновые кислоты IMI по настоящему изобретению могут включать нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из полинуклеотида SEQ ID NO: 1; полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, 60 последовательно расположенных нуклеотидов SEQ ID NO: 1; и полинуклеотида, комплементарного SEQ ID NO: 1.

Растения по настоящему изобретению могут быть трансгенными или нетрансгенными. Примеры нетрансгенных растений пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам включают растение пшеницы, представленное под идентификационным номером патентного депозитария АТСС РТА-4113; или мутантное, рекомбинантное или генетически сконструированное производное растения, представленного под идентификационным номером патентного депозитария АТСС РТА-4113; или любое потомство растения, представленного под идентификационным номером патентного депозитария АТСС РТА-4113; или растение, являющееся потомством любого из указанных растений.

Помимо композиций в объем настоящего изобретения входят несколько способов. В данной заявке на патент описаны способы модификации устойчивости растения к имидазолиноновому гербициду, включающие модификацию экспрессии нуклеиновой кислоты IMI в растении. Кроме того, в данной заявке описаны способы получения трансгенного растения с повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду, включающие трансформацию растительной клетки экспрессирующим вектором, содержащим одну или более нуклеиновых кислот IMI, и выращивание растения из растительной клетки. Данное изобретение далее относится к способу борьбы с сорняками, произрастающими рядом с растениями пшеницы, который включает нанесение имидазолинонового гербицида на сорняки и растение пшеницы, при этом растение пшеницы обладает повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа пшеницы, при этом растение содержит одну или более нуклеиновых кислот IMI. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления указанных способов растения содержат множество нуклеиновых кислот IMI, находящихся в разных геномах пшеницы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показана частичная кДНК-последовательность Einkorn IMI3 (SEQ ID NO:1).

На фиг.2 показана частичная кДНК-последовательность Einkorn IMI3 в сравнении с последовательностью Einkorn дикого типа (SEQ ID NO:2) и консенсусной последовательностью (SEQ ID NO:3).

Фиг.3 является схематическим представлением консервативных аминокислотных последовательностей в генах AHAS, предположительно участвующих в устойчивости к различным ингибиторам AHAS. Специфический аминокислотный сайт, ответственный за устойчивость, показан подчеркиванием. (Модифицировано из Devine, M.D. and Eberlein, C.V., 1997, Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites in Herbicide Activity: Toxicity, Biochemistry, and Molecular Biology, IOS Press Amsterdam, p. 159-185).

Фиг.4 является таблицей, показывающей родительские линии пшеницы, используемые для определения аллельных взаимоотношений среди генов IMI.

Фиг.5 является таблицей, показывающей данные по расщеплению F2, демонстрирующие локализацию мутации ЕМ2 на геноме А.

Фиг.6 является таблицей, показывающей различные агрономические характеристики, на которые могло бы влиять повреждение гербицидом, как в контрольных растениях Einkorn, так и в растениях ЕМ2.

Фиг.7 является таблицей, показывающей оценку контрольных растений Einkorn и растений ЕМ2 на общее повреждение посева при трех уровнях имазамокса.

Фиг.8 является таблицей, показывающей повышенную устойчивость к имидазолиноновым гербицидам в сортах пшеницы после стекинга нуклеиновых кислот IMI.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к растениям пшеницы, частям и клеткам растений пшеницы, обладающим повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам. В объем настоящего изобретения входят также семена, продуцируемые растениями пшеницы, и способы борьбы с сорняками, произрастающими рядом с описанными растениями пшеницы. Следует понимать, что в данном описании изобретения и формуле изобретения используемый в единственном числе термин в зависимости от контекста, так, например, ссылка на клетку, означает, что может использоваться, по меньшей мере, одна клетка.

В используемом здесь значении термин "растение пшеницы" означает растение, относящееся к роду Triticum. Растения пшеницы по настоящему изобретению могут быть членами рода Triticum, включающего, не ограничиваясь ими, T. aestivum, T. turgidum, T. timopheevii, T. monococcum, T. zhukovskyi, T. urartu и их гибриды. Примерами подвидов T. aestivum, входящих в объем настоящего изобретения, являются aestivum (пшеница обыкновенная), compactum (пшеница плотная), macha (пшеница мача), vavilovi (пшеница вавилонская) spelta и sphaecrococcum (пшеница карликовая). Примерами подвидов T. turgidum, входящих в объем настоящего изобретения, являются turgidum, carthlicum, dicoccon, durum, paleocolchicum, polonicum, turanicum и dicoccoides. Примерами подвидов T. monococcum, входящих в объем настоящего изобретения, являются monococcum (пшеница однозернянка) и aegilopoides. В одном варианте осуществления настоящего изобретения растение пшеницы относится к виду Triticum aestivum и, в частности, представляет культурный сорт Einkorn.

Термин "растение пшеницы" охватывает растения пшеницы на любой стадии зрелости или развития, а также любые ткани или органы (части растения), полученные из любого такого растения, за исключением особо оговоренных случаев. Части растения включают, не ограничиваясь ими, стебли, корни, цветки, семяпочки, тычинки, листья, завязи, меристематические области, каллюсную ткань, пыльники, гаметофиты, спорофиты, пыльцу, микроспоры, протопласты и тому подобные. В объем настоящего изобретения входят также семена, полученные из растений пшеницы по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления изобретения семена используют для истинной селекции для получения повышенной устойчивости к имидазолиноновому гербициду по сравнению с семенами сорта дикого типа пшеницы.

В настоящем изобретении описано растение пшеницы, содержащее одну или более нуклеиновых кислот IMI, которое обладает повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа. В используемом здесь значении термин "нуклеиновая кислота IMI" означает нуклеиновую кислоту, мутированную из нуклеиновой кислоты AHAS в растении пшеницы дикого типа, которая придает повышенную устойчивость к имидазолинону растению, в котором она транскрибирована. В одном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает множество нуклеиновых кислот IMI. При использовании для описания нуклеиновых кислот IMI термин "множество" относится к нуклеиновым кислотам IMI, имеющим разные нуклеотидные последовательности, а не к простому увеличению числа одной нуклеиновой кислоты IMI. Например, нуклеиновые кислоты IMI могут отличаться вследствие того, что они получены из разных геномов или находятся в разных геномах пшеницы.

Растения пшеницы по настоящему изобретению могут иметь множество нуклеиновых кислот IMI из разных геномов, так как указанные растения могут содержать более одного генома. Например, растение пшеницы Triticum aestivum имеет три генома, которые иногда определяют как геномы А, В и D. Так как AHAS является необходимым метаболическим ферментом, можно предположить, что каждый геном имеет, по меньшей мере, один ген, кодирующий фермент AHAS, обычно обнаруживаемый вместе с другими метаболическими ферментами в картированной гексаплоидной пшенице. Нуклеиновая кислота AHAS в каждом геноме может и обычно отличается своей нуклеотидной последовательностью от нуклеиновой кислоты AHAS в другом геноме. Специалист в данной области может определить геном происхождения каждой нуклеиновой кислоты AHAS методами генетического скрещивания и/или секвенирования или расщепления экзонуклеазой, известными в данной области. В соответствии с целями данного изобретения нуклеиновые кислоты IMI, полученные из геномов А, В или D, получили названия нуклеиновых кислот Imi1, Imi2 или Imi3. В данном описании изобретения не утверждается, что какой-либо определенный класс нуклеиновых кислот Imi связан с каким-либо определенным геномом А, В или D. Например, здесь не утверждается того, что нуклеиновые кислоты Imi1 связаны с нуклеиновыми кислотами генома А, что нуклеиновые кислоты Imi2 связаны с нуклеиновыми кислотами генома В и т.д. Названия Imi1, Imi2 и Imi3 просто показывают, что нуклеиновые кислоты IMI в каждом таком классе не расщепляются независимо, в то время как две нуклеиновые кислоты IMI из разных классов расщепляются независимо и поэтому могут быть получены из разных геномов пшеницы.

Класс нуклеиновых кислот Imi1 включает ген FS-4, описанный Newhouse et al. (1992, Plant Physiol. 100:882-886). Класс нуклеиновых кислот Imi2 включает рассматриваемый ниже ген Einkorn IMI3. Каждый класс Imi может включать члены из разных видов пшеницы. Поэтому каждый класс Imi включает нуклеиновые кислоты IMI, которые отличаются своей нуклеотидной последовательностью, но, тем не менее, происходят или находятся в одном и том же геноме пшеницы, о чем свидетельствуют результаты исследований наследственности, приведенные в нижеследующих примерах и известные специалистам в данной области.Таким образом, в объем настоящего изобретения входит растение пшеницы, включающее одну или более нуклеиновых кислот IMI, которое обладает повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа и в котором одна или более нуклеиновых кислот IMI выбраны из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты Imi1, Imi2 и Imi3. В одном варианте осуществления изобретения растение включает нуклеиновую кислоту Imi3. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота Imi3 включает полинуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления изобретения указанное растение включает нуклеиновую кислоту Imi1 или Imi2.

При использовании применительно к нуклеиновым кислотам термин "полученная из" относится к нуклеиновой кислоте, "расположенной в" определенном геноме или "полученной из" определенного генома. Термин "расположенный в" относится к нуклеиновой кислоте, находящейся в пределах данного определенного генома. При использовании применительно к геному термин "полученный из" относится к нуклеиновой кислоте, которая извлечена или выделена из генома. Термин "выделенный" более подробно рассматривается ниже.

В другом варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает нуклеиновую кислоту IMI, которая не является нуклеиновой кислотой Imi1. Термин "не является Imi1" означает нуклеиновую кислоту IMI, которая не относится к вышеописанному классу нуклеиновых кислот Imi1. Один пример нуклеиновой кислоты, не являющейся Imi1, показан в SEQ ID NO: 1. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает нуклеиновую кислоту IMI, включающую полинуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение включает растения пшеницы, содержащие одну, две, три или большее число нуклеиновых кислот IMI, которые обладают повышенной устойчивостью к имидазолиноновому гербициду по сравнению с сортом растения дикого типа. Нуклеиновые кислоты IMI могут включать нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из полинуклеотида SEQ ID NO: 1, полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, 60 последовательно расположенных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, и полинуклеотида, комплементарного SEQ ID NO: 1.

Имидазолиноновые гербициды включают, не ограничиваясь ими, PURSUIT® (имазетапир), CADRE® (имазапик), RAPTOR® (имазамокс), SCEPTER® (имазахин), ASSERT® (имазетабенз), ARSENAL® (имазапир), производное любого вышеуказанного гербицида или смесь двух или большего числа вышеуказанных гербицидов, например, имазапир/имазамокс (ODYSSEY®). Более конкретно имидазолиноновые гербициды включают, не ограничиваясь ими, 2-(4-изопропил)-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновую кислоту, 2-(4-изопропил)-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновую кислоту, 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновую кислоту, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновую кислоту, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновую кислоту и смесь метил 6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата. 5-Этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновая кислота и 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновая кислота являются предпочтительными для использования. 2-(4-Изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновая кислота является особенно предпочтительной для использования.

В одном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает две нуклеиновые кислоты IMI, полученные из или находящиеся в разных геномах пшеницы. Одна из двух нуклеиновых кислот предпочтительно является нуклеиновой кислотой Imi3. Более предпочтительно нуклеиновая кислота Imi3 включает полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает одну нуклеиновую кислоту IMI, которая включает одну полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает три или более нуклеиновых кислот IMI, которые получены из разных геномов. По меньшей мере, одна из трех нуклеиновых кислот IMI предпочтительно включает полинуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения одна или более нуклеиновых кислот IMI, содержащихся в растении, кодируют аминокислотную последовательность, включающую мутацию в домене, который является консервативным для нескольких белков AHAS. Указанные консервативные домены определяются как домен А, домен В, домен С, домен D и домен Е. На фиг.2 показано общее расположение каждого домена в белке AHAS. В используемом здесь значении домен А содержит аминокислотную последовательность AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO: 4). Домен В содержит аминокислотную последовательность QWED (SEQ ID NO: 5). Домен С содержит аминокислотную последовательность VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO: 6). Домен D содержит аминокислотную последовательность AFQETP (SEQ ID NO: 7). Домен Е содержит аминокислотную последовательность IPSGG (SEQ ID NO: 8). Настоящее изобретение также предполагает, что консервативные домены могут иметь незначительные вариации, например, в растениях куколя посевного остаток серина в домене Е заменен остатком аланина.

Таким образом, настоящее изобретение включает растения пшеницы, включающие нуклеиновую кислоту IMI, кодирующую аминокислотную последовательность с мутацией в консервативном домене, выбираемом из группы, состоящей из домена А, домена В, домена С, домена D и домена Е. В одном варианте осуществления изобретения растение пшеницы включает нуклеиновую кислоту IMI, кодирующую аминокислотную последовательность с мутацией в домене Е. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения мутации в консервативных доменах, локализованы на подчеркнутых участках: AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO: 4); QWED (SEQ ID NO: 5); VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO: 6); AFQETP (SEQ ID NO: 7) и IPSGG (SEQ ID NO: 8). Одной предпочтительной заменой является замена серина аспарагином в домене Е (SEQ ID NO: 8).Рассматриваемые растения пшеницы могут быть трансгенными или нетрансгенными растениями пшеницы. В используемом здесь значении термин "трансгенный" относится к любому растению, растительной клетке, каллюсу, растительной ткани или части растения, которые содержат, по меньшей мере, один полный или частичный рекомбинантный полинуклеотид. Во многих случаях осуществляют стабильную интеграцию полного или частичного рекомбинантного полинуклеотида в хромосому или в стабильный внехромосомный элемент, так чтобы он передавался последующим поколениям. В соответствии с целями данного изобретения термин "рекомбинантный полинуклеотид" означает полинуклеотид, который изменен, перестроен или модифицирован методами генной инженерии. Примеры указанного полинуклеотида включают любой клонированный полинуклеотид или полинуклеотиды, связанные или присоединенные к гетерологичным последовательностям. Термин "рекомбинантный" не относится к изменениям полинуклеотидов, возникающим в результате природных явлений, таких как спонтанные мутации, или неспонтанного мутагенеза последующим селекционным размножением. Растения, имеющие мутации, возникающие вследствие неспонтанного мутагенеза и селекционного размножения, определяются в данном описании изобретения как нетрансгенные растения и входят в объем настоящего изобретения. В вариантах осуществления изобретения, где растение пшеницы является трансгенным и включает множество нуклеиновых кислот IMI, нуклеиновые кислоты могут быть получены из разных геномов или из одного генома. Альтернативно, в вариантах осуществления изобретения, где растение пшеницы является нетрансгенным и включает множество нуклеиновых кислот IMI, нуклеиновые кислоты находятся в разных геномах.

Примером нетрансгенного растения пшеницы, включающего одну нуклеиновую кислоту IMI, является сорт, депонированный в АТСС под идентификационным номером патентного депозитария РТА-4113 и определяемый здесь как сорт пшеницы Einkorn IMI. Сорт пшеницы Einkorn IMI содержит нуклеиновую кислоту Imi3. Частичная нуклеотидная последовательность, соответствующая гену Einkorn IMI, представлена в SEQ ID NO: 1.

В Американскую коллекцию типовых культур, Manassas, Virginia, 4 марта 2002 г. было отдельно депонировано 2500 семян сортов пшеницы Einkorn IMI. Депозит создан в соответствии с нормами и правилами Будапештского договора о депонировании микроорганизмов. Депонирование было осуществлено на срок не менее тридцати лет и, по меньшей мере, на пять лет после последнего запроса к АТСС о предоставлении образца из хранилища. Депонированные семена представлены под идентификационным номером патентного депозитария РТА-4113.

В объем настоящего изобретения входит растение пшеницы, представленное под идентификационным номером патентного депозитария РТА-4113; мутантное, рекомбинантное или генетически сконструированное производное растения, представленного под идентификационным номером патентного депозитария РТА-4113; любое потомство растения, представленного под идентификационным номером патентного депозитария РТА-4113; и растение, являющееся потомством любого из указанных растений. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение пшеницы по настоящему изобретению дополнительно имеет характеристики устойчивости к гербицидам, присущие растению, представленному под идентификационным номером патентного депозитария РТА-4113.

В объем настоящего изобретения входят также гибриды сортов пшеницы Einkorn IMI и других сортов пшеницы. Другие сорта пшеницы включают, не ограничиваясь ими, T. aestivum L. сорта Fidel и любой сорт пшеницы, содержащий мутантный ген FS-1, FS-2, FS-3 или FS-4. (См. патент США № 6339184 и заявку на патент США № 08/474832.)

Термины "культурный сорт" и "сорт" означают группу растений одного вида, обладающих общим набором характеристик или признаков, которые признаны специалистами в данной области достаточными для отличия одного сорта или культурного сорта от другого сорта или культурного сорта. Ни один из терминов не предполагает, что все растения любого данного сорта или культурного сорта являются генетически идентичными в отношении всего гена или на молекулярном уровне, либо что любое данное растение является гомозиготным во всех локусах. Сорт или культурный сорт считается результатом "истинной селекции" определенного признака, если у самоопыляющегося сорта или культурного сорта все потомство имеет указанный признак. В настоящем изобретении признак возникает в результате мутации гена AHAS растения или семени пшеницы.

Помимо растений пшеницы настоящее изобретение относится к выделенным белкам и нуклеиновым кислотам IMI. Нуклеиновые кислоты включают полинуклеотид, выбираемый из группы, состоящей из полинуклеотида SEQ ID NO: 1, полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, 60 последовательно расположенных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, и полинуклеотида, комплементарного SEQ ID NO: 1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота IMI включает полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.

Термин "белок AHAS" означает белок-синтазу ацетогидроксикислот, и термин "белок IMI" означает любой белок AHAS, который мутировал из белка AHAS дикого типа и придает повышенную устойчивость к имидазолинону растению, растительной клетке, части растения, семени растения или растительной ткани, в которых он экспрессирован. В предпочтительном варианте осуществления изобретения белок IMI включает полипептид, кодируемый полинуклеотидом SEQ ID NO: 1. В используемом здесь значении термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" означают РНК или ДНК, которая является линейной или разветвленной, одноцепочечной или двухцепочечной, или их гибрид. Данный термин также означает гибриды РНК/ДНК. Указанные термины означают также нетранслируемую последовательность, находящуюся как у 3'-конца, так и у 5'-конца кодирующей области гена: по меньшей мере, около 1000 нуклеотидов последовательности выше 5'-конца кодирующей области и, по меньшей мере, около 200 нуклеотидов последовательности ниже 3'-конца кодирующей области гена. Реже встречающиеся основания, такие как инозин, 5-метилцитозин, 6-метиладенин, гипоксантин и другие, могут быть также использованы для антисмыслового дцРНК и рибозимного спаривания. Например, установлено, что полинуклеотиды, содержащие С-5 пропиновые аналоги уридина и цитидина, могут связываться с РНК с высокой степенью сродства и являются сильнодействующими антисмысловыми ингибиторами экспрессии генов. Можно также произвести другие модификации, такие как изменение фосфодиэфирного скелета или 2'-гидроксильной группы в рибозосахарной группе РНК. Антисмысловые полинуклеотиды и рибозимы могут полностью состоять из рибонуклеотидов или могут содержать смесь рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. Полинуклеотиды по данному изобретению можно получить любыми способами, включая геномные препараты, препараты кДНК, синтез in vitro, ОТ-ПЦР и транскрипцию in vitro или in vivo.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты представляет такую молекулу, которая по существу отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, присутствующих в природном источнике нуклеиновой кислоты (то есть последовательности, кодирующие другие полипептиды). "Выделенная" нуклеиновая кислота предпочтительно не имеет некоторых последовательностей, которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (то есть последовательности, находящиеся у 5'-конца и 3'-конца нуклеиновой кислоты) в природном репликоне. Например, клонированная нуклеиновая кислота считается выделенной. В разных вариантах осуществления изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты IMI может содержать нуклеотидные последовательности длиной менее примерно 5 т.п.о., 4 т.п.о., 3 т.п.о., 2 т.п.о., 1 т.п.о., 0,5 т.п.о. или 0,1 т.п.о, которые в естественных условиях фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена данная нуклеиновая кислота (например, клетка Triticum monococcum). Нуклеиновая кислота также считается выделенной, если она изменена в результате вмешательства человека или помещена в локус или участок, не являющийся ее природным сайтом, или если указанная нуклеиновая кислота внесена в клетку агроинфицированием или высокоскоростной биолистической трансфекцией. Кроме того, "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может не иметь некоторых других клеточных веществ, с которыми она обычно бывает связана, или культуральной среды при получении методами генной инженерии или химических предшественников, или других химических веществ в случае химического синтеза.

Из определения термина "выделенные нуклеиновые кислоты" особо исключаются природные хромосомы (такие как хромосомные препараты), библиотеки искусственных хромосом, геномные библиотеки и библиотеки кДНК, которые существуют в виде препаратов нуклеиновых кислот in vitro или в виде препаратов трансфицированных/трансформированных клеток-хозяев, где клетки-хозяева представляют собой гетерогенный препарат in vitro или культивируются в виде гетерогенной популяции отдельных колоний. Из определения выделенной нуклеиновой кислоты исключены также вышеуказанные библиотеки, в которых специфическая нуклеиновая кислота составляет менее 5% от общего числа вставок нуклеиновых кислот в векторных молекулах. Кроме того, из данного определения исключена геномная ДНК клетки или препараты РНК клетки (включая цельноклеточные препараты, подвергнутые механическому фрагментированию или ферментативному расщеплению). Далее из указанного определения особо исключены цельноклеточные препараты, представляющие препарат in vitro или гетерогенную смесь, разделенную электрофорезом, в которой нуклеиновая кислота по данному изобретению не отделена от гетерологичных нуклеиновых кислот в среде для электрофореза (например, путем вырезания одной полосы из гетерогенной популяции, полос, в агарозном геле или найлоновом блотте).

Молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, например молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее часть, можно выделить стандартными методами, применяемыми в молекулярной биологии, и на основании информации о последовательностях, приводимой в данном описании изобретения. Например, кДНК IMI T. monococcum можно выделить из библиотеки T. monococcum, используя полную или частичную последовательность SEQ ID NO: 1. Кроме того, молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую полную или частичную SEQ ID NO: 1, можно выделить при помощи полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных затравок, созданных на основе данной последовательности. Например, мРНК можно выделить из растительных клеток (например, методом экстракции гуанидинтиоционатом, описанным Chirgwin et al., 1979, Biochemistry, 18: 5294-5299), и кДНК можно получить при помощи обратной транскриптазы (например, обратной транскриптазы Moloney MLV фирмы Gibco/BRL, Bethesda, MD; или обратной транскриптазы AMV фирмы Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Синтетические олигонуклеотидные затравки для амплификации при помощи полимеразной цепной реакции можно создать на основе нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению можно амплифицировать, используя кДНК или альтернативно геномную ДНК в качестве матрицы и соответствующие олигонуклеотидные затравки, стандартными методами амплификации при помощи ПЦР. Амплифицированную таким образом молекулу нуклеиновой кислоты можно клонировать в соответствующий вектор и исследовать, выполняя анализ последовательности ДНК. Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидной последовательности IMI, можно получить стандартными методами синтеза, например, в автоматическом синтезаторе ДНК.

Нуклеиновые кислоты IMI по настоящему изобретению могут включать последовательности, кодирующие белок IMI (то есть "кодирующие области"), а также 5'-нетранслируемые последовательности и 3'-нетранслируемые последовательности. Альтернативно молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут включать только кодирующие области гена IMI или могут содержать целые геномные фрагменты, выделенные из геномной ДНК. Кодирующая область указанных последовательностей определяется как "положение ORF". Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может включать часть кодирующей области гена IMI, например фрагмент, который можно использовать в качестве зонда или затравки. Нуклеотидные последовательности, обнаруженные в результате клонирования генов IMI из T.monococcum, позволяют получить зонды и затравки, предназначенные для идентификации и/или клонирования гомологов IMI в других типах клеток и организмах, а также гомологов IMI из других растений пшеницы и родственных видов. Часть кодирующей области может также