Растворы полимеризованного гемоглобина с пониженным количеством тетрамера и способ их получения

Растворы полимеризованного гемоглобина с пониженным количеством тетрамера и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на родственную заявку

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки США № 60/443436, поданной 29 января 2003 г.

Область изобретения

Данное изобретение относится к стабилизированным растворам, переносящим кислород. Более конкретно, оно относится к растворам гемоглобина, в которых после соответствующей обработки повышается стабильность полимерных связей и снижается количество образующегося тетрамера.

Предпосылки создания изобретения

Существует настоятельная потребность в готовых кровяных продуктах для постоянно растущих нужд хирургии и травматологии, а также в пополнении банков крови. Растворы, содержащие кислород, такие как растворы на основе гемоглобина, можно использовать вместо цельной крови или красных кровяных клеток для пациентов, нуждающихся в повышении способности переносить кислород. Поскольку их применение не зависит от наличия донора, такие растворы могут быть легко доступными в чрезвычайной ситуации или при нехватке конкретных образцов в банке крови. Кроме того, из-за риска инфицирования патогенами, переносимыми кровью, при переливании крови пациент может предпочесть раствор на основе гемоглобина вместо цельной крови или красных кровяных клеток. В частности, такие растворы могут содержать, без ограничения, переносчики кислорода, кровезаменители и композиции на основе гемоглобина, такие как раскрытые в патентах США №№ 6498141, 6133425, 5464814, 5438041, 5217648, 5194590, 5061688 и 4826811, описания которых включены в данный документ в качестве ссылки во всей их полноте.

В данной области известно, что не содержащий стромы гемоглобин способен осуществлять транспорт кислорода и обратимо связывать кислород (или лиганд). Однако применение растворов гемоглобина, способных переносить достаточное для поддержания жизни количество кислорода, связано с некоторыми проблемами вследствие ряда нежелательных побочных эффектов, таких как ухудшение функционирования почек. Полагают, что данные эффекты обусловлены присутствием в растворе нежелательных примесей, таких как бактериальный эндотоксин или фрагменты мембран красных кровяных клеток (строма). Хотя эти примеси действительно могут вызывать изменения в функционировании почек, растворы гемоглобина, по существу не содержащие таких примесей, тем не менее тоже вызывают значительную почечную дисфункцию. Причиной почечной дисфункции в числе прочего могут являться физиологически неприемлемые количества неполимеризованного тетрамера гемоглобина.

Растворы гемоглобина, по существу не содержащие тетрамера, можно использовать для пополнения практически всего объема крови пациента-человека, при этом они не вызывают сужения кровеносных сосудов, нефротоксичности, гемоглобинурии или других проблем, связанных с внутривенным введением синтетических или полусинтетических переносчиков кислорода и кровезаменителей. Хотя указанные растворы обладают превосходной эффективностью, срок годности данного продукта ограничен, так как известно, что гемоглобиновый полимер со временем медленно деградирует с образованием тетрамерных элементов. Соответственно, существует потребность в способе сохранения раствора в виде раствора, по существу не содержащего тетрамера, в течение длительного периода времени с целью увеличения срока годности раствора.

Краткое описание изобретения

В одном аспекте изобретение предлагает способ получения раствора гемоглобина, по существу не содержащего тетрамера, включающий в себя полимеризацию гемоглобина в растворе, обработку полимеризованного гемоглобина для образования тетрамера и удаление тетрамера из раствора полимеризованного гемоглобина.

В другом аспекте данное изобретение относится к раствору гемоглобина, по существу не содержащему тетрамера, полученному путем полимеризации раствора гемоглобина, тепловой обработки раствора полимеризованного гемоглобина для образования тетрамера и удаления тетрамера из раствора полимеризованного гемоглобина.

В другом аспекте изобретение относится к способу стабилизации раствора полимеризованного гемоглобина, включающему в себя обработку раствора полимеризованного гемоглобина с частичным разложением полимеризованного гемоглобина до тетрамера и удаление тетрамера из раствора.

В следующем аспекте изобретение предлагает способ получения стабилизированного раствора полимеризованного гемоглобина. Данный способ включает в себя получение раствора полимеризованного гемоглобина, удаление тетрамера из раствора полимеризованного гемоглобина с получением раствора полимеризованного гемоглобина, по существу не содержащего тетрамера, выдерживание раствора полимеризованного гемоглобина для образования тетрамера и удаление образовавшегося тетрамера. Выдерживание может включать в себя хранение раствора гемоглобина до тех пор, пока концентрация тетрамера не превысит приблизительно 1,0% от общего содержания гемоглобина, например, дольше одного года.

Гемоглобин можно получить из крови млекопитающего, например, из человеческой или бычьей крови. Полимеризацию гемоглобина можно проводить в присутствии глутаральдегида. Тетрамер можно удалить фильтрацией. Обработку полимеризованного раствора, приводящую к образованию тетрамера, можно проводить путем нагревания раствора при температуре приблизительно выше 45°C в течение, по меньшей мере, приблизительно 24 часов. После удаления тетрамера его остаточная концентрация в растворе может составлять менее чем приблизительно 1,0% по отношению к общему содержанию гемоглобина в растворе или менее чем приблизительно 0,3% по отношению к общему содержанию гемоглобина в растворе.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показано количество тетрамера, образующегося в растворах гемоглобина после хранения при 2-8°C.

На фиг.2 показано количество тетрамера, образующегося в растворах гемоглобина после хранения при 23-27°C.

На фиг.3 сравнивается образование тетрамера в сразу обработанных растворах гемоглобина и в повторно обработанных выдержанных растворах гемоглобина после хранения при 2-8°C.

На фиг.4 сравнивается образование тетрамера в сразу обработанных растворах гемоглобина и в повторно обработанных выдержанных растворах гемоглобина после хранения при 23-27°C.

На фиг.5 сравнивается образование тетрамера в растворе гемоглобина, обработанного сразу, и в растворе, подвергавшемся горячему гашению, после хранения при 2-8°C.

На фиг.6 сравнивается образование тетрамера в растворе гемоглобина, обработанного сразу, и в растворе, подвергавшемся горячему гашению, после хранения при 23-27°C.

На фиг.7 сравнивается образование тетрамера в сразу обработанных растворах гемоглобина и в растворах, предварительно обработанных с целью вызвать образование тетрамера, после хранения при 2-8°C.

На фиг.8 сравнивается образование тетрамера в сразу обработанных растворах гемоглобина и в растворах, предварительно обработанных с целью вызвать образование тетрамера, после хранения при 23-27°C.

На фиг.9 приведена хроматограмма ВЭЖХ очищенного раствора полимеризованного гемоглобина. Полимеризованный гемоглобин характеризуется пиками, соответствующими времени удерживания 15,19, 16,01, 17,16 и 18,79. Тетрамер характеризуется пиками, соответствующими времени удерживания 21,22 и 21,83.

На фиг.10 приведена хроматограмма ВЭЖХ раствора полимеризованного гемоглобина после обработки глицином, но до очистки. Полимеризованный гемоглобин характеризуется пиками, соответствующими времени удерживания 14,62, 15,44, 16,60 и 18,24. Тетрамер характеризуется пиками, соответствующими времени удерживания 20,71. Содержание полимера в данном веществе составляет приблизительно 75%.

На фиг.11 приведена схема, изображающая часть способа получения раствора гемоглобина, не содержащего свободного кислорода и подлежащего впоследствии пиридоксилированию и полимеризации, а также оборудование, используемое в данном способе.

На фиг.12 приведена схема, изображающая часть способа получения очищенного, пиридоксилированного и полимеризованного гемоглобинового продукта, не содержащего свободного кислорода, начиная с пиридоксилирования и полимеризации, а также оборудование, используемое в данном способе, и часть способа получения конечного гемоглобинового продукта, содержащего физиологические уровни электролитов, а также оборудование, используемое в данном способе.

На фиг.13 приведена схема, изображающая процесс очистки методом колоночной хроматографии, использующийся в данном изобретении.

На фиг.14 приведена схема, изображающая процесс очистки методом фильтрации через полупроницаемую мембрану, использующийся в данном изобретении.

Подробное описание

Данное изобретение предлагает раствор, способный переносить кислород, который содержит поперечно-сшитый, полимеризованный гемоглобин и практически не содержит тетрамера, стромы, стромальных примесей и других загрязняющих веществ.

Перед подробным описанием настоящего изобретения приводится определение некоторых терминов. Следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена не для ограничения, а только для описания конкретных воплощений. В данном описании единственное число включает в себя множественное число описываемых объектов, если контекст не предписывает иное толкование.

Термин "гемоглобин" относится к гемоглобину, полученному из любого источника. Гемоглобин может быть получен от млекопитающих, включая людей, крупный рогатый скот, свиней и овец, или из других источников, например, он может представлять собой трансгенный гемоглобин, описанный в BIO/TECHNOLOGY, 12: 55-59 (1994), и рекомбинантный гемоглобин, например, такой, как описанный в Nature, 356: 258-260 (1992). В данном описании % суммарного гемоглобина (THb) приведен в граммах гемоглобина/100 мл раствора.

Термин "раствор гемоглобина" относится к раствору тетрамерных или полимеризованных молекул гемоглобина, причем указанные молекулы не находятся внутри красных кровяных клеток. Отсутствие, или отсутствие по существу, стромы или стромальных элементов красных кровяных клеток в таком растворе не является обязательным. Однако в одном аспекте данного изобретения растворы полимеризованного гемоглобина практически не содержат стромы или стромальных элементов красных кровяных клеток.

Термин "поперечно-сшитый" означает, что на молекулу, или в молекулу, или между молекулами вводят молекулярные "мостики" с целью изменения формы, размера, функционирования или физических характеристик молекулы. Поперечно-сшитые молекулы могут быть полимеризованными или неполимеризованными, например поперечно-сшитые молекулы могут представлять собой тетрамеры.

Термин "тетрамер" или "тетрамерный" относится к молекулам гемоглобина с молекулярной массой приблизительно 64 кДа, то есть данный термин относится как к нативным молекулам гемоглобина, так и к молекулам гемоглобина с внутримолекулярной поперечной сшивкой. В данном описании % тетрамера определяется как количество тетрамера, выраженное в виде процента от количества суммарного гемоглобина (THb) в растворе. Например, в 100 мл раствора гемоглобина с концентрацией THb 10% и тетрамера 1% содержится 0,1 г тетрамера.

Термин "по существу (или практически) не содержащий тетрамера" означает уровень чистоты в отношении примеси тетрамера, при котором биологические ответы на вводимый тетрамер уже отсутствуют. Основным критерием является отсутствие изменений в функционировании почек при введении эффективных количеств, то есть при уровне чистоты приблизительно 99% или выше (количество тетрамера составляет менее чем приблизительно 1%). Предпочтительный продукт, получаемый по способу данного изобретения, содержит не более чем приблизительно 0,8% тетрамера по отношению к массе суммарного гемоглобина (THb). Другими словами, продукт, по существу не содержащий тетрамера, в соответствии с данным изобретением содержит неполимеризованный тетрамер гемоглобина в количествах, не превышающих физиологически приемлемый уровень. Особенно предпочтительные продукты данного изобретения содержат менее чем приблизительно 0,5% тетрамера; наиболее предпочтительные продукты данного изобретения содержат приблизительно 0,3-0,4% тетрамера. Было обнаружено, что такие количества тетрамера являются физиологически приемлемыми.

Термин "образование" или "образование тетрамера" относится к увеличению количества тетрамера в растворе вследствие деградации полимеризованного гемоглобина до тетрамера. Деградация полимера может происходить в результате обработки химическими реагентами, тепловой обработки, с течением времени или в результате сочетания данных условий. Как правило, тетрамер образуется при нагревании или при выдерживании полимеризованного раствора. Следовательно, процентное содержание тетрамера увеличивается при хранении раствора. Образование тетрамера может ускоряться при нагревании раствора полимеризованного гемоглобина. Считается, что образование тетрамера произошло, если его количество в растворе увеличилось в той или иной степени. В данном описании термин частичная деградация полимеризованного гемоглобина относится к деградации в растворе части, но не всего полимера до тетрамера.

Термин "выдерживание" раствора гемоглобина относится к хранению раствора в течение любого промежутка времени при любой температуре. Повышенная температура ускоряет процессы, происходящие при выдерживании раствора гемоглобина. "Выдержанный" раствор гемоглобина содержит тетрамер, образовавшийся при хранении.

Термин "предварительное образование" или "предварительное образование тетрамера" относится к методу, в котором для стимуляции образования тетрамера используют тепловую обработку.

Термин "горячее гашение" относится к способу обработки, который включает в себя нагревание раствора в процессе гашения реакции полимеризации для завершения реакции гашения.

Термин "полимеризация" или "полимеризованный" относится к процессу, или к результату, введения молекулярных мостиков между молекулами или субъединицами тетрамера, которое приводит к увеличению размера и массы полученной полимеризованной молекулы по сравнению с молекулой нативного или тетрамерного гемоглобина. Полимеризованный гемоглобин не является тетрамерным гемоглобином. Полимеризацию можно проводить с использованием различных полимеризующих средств, включающих в себя глутаральдегид, имидоэфиры и другие, в биохимически подходящем носителе, способами, хорошо известными специалистам в данной области.

Термин "пиридоксилированный" или "пиридоксилирование" относится к способу, или к результату связывания молекул, содержащих пиридоксаль-5'-фосфат, с молекулой гемоглобина путем взаимодействия данной молекулы пиридоксаль-5'-фосфатом ("P5P) или 2-нор-формилпиридоксаль-5'-фосфатом. Показано, что пиридоксилирование благоприятно изменяет способность обратимо связывать кислород, т.е. увеличивает P₅₀ некоторых гемоглобинов млекопитающих, например человеческого гемоглобина.

Термин "стабильный" или "стабильность" относится к состоянию или характеристике растворов гемоглобина, устойчивых к деградации и имеющих более длительный срок годности, чем нестабильные растворы. Например, в процессе хранения раствора гемоглобина, стабилизированного в соответствии с данным изобретением, образование тетрамера происходит в меньшей степени, или медленнее, чем при хранении растворов, полученных с использованием других способов. Стабильность раствора гемоглобина зависит от нескольких других параметров, не зависящих от образования тетрамера, которые включают в себя, например, скорость превращения дезоксигемоглобина в оксигемоглобин или метгемоглобин. Данный параметр можно контролировать в числе прочих способов путем предотвращения доступа кислорода в упакованный раствор в процессе хранения. В стабилизированных растворах гемоглобина деградация еще может происходить, но с более низкой скоростью, чем в нестабилизированных растворах.

Данное изобретение предлагает раствор полимеризованного гемоглобина, который, по существу, не содержит тетрамерного (нативного или с внутримолекулярной поперечной сшивкой) гемоглобина, стромальных и разных других примесей. Данный раствор является физиологически приемлемым, а также терапевтически и клинически пригодным. Полученный продукт обладает способностью обратимо связывать кислород, что необходимо для осуществления транспорта кислорода. При применении продукт демонстрирует хорошие характеристики нагрузки и разгрузки кислорода, которые коррелируют с кривой диссоциации комплекса кислород-гемоглобин (P₅₀), полученной для цельной крови. Данный продукт связывает кислород с высоким сродством в капиллярах легких и затем соответствующим образом высвобождает кислород в тканях организма. Полученный продукт также не требует исследований по совместимости с реципиентом.

В одном аспекте при введении людям продукт может иметь период полужизни, составляющий, по меньшей мере, приблизительно 15 часов. В другом аспекте период полужизни превышает приблизительно 24 часа. Гемоглобиновый продукт можно использовать для пополнения практически всего объема крови пациента-человека, при этом он не вызывает сужения кровеносных сосудов, нефротоксичности, гемоглобинурии или других проблем, связанных с внутривенным введением синтетических или полусинтетических переносчиков кислорода и кровезаменителей.

Период полужизни конечного продукта данного изобретения определяют in vivo у млекопитающих, например у людей. Как правило, образец крови берут у млекопитающего через определенный промежуток времени после введения продукта. Затем определяют количество продукта путем центрифугирования образца крови, отделения фракции плазмы, спектрофотометрического определения уровня гемоглобина в плазме и соотносят количество продукта, оставшееся у млекопитающего, с периодом полужизни продукта.

С помощью способа настоящего изобретения можно получить стабилизированный раствор полимеризованного гемоглобина с увеличенным периодом полужизни. Как правило, при выдерживании (старении) полимеризованного раствора гемоглобина происходит образование тетрамера. Образовавшийся тетрамер можно удалить из выдержанного раствора гемоглобина способом настоящего изобретения. В выдержанных растворах гемоглобина после обработки с целью удаления тетрамера при последующем хранении образование тетрамера происходит медленнее, чем в растворах гемоглобина, обработанных сразу (не выдержанных). Таким образом, растворы гемоглобина, обработанные способом настоящего изобретения, обладают большей стабильностью с точки зрения образования тетрамера, чем сразу обработанные растворы.

Было обнаружено, что физиологически и клинически пригодные растворы гемоглобина, как правило, содержат менее 1,0% тетрамера. Соответственно, поскольку тетрамер образуется со временем в процессе хранения (старения), чтобы достичь приемлемого срока годности для раствора гемоглобина, желательно, чтобы вновь обработанные растворы гемоглобина содержали менее чем приблизительно 0,3% тетрамера, с расчетом на то, что в растворе будет образовываться тетрамер, но раствор останется физиологически пригодным, пока содержание тетрамера не достигнет 1,0%.

На фиг.1 показано количество тетрамера, обычно образующееся в растворах гемоглобина после хранения при 2-8°C. В растворе с начальным уровнем тетрамера приблизительно 0,5% содержание тетрамера увеличивается более чем до 1,0% приблизительно через 18 месяцев.

На фиг.2 показано количество тетрамера, образующегося в растворах гемоглобина после хранения при 23-27°C. В растворе с начальным уровнем тетрамера приблизительно 0,5% содержание тетрамера увеличивается более чем до 1,0% приблизительно через 3-4 недели. Следовательно, если растворы гемоглобина хранить при повышенной температуре, скорость образования тетрамера увеличивается. Выдерживание растворов тетрамера можно осуществлять, оставляя раствор гемоглобина стоять в течение продолжительного времени. При более высоких температурах старение растворов гемоглобина происходит быстрее, чем при низких температурах.

На фиг.3 сравнивается образование тетрамера в сразу обработанном растворе гемоглобина и в выдержанном растворе гемоглобина, обработанном способом данного изобретения (повторно обработанном). Оба раствора хранят при 2-8°C. Через 24 месяца содержание тетрамера в сразу обработанном растворе гемоглобина увеличивается до 0,8%, тогда как в повторно обработанном растворе содержание тетрамера увеличивается только до 0,3%. Через 36 месяцев содержание тетрамера в повторно обработанном растворе увеличивается до 0,4%. Подобным образом на фиг.4 показано, что тетрамер образуется быстрее в сразу обработанных растворах гемоглобина, чем в повторно обработанных растворах при хранении при 23-27°C.

В одном аспекте способ данного изобретения для увеличения стабильности раствора включает в себя стимуляцию предварительного образования тетрамера в растворе гемоглобина путем нагревания раствора, чтобы увеличить скорость образования тетрамера. Образовавшийся тетрамер можно удалить с получением более стабильного раствора с точки зрения образования тетрамера, чем растворы полимеризованного гемоглобина, которые не подвергались тепловой обработке для ускорения образования тетрамера. После удаления образовавшегося тетрамера из раствора гемоглобина последующее образование тетрамера замедляется или уменьшается.

Тепловую обработку можно проводить до или после очистки раствора. Если раствор подвергают тепловой обработке в процессе получения, такую тепловую обработку следует проводить после полимеризации. Затем раствор очищают, удаляя по существу весь тетрамер. Если тепловую обработку проводят после очистки, раствор нужно почистить повторно, чтобы удалить образовавшийся тетрамер.

Тепловую обработку полимеризованного раствора гемоглобина можно проводить при 45-55°C в течение приблизительно 20-30 часов. Полагают, что в данном способе, чтобы вызвать образование тетрамера, можно использовать другую температуру или другое время, поскольку было показано, что образование тетрамера является функцией, зависящей, в числе прочих факторов, от времени и температуры.

Способ данного изобретения имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что он позволяет получить конечный продукт, практически не содержащий микробных и вирусных антигенов и патогенов. Содержание таких микробных и вирусных антигенов и патогенов уменьшается до недетектируемых уровней, т.е. продукт является стерильным по данным анализа, описанного в United States Pharmacopoeia, XXIII Chapter 71. Примеры таких антигенов и патогенов включают в себя, например, бактерии, риккетсии, грибки, простейшие, вирусы и другие организмы. Наиболее важно, что данный способ позволяет получить биологический продукт, не содержащий вирусов, вызывающих гепатит и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД).

Тепловая обработка раствора гемоглобина, по существу, приводит к инактивации вирусов. Инактивацию вирусов посредством тепловой обработки можно проводить как отдельную стадию или ее можно объединить с тепловой обработкой для удаления тетрамера. Как правило, для безопасности работников тепловую обработку для инактивации вирусов предпочтительно проводить после удаления гемоглобина из красных кровяных клеток. Однако тепловая обработка раствора после полимеризации предположительно также приводит к желаемой инактивации вирусов. Если исключить стадию тепловой обработки для инактивации вирусов перед полимеризацией, температуру тепловой обработки после полимеризации для образования тетрамера можно увеличить приблизительно до 60-62°C или до другой подходящей температуры, чтобы обеспечить инактивацию вирусов. Таким образом, посредством одной стадии тепловой обработки после полимеризации можно достичь и инактивации вирусов и образования тетрамера.

Биологический продукт данного изобретения при вливании в количествах, достигающих, по меньшей мере, приблизительно 10,0 л, не вызывает сужения кровеносных сосудов, нефротоксичности, гемоглобинурии или других проблем, связанных с внутривенным введением известных растворов гемоглобина, содержащих нежелательные количества тетрамерного гемоглобина. Внутривенное введение продукта, полученного по описанному здесь способу, не приводит к заметному уменьшению количества образующейся мочи, к значительному снижению клубочковой фильтрации, к заметному просачиванию в перитонеальную полость и к заметному изменению цвета образующейся мочи.

Следовательно, способ данного изобретения позволяет получать неклеточный заменитель красных кровяных клеток, который можно использовать для лечения травмы, инфаркта миокарда, инсульта, острой анемии и нарушений, связанных с дефицитом кислорода, таких как гипоксемия, гипоксия или конечная стадия гипоксии, являющаяся следствием ухудшения легочной функции или неспособности легких полностью насыщать кровь кислородом. Данный продукт также можно использовать для лечения любого заболевания или медицинского состояния, требующего питающей жидкости (например, травмы, в особенности, геморрагического шока), увеличения объема внутрисосудистой жидкости или обменного переливания крови. Кроме медицинского лечения, продукт можно использовать при хранении органов для трансплантации.

В одном аспекте исходным веществом в способе данного изобретения является цельная человеческая кровь или эритроцитарная масса. Как правило, желательно, но необязательно, использовать в качестве источника красные кровяные клетки, которые хранились не более 2 недель после даты истечения срока годности, указанной на пакете для хранения крови. Применение человеческой цельной крови, вышедшей из употребления более 2 недель назад, создает дополнительные трудности при экстракции гемоглобина и удалении клеточных остатков, таких как стромальные белки и примеси. Кроме того, способы, описанные в данном документе, можно применять ко всем гемоглобинам с минимальными модификациями, находящимися в пределах компетенции специалистов в данной области.

Если в качестве исходного вещества используют человеческую кровь, в процессе аспирации и фильтрации эритроцитов, красные кровяные клетки (RBC) извлекают из донорских пакетов в асептических условиях, не допуская попадания воздуха в кровь, и пропускают их через ряд фильтров, чтобы получить суспензию RBC, содержащую пониженное количество лейкоцитов и тромбоцитов. Затем полученную суспензию промывают/лизируют.

Суспензию промывают в атмосфере монооксида углерода приблизительно 1% раствором NaCl, чтобы удалить остаточные плазменные белки. Затем промытые RBC обрабатывают водой для инъекции ("WFI"), чтобы лизировать клетки, и полученную смесь очищают с помощью устройства для фильтрации в перекрестном потоке. Можно использовать другие методы лизирования красных кровяных клеток, известные специалистам в данной области, в том числе, например, механический или ультразвуковой лизис клеток. Очищенный продукт затем можно подвергнуть тепловой обработке для инактивации вирусов и для дополнительного осаждения стромального вещества, удаляемого фильтрацией. После данной процедуры получают продукт, который представляет собой раствор не содержащего стромы гемоглобина (SFH) с концентрацией THb приблизительно 3% (мас./об.).

После очистки раствор, содержащий карбоксигемоглобин, предпочтительно концентрируют и дегазируют, получая не содержащий стромы раствор гемоглобина, который включает в себя дезоксигемоглобин. Дегазирование включает в себя насыщение раствора карбоксигемоглобина кислородом в течение приблизительно 16 часов с получением раствора, содержащего окисленный гемоглобин и приблизительно 7% по массе, по отношению к общей массе гемоглобина, карбоксигемоглобина. Затем кислород вытесняют азотом, аргоном или гелием с получением раствора, содержащего свободный гемоглобин, т.е., гемоглобин, не участвующий в комплексообразовании, и приблизительно 7% по массе, по отношению к общей массе гемоглобина, оксигемоглобина. Полученный дегазированный раствор фильтруют и переносят в сосуд для химической модификации.

После дегазирования не содержащий стромы раствор гемоглобина, включающего в себя человеческий гемоглобин, нужно пиридоксилировать с использованием пиридоксаль-5'-фосфата (P5P) с молярным соотношением пиридоксаль-5'-фосфата и гемоглобина от приблизительно 1:1 до 3:1. Альтернативно, не содержащий стромы гемоглобин можно пиридоксилировать, используя 2-нор-2-формилпиридоксаль-5'-фосфат. К смеси для пиридоксилирования добавляют восстанавливающий реагент, например цианоборгидрид натрия, или, предпочтительно, боргидрид натрия. Избыток реагентов и солей удаляют диализом против воды, не содержащей пирогенов, или, предпочтительно, диафильтрацией с использованием WFI. Гемоглобин из источников, отличных от человеческой крови, можно не пиридоксилировать. Специалистам в области растворов гемоглобина известно, в каких случаях требуется пиридоксилирование.

Не содержащий стромы раствор гемоглобина полимеризуют любым способом, известным специалистам в области растворов гемоглобина. Предпочтительно, в качестве полимеризующего реагента используют водный раствор глутаральдегида. Продолжительность полимеризации и количество добавляемого глутаральдегида зависит от объема раствора гемоглобина, желаемого выхода полимеров и желаемого распределения по молекулярной массе. Как правило, более длительное время полимеризации увеличивает выход полимеров и распределение полимеров по молекулярной массе. Выход полимеров, составляющий приблизительно 75% по массе по отношению к общей массе гемоглобина, получают, если реакция длится приблизительно 16-18 часов. Предпочтительный момент окончания полимеризации определяют как момент, когда содержание полимеров в растворе достигнет приблизительно 75% по массе по отношению к общей массе гемоглобина, что отслеживают методом эксклюзионной ВЭЖХ. Альтернативно, момент окончания определяют как момент, когда содержание полимеров в растворе достигнет приблизительно 65% по массе по отношению к общей массе гемоглобина, т.е. приблизительно через 2,5 часа.

После завершения полимеризации реакцию гасят с помощью подходящего реагента. В одном аспекте реакцию полимеризации гасят добавлением водного раствора глицина. Глицин следует добавлять так быстро, насколько это возможно. Поперечные связи стабилизируют добавлением, опять же, так быстро, насколько это возможно, водного раствора боргидрида натрия. Затем данный полимеризованный раствор концентрируют и подвергают диафильтрации. Наконец, к раствору добавляют воду до получения концентрации гемоглобина 4% по массе.

В другом аспекте раствор можно подвергнуть "горячему гашению" путем нагревания при 40-50°C в течение, по меньшей мере, трех часов с одновременным добавлением глицина для завершения гашения реакции. На фиг.5 сравнивается образование тетрамера в растворе гемоглобина, обработанном сразу, и в растворе, подвергавшемся горячему гашению в течение трех часов. Оба раствора хранят при 2-8°C. Через 10 месяцев содержание тетрамера в растворе гемоглобина, обработанном сразу, находится в интервале 0,4-0,5%, тогда как в растворе, подвергавшемся горячему гашению, содержание тетрамера составляет приблизительно только 0,4%. На фиг.6 сравнивается образование тетрамера в растворе гемоглобина, обработанном сразу, и в растворе, подвергавшемся горячему гашению после хранения при 23-27°C. Предположительно стабильность раствора увеличивается после продолжительного горячего гашения, например, в течение периода не более двадцати четырех часов. Также можно использовать высокие температуры, приблизительно до 65°C.

Полимеризация в соответствии с данным изобретением позволяет получать полимеры с высоким выходом и узким диапазоном распределения по молекулярной массе, как показано на фиг.9 и описано ниже в примерах.

В другом аспекте раствор после полимеризации и гашения можно подвергнуть тепловой обработке для образования тетрамера. Тепловую обработку можно проводить через любой промежуток времени после очистки, но после нее нужно будет провести повторную очистку раствора. Тепловую обработку можно проводить путем нагревания раствора при температуре выше приблизительно 45°C в течение, по меньшей мере, приблизительно 24 часов. Если в данный момент нужно инактивировать вирусы, раствор можно нагреть до температуры выше приблизительно 60°C. Для предотвращения образования метгемоглобина в процессе тепловой обработки можно добавить антиоксидант, такой как аскорбиновая кислота.

На фиг.7 сравнивается образование тетрамера в сразу обработанном растворе гемоглобина и в растворе, предварительно обработанном в соответствии с данным изобретением. Оба раствора хранят при 2-8°C. Через 15 месяцев содержание тетрамера в растворе гемоглобина, обработанном сразу, увеличивается приблизительно до 0,5%, тогда как в предварительно обработанном растворе содержание тетрамера составляет приблизительно только 0,4%. Подобным образом на фиг.8 показано, что тетрамер образуется быстрее в сразу обработанных растворах гемоглобина, чем в предварительно обработанных растворах после хранения при 23-27°C.

Затем полимеризованный, пиридоксилированный раствор гемоглобина очищают. В одном аспекте, чтобы удалить из раствора неполимеризованный (тетрамерный) гемоглобин, очистку проводят в атмосфере кислорода, чтобы окислить раствор с использованием колоночной хроматографии, фильтрации, например фильтрации через полупроницаемую мембрану, или обоих методов. Затем очищенный полимеризованный раствор гемоглобина концентрируют до получения концентрации приблизительно 6% с помощью устройства для ультрафильтрации и получают препарат, способный осуществлять газообмен.

Затем проводят деоксигенацию концентрированного раствора, вытесняя кислород азотом. Деоксигенацию проводят приблизительно при 10-12°C, пока содержание оксигемоглобина в растворе не станет меньше, чем приблизительно 16% по массе по отношению к общей массе гемоглобина.

Затем полученный не содержащий кислорода очищенный раствор полимеризованного гемоглобина концентрируют ультрафильтрацией в атмосфере азота в охлаждаемом сосуде. pH доводят приблизительно до 8,8-9,0, и количество электролитов можно довести по необходимости до уровней, характерных для нормальной плазмы. Кроме того, можно добавить традиционные антиоксиданты, такие как глутатион, аскорбат или глюкоза. После концентрирования раствора до желательной концентрации, предпочтительно приблизительно 10% по массе по отношению к общей массе гемоглобина, раствор стерилизуют путем фильтрации и переносят с помощью устройства для стерильного переноса в подходящие фармацевтически приемлемые контейнеры.

Если раствор гемоглобина ранее не подвергался тепловой обработке, способствующей образованию тетрамера, его можно подвергнуть тепловой обработке и очистить от образовавшегося тетрамера. Если добавлялись антиоксиданты и химические реагенты композиции, их можно удалить путем диафильтрации перед тепловой обработкой и очисткой.

Кроме того, в качестве альтернативы тепловой обработке образование тетрамера в конечном растворе гемоглобина может происходить при выдерживании раствора при подходящей температуре. Затем раствор можно повторно очистить, чтобы удалить образовавшийся тетрамер. Предположительно, раствор, как правило, нужно выдерживать до получения уровней тетрамера, превышающих приблизительно 1-3%, причем более высокое содержание тетрамера обеспечивает повышенную стабильность раствора после удаления тетрамера. Однако преимущества данного изобретения предположительно реализуются, если раствор выдерживают в течение любого промежутка времени, при условии, что образовавшийся тетрамер удаляется из раствора после выдерживания.

Характеристики полученного раствора гемоглобина приведены на фиг.9 и ниже:

Общий гемоглобин (г/дл)	9,5-10,5
Метгемоглобин (% от общего Hb)	<8,0