Способ определения концентрации десквамированных эндотелиальных клеток в цельной крови

Способ определения концентрации десквамированных эндотелиальных клеток в цельной крови

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике в ревматологии.

Метод подсчета концентрации десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) в периферической крови используется в России (Петрищев Н.Н., Беркович О.А., Власов Т.Д. и др. Диагностическая ценность определения десквамированных эндотелиальных клеток в крови. // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2001, №1. - С.50-58) и за рубежом (М.Mutin, I.Canavy, A.Blann et al. Direct Evidence of Endothelial Injury in Acute Myocardial Infarction and Unstable Angina by Demonstration of Circulating Endothelial Cells // Blood. - 1999. - Vol.93(9). - P. 2951-2958) как одно из составляющих оценки эндотелиальной функции. Изменение концентрации ДЭК в периферической крови при различных заболеваниях связано с вовлечением в патологический процесс эндотелия и усилением десквамации эндотелиальных клеток в результате повреждения эндотелия (Hladovec J., Prerovsky I., Stanek V., Fabian J. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris // Klin. Wochenschr. - 1978. - Vol.56(20). - P.1033-1036; Dierk H. Endemann, Ernesto L. Schiffrin. Endothelial Dysfunction // J Am Soc Nephrol - 2004. - Vol.15. - P.1983-1992; Douglas B.Cines, Eleanor S.Pollak, Clayton A. Buck, et al., Endothelial Cells in Physiology and in the Pathophysiology of Vascular Disorders // Blood - 1998. - Vol.91(10). - P.3527-3561).

Традиционно принято определять концентрацию десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) в периферической крови по методике, предложенной в 1978 г. Hladovec J. (Hladovec J. Circulating endothelial cells as a sign of vessel wall lesions // Physiol. Bohemoslov. - 1978. - Vol.27. - P.140-144) в интерпретации (Петрищев Н.Н., Беркович О.А., Власов Т.Д. и др. Диагностическая ценность определения десквамированных эндотелиальных клеток в крови. Клин. лаб. диагност.- 2001. - №1. - С.50-52). Существующая методика предполагает определение содержания ДЭК в плазме крови и представление результатов как количество ДЭК на единицу объема плазмы, что недостаточно информативно в связи с вариабельностью содержания форменных элементов крови, различным разведением полученной концентрации ДЭК и, как следствие, несопоставимостью содержания ДЭК у больных и здоровых лиц при различном уровне гематокрита. Для получения более точных и сопоставимых результатов содержания ДЭК у здоровых лиц и пациентов с различной патологией и различным уровнем гематокрита предлагается методика, позволяющая индексировать содержание ДЭК в 1 л плазмы, определяемых по стандартным методикам, на концентрацию ДЭК в 1 л цельной периферической крови.

Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении точности определения концентрации ДЭК в цельной крови за счет введения дополнительного индекса, учитывающего уровень гематокрита и соответственно разведение полученного по стандартной методике содержания ДЭК.

Предлагается способ определения концентрации ДЭК в цельной крови, качественно дополняющий имеющуюся методику определения концентрации ДЭК в плазме.

1. Стандартным образом, согласно методике Hladovec J., 1978, готовят препараты ДЭК и определяют концентрацию ДЭК в 1 л плазмы по формуле ДЭК=0,56·N·10⁵, где N - число ДЭК в двух сетках камеры Горяева, 0,56 - коэффициент, учитывающий объем камеры и изменения объема исследуемого материала в процессе приготовления препаратов ДЭК.

2. Определяют показатель гематокрита (Ht) и долю плазмы

(P)=100%-Ht.

3. Высчитывают коэффициент индексации для перевода концентрации ДЭК в 1 л плазмы на содержание ДЭК в 1 л цельной крови (К)=Р/100%, где 100% - объем цельной крови.

4. Полученное по стандартной методике число ДЭК в 1 л плазмы умножают на коэффициент К для получения показателя концентрации ДЭК в 1 л цельной крови.

Итоговая формула: ДЭК=(0,56·N·(100-Ht)/100)·10⁵,

где ДЭК - концентрация десквамированных эндотелиальных клеток в цельной крови;

10⁵ - степень, учитывающая концентрацию ДЭК;

N - количество ДЭК, полученное при их подсчете в двух сетках камеры Горяева;

Ht - уровень гематокрита;

0,56; 100 - коэффициенты, учитывающие изменения объема исследуемого материала в процессе приготовления препаратов ДЭК и перевод значений концентрации ДЭК в 1 л плазмы на концентрацию ДЭК в 1 л крови.

Пример осуществления изобретения

Для успешного достижения конечной цели - подсчета концентрации ДЭК в 1 л цельной крови необходимо поэтапно выполнить все вышеуказанные операции, в ходе которых производится пересчет содержания ДЭК в 1 л плазмы крови на концентрацию ДЭК в 1 л цельной крови с учетом показателя гематокрита по следующей формуле:

ДЭК=(0,56·N·(100-Ht)/100)·10⁵

Клинический пример

1. Больная К., 35 лет с диагнозом "Ревматоидный артрит. Серопозитивный. Полиартрит. Активность 2. Рентгенологическая стадия 2. Функциональный класс 2. Хроническая железодефицитная анемия средней степени тяжести".

Число ДЭК в 1 л плазмы = 3,89·10⁵ клеток

Гематокрит = 31%, доля плазмы = 100-31=69%

Коэффициент индексации = 69/100=0,69

Число ДЭК в 1 л цельной крови = (3,89·0,69) клеток·10⁵ = 2,7·10⁵ клеток или ДЭК = (N·0,56·(100-Ht)/100)·10⁵=(7·0,56·(100-31)/100·10⁵=2,7·10⁵ клеток,

где 7 - число ДЭК в 2 ячейках камеры Горяева.

2. Обследуемая Н. из контрольной группы (практически здоровая женщина), 33 лет.

Число ДЭК в 1 л плазмы = 3,89·10⁵ клеток

Гематокрит = 41%, доля плазмы = 100-41=59%

Коэффициент индексации = 59/100=0,59

Число ДЭК в 1 л цельной крови = (3,89·0,59) клеток·10⁵=2,2·10⁵

клеток или ДЭК = (N·0,56·(100-Ht)/100)·10⁵=(7·0,56(100-41)/100·10⁵=2,2·10⁵ клеток,

где 7 - число ДЭК в 2 ячейках камеры Горяева.

Таким образом, при равных концентрациях ДЭК в плазме крови их содержание в цельной крови различается и позволяет иначе трактовать результаты исследования. Так, у больной с анемией число ДЭК в цельной крови выше, чем у женщины из контрольной группы, что свидетельствует о вовлечении эндотелия в патологический процесс и требует наблюдения в динамике заболевания.

Разница достаточно заметна уже при единичном исследовании и может существенно изменить средний показатель по выборке в целом.

Так, нами обследован 31 пациент с ревматоидным артритом (РА) и сопутствующей анемией и 15 практически здоровых лиц (табл.1).

У пациентов с РА содержание ДЭК в 1 л плазме составило (4,92±0,37)·10⁵ клеток и достоверно не отличалось от контрольной группы, где аналогичный показатель был равен (3,72±0,43)·10⁵ клеток (р=0,07). Однако уровень гематокрита у здоровых был достоверно выше, чем при РА с сопутствующей анемией (41,7±0,84% против 35,59±0,87% соответственно) (р=0,00000005). Это обусловило достоверную разницу показателей ДЭК в цельной крови: у пациентов с РА и анемией концентрация ДЭК в цельной крови составила (3,17±0,24)·10⁵ клеток и была достоверно выше, чем у здоровых (2,18±0,27)·10⁵ клеток (р=0,01).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять содержание ДЭК в цельной крови, что делает результат подсчета более универсальным и сопоставимым с концентрацией других клеточных элементов в крови, а также повышает точность диагностики эндотелиальной дисфункции у лиц с различным уровнем гематокрита (в том числе при анемических состояниях) у ревматологических больных, делая возможным сопоставление результатов подсчета концентрации ДЭК у больных и здоровых лиц при различном уровне гематокрита.

Таблица 1Концентрация десквамированных эндотелиоцитов в плазме и цельной крови и уровень гематокрита у больных ревматоидным артритом с сопутствующей анемией и практически здоровых лиц
№	Пациенты с РА и анемией	Здоровые лица
ДЭК пл.·105, кл/л	ДЭК ЦК·105, кл/л	Ht,%	ДЭК пл.·105, кл/л	ДЭК ЦК·105, кл/л	Ht,%
1	5,28	3,56	32,6	5	2,99	40,2
2	3,61	2,43	32,8	5,56	3,39	39,1
3	5,56	3,51	36,9	4,72	2,87	39,1
4	8,06	4,9	39,2	1,67	0,98	41,3
5	3,89	2,51	35,4	2,78	1,58	43
6	3,06	1,95	36,3	4,72	2,8	40,7
7	2,5	1,6	35,9	3,89	2,39	38,5
8	10	6,42	35,8	1,94	1,2	38,3
9	4,17	2,61	37,3	2,78	1,67	40
10	2,22	1,39	37,5	3,61	2,06	42,9
11	2,5	1,56	37,7	7,5	4,64	38,1
12	5,56	3,53	36,5	3,06	1,68	45,2
13	3,33	2,13	36,13	1,67	0,89	46,6
14	4,72	3,02	36	5	2,56	48,9
15	3,06	1,89	38,2	1,94	1,09	43,8
16	4,44	2,75	38,1
17	8,89	5,57	37,3
18	4,17	2,58	38,2
19	8,89	4,69	47,2
20	3,61	2,27	37
21	4,44	2,95	33,5
22	4,17	2,69	35,6
23	2,78	1,85	33,3
24	7,78	6,19	20,4
25	5,83	3,75	35,6
26	5,28	3,32	37,1
27	2,22	1,35	39,3
28	3,89	2,71	30,4
29	6,39	5,05	20,97
30	5,28	3,32	37,1
31	6,94	4,3	38,1
Среднее ± ошибка среднего	4,92±0,37	3,17±0,24	41,7±0,84	3,72±0,43	2,18±0,27	35,59±0,87
Медиана	4,92	3,17	35,59	3,61	2,06	40,7
Интерквартильный размах	от 3,33до 5,83	от 2,13до 3,75	от 35,4до 37,7	от 1,94до 5	от 1,2до 2,87	от 39,1до 43,8
Тест Манна-Уитни	Р=0,066	Р=0,018	Р<0,001
Примечание:PA - ревматоидный артрит;ДЭК пл.·105, кл/л - концентрация десквамированных эндотелиальных клеток в 1 л плазмы · 105;ДЭК ЦК·105, кл/л - концентрация десквамированных эндотелиальных клеток в 1 л цельной крови · 105;Ht,% - уровень гематокрита, %;Тест Манна-Уитни проводился между двумя сравниваемыми группами (пациенты с РА и анемией и здоровые лица) по соответствующим показателям (ДЭК пл.·105, кл/л;ДЭК ЦК·105, кл/л Ht, %)

Способ определения концентрации десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) в цельной крови путем исследования плазмы крови, отличающийся тем, что дополнительно производится пересчет содержания ДЭК в 1 л плазмы крови на их концентрацию в 1 л цельной крови с учетом уровня гематокрита по следующей формуле: ДЭК=(0,56·N·(100-Ht)/100)·10⁵,

где ДЭК - концентрация десквамированных эндотелиальных клеток в цельной крови;

10⁵ - степень, учитывающая концентрацию ДЭК;

N - количество ДЭК, полученное при их подсчете в двух сетках камеры Горяева;

Ht - уровень гематокрита;

0,56; 100 - коэффициенты, учитывающие изменения объема исследуемого материала в процессе приготовления препаратов ДЭК и перевод значений концентрации ДЭК в 1 л плазмы на концентрацию ДЭК в 1 л крови.