Иммуностимулирующие фосфортиоатные cpg-олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфирные связи, способ иммуномодуляции, способ стимулирования иммунного ответа

Иммуностимулирующие фосфортиоатные cpg-олигонуклеотиды, содержащие фосфодиэфирные связи, способ иммуномодуляции, способ стимулирования иммунного ответа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

В общих чертах настоящее изобретение относится к иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам, а также к иммуностимулирующим олигонуклеотидам, обладающим пониженным воспалительным действием на почки, к их композициям и к способам применения этих иммуностимулирующих нуклеиновых кислот.

Предшествующий уровень техники

Бактериальная ДНК обладает иммуностимулирующим действием, направленным на активацию В-клеток и клеток - натуральных киллеров, тогда как ДНК позвоночных не обладает подобным действием (Tokunaga Т., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga Т., et al., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina J.P., et al., 1991, J. Immunol. 147: 1759-1764; см. также обзор в работе Kreig, 1998, Applied Oligonucleotide Technology, С.А. Stein and A.M. Kreig (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp.431-448). В настоящее время известно, что эти иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК являются результатом присутствия неметилированных динуклеотидов CpG с конкретным набором оснований (мотивов CpG), которые широко представлены в бактериальных ДНК, но недостаточно представлены в ДНК позвоночных, где они являются метилированными (Krieg et ai., 1995, Nature 374:546-549; Krieg 1999, Biochim. Biophys. Acia 93321:1-10). Иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК могут быть имитированы синтетическими олигодезоксинуклеотидами (ODN), содержащими вышеупомянутые мотивы CpG. Такие CpG-ODN обладают сильным стимулирующим действием на человеческие и мышиные лейкоциты, включая пролиферацию В-клеток; секрецию цитокинов и иммуноглобулинов; цитолитическую активность природных киллеров (NK) и секрецию IFN-γ; активацию дендритных клеток (ДК) и антиген-презентирующих клеток для экспрессии ко-стимулирующих молекул и секреции цитокинов, а в частности, Th1-подобных цитокинов, которые играют важную роль в стимуляции вырабатывания Th1-подобных Т-клеточных ответов. Эти иммуностимулирующие эффекты нативной фосфодиэфирной основной цепи CpG-ODN являются в высокой степени CpG-специфическими в том смысле, что они резко снижаются в случае, когда указанный CpG-мотив является метилированным или замененным на GpC или как-либо иначе удален или модифицирован (Krieg et al., 1995, Nature 374:546-549; Hartmann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9305-10).

В ранних исследованиях было показано, что иммуностимулирующий CpG-мотив имеет формулу пурин-пурин-CpG-пиримидин-пиримидин (Krieg et al., 1995, Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996, J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998, EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Однако в настоящее время очевидно, что мышиные лимфоциты достаточно хорошо реагируют на фосфодиэфирные CpG-мотивы, которые не соответствуют этой "формуле" (Yi et al., 1998, J. Immunol. 160:5898-5906), и это справедливо для человеческих В-клеток и дендритных клеток (Hartmann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9305-10; Liang, 1996, J. Clin. Invest. 98:1119-1129).

Недавно было описано несколько различных классов нуклеиновых кислот, содержащих CpG. Один класс содержит сильные активаторы В-клеток, но относительно слабые индукторы активации IFN-α и NK-клеток, и этот класс был назван В-классом. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты класса В обычно являются полностью стабилизированными и содержат неметилированный динуклеотид CpG с определенным предпочтительным набором оснований. См. например, патенты США №№ 6194388, 6207646, 6214806, 6218371, 6239116 и 6339068. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты другого класса активируют В-клетки и NK-клетки и индуцируют IFN-α; и этот класс был назван С-классом. CpG-содержащие нуклеиновые кислоты С-класса, как было впервые определено, обычно являются полностью стабилизированными и содержат последовательность типа последовательности В-класса и GC-богатый палиндром или последовательность, близкую к палиндромной последовательности. Этот класс был описан в одновременно рассматриваемой предварительной заявке на патент США № 60/313273, поданной 17 августа 2001, и в заявке на патент США № 10/224523, поданной 19 августа 2002, а также в родственной заявке на патент РСТ, РСТ/US02/26468, опубликованной под номером Международной публикации WO 03/015711.

Краткое описание изобретения

Неожиданно было обнаружено, что иммуностимулирующие свойства CpG-содержащих нуклеиновых кислот В-класса и С-класса и других стабизизированных иммуностимулирующих нуклеиновых кислот могут быть сохранены или даже улучшены путем селективного включения одной или нескольких нестабилизированных связей между определенными нуклеотидами. Такими нестабилизированными связями предпочтительно являются природные связи, то есть фосфодиэфирные связи или фосфодиэфироподобные связи. Нестабилизированная связь обычно, но необязательно является относительно чувствительной к расщеплению нуклеазой. Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению содержат, по крайней мере, одну нестабилизированную связь, расположенную между 5'-пиримидином (Y) и смежным 3'-пурином (Z), а предпочтительно гуанином (G), где и 5'Y, и 3'Z являются внутренними нуклеотидами.

Подобно полностью стабилизированным иммуностимулирующим нуклеиновым кислотам иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть использованы для индуцирования Th1-подобного иммунного ответа. В соответствии с этим иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве адъювантов для вакцинации, и они могут быть также использованы для лечения заболеваний, включая злокачественную опухоль, инфекционное заболевание, аллергию и астму. Очевидно, что эти нуклеиновые кислоты могут быть особенно эффективными для лечения любых состояний, которые требуют продолжительного или многократного введения иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты независимо от цели ее введения.

Несмотря на то что полностью стабилизированные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты предназначены для многоцелевого применения, однако в некоторых вариантах иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению в отличие от вышеуказанных полностью стабилизированных иммуностимулирующих нуклеиновых кислот имеют такие преимущества, как повышенная эффективность и пониженная токсичность.

Настоящее изобретение относится частично к иммуностимулирующим CpG-содержащим олигонуклеотидам. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему формулу: 5'T*C*G*T*CGTTTTGAN₁CGN₂*T*T3' (SEQ ID NO:296). В олигонуклеотиде N₁ состоит из 0-6 нуклеотидов, а в N₂ состоит из 0-7 нуклеотидов. Символ * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи. Межнуклеотидные связи, не отмеченные звездочкой *, могут быть нестабилизированными или стабилизированными, при условии что данный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, 2 фосфодиэфирных межнуклеотидных связи. Стабилизированная межнуклеотидная связь может быть фосфортиоатной связью. В некоторых вариантах N₁ состоит из 0-2 нуклеотидов. Этот олигонуклеотид имеет длину предпочтительно в 16-24 нуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

Символ _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.

Предпочтительным олигонуклеотидом является:

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, содержащему 5'T*C*G*(T*/A*)TN₃CGTTTTN₄CGN₅*T*T3' (SEQ ID NO:301). N₃ состоит из 0-4 нуклеотидов. N₄ состоит из 1-5 нуклеотидов. N₅ состоит из 0-7 нуклеотидов. Символ * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи. Межнуклеотидные связи, не отмеченные звездочкой *, могут быть нестабилизированными или стабилизированными, при условии что данный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, 2 фосфодиэфирных межнуклеотидных связи. Стабилизированная межнуклеотидная связь может быть фосфортиоатной связью. В некоторых вариантах, N₄ состоит из 1-2 нуклеотидов. Предпочтительным олигонуклеотидом является олигонуклеотид длиной 16-24 нуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

Предпочтительным олигонуклеотидом является:

В соответствии с другими своими аспектами настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду: 5'T*C*G*T*C*GNNNCGNCGNNNC*G*N*C*G*T*T3' (SEQ ID NO:306). N представляет собой любой нуклеотид. Символ * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи. Межнуклеотидные связи, не отмеченные звездочкой *, могут быть нестабилизированными или стабилизированными, при условии что данный олигонуклеотид содержит, по крайней мере, 3 фосфодиэфирных межнуклеотидных связи. Стабилизированная межнуклеотидная связь может быть фосфортиоатной связью. В некоторых вариантах олигонуклеотид содержит 5 фосфодиэфирных межнуклеотидных связей. Предпочтительный олигонуклеотид имеет длину в 16-24 нуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

В одном из вариантов олигонуклеотид представляет собой: 5'T*C*G*T*C*G*T*T*A*C_G_T_C_G_T*T*A*C*G*Т*C*G*T*T3' (SEQ ID NO:310). Символ _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.

В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид содержит, по крайней мере, один мотив С_G с фосфодиэфирной межнуклеотидной связью. В еще одном варианте осуществления изобретения данный олигонуклеотид не содержит каких-либо мотивов С_G с фосфодиэфирной межнуклеотидной связью.

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему структуру 5'T*C_G(N₆C_GN₇)_2-3T*С_G*T*T3' (SEQ ID NO:311-312). N₆ и N₇, независимо, имеют длину 1-5 нуклеотидов, а олигонуклеотид имеет длину в 16-40 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения N₆ представляет собой один нуклеотид, например, N₆ может представлять собой Т или А. В некоторых вариантах изобретения N₇ представляет собой пять нуклеотидов, например, N₇ может представлять собой пять пиримидинов или TTTTG.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет структуру:

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему структуру 5'T*CGCGN₈CGCGC*GN₉3' (SEQ ID NO:315). N₈ имеет длину 4-10 нуклеотидов и содержит, по крайней мере, 1 мотив С_G. N₉ имеет длину 0-3 нуклеотида. Олигонуклеотид имеет длину 15-40 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения N₈ содержит, по крайней мере, 2 или 3 мотива CG. В других вариантах осуществления изобретения N₈ представляет собой PuCGPyPyCG или PuCGPyPyCGCG. N₈ необязательно представляет собой ACGTTCG. N₉ может содержать, по крайней мере, один мотив CG, такой как CCG.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет структуру:

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, имеющему формулу: 5'T*T*GX₁X₂TGX₃X₄T*T*T*T*N₁₀T*T*T*T*T*T*T3' (SEQ ID NO:318). N₁₀ имеет длину 4-8 нуклеотидов и содержит, по крайней мере, 1 мотив С_G. Х₁, Х₂, Х₃ и Х₄ независимо представляют собой С или G. Олигонуклеотид имеет длину 24-40 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения N₁₀ содержит, по крайней мере, 2 или 3 мотива CG. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид имеет одну из нижеследующих структур:

В других вариантах олигонуклеотид имеет структуру: 5'T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G3' (SEQ ID NO:321).

В некоторых аспектах по настоящему изобретению ODN представляет собой олигонуклеотид, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, включающему октамерную последовательность, содержащую, по крайней мере, один динуклеотид YZ, имеющий фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, и, по крайней мере, 4 нуклеотида Т, где Y представляет собой пиримидин или модифицированный пиримидин, а Z представляет собой гуанозин или модифицированный гуанозин и где олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную межнуклеотидную связь.

Y может представлять собой неметилированный С. Z может представлять собой гуанозин. В некоторых вариантах осуществления изобретения Y представляет собой цитозин или модифицированные цитозиновые основания, выбранные из группы, состоящей из 5-метилцитозина, 5-метилизоцитозина, 5-гидроксицитозина, 5-галогеноцитозина, урацила, N4-этилцитозина, 5-фторурацила и водорода. В других вариантах осуществления изобретения Z представляет собой гуанин или модифицированное гуаниновое основание, выбранное из группы, состоящей из 7-деазагуанина, 7-деаза-7-замещенного гуанина (такого как 7-деаза-7-(С2-С6)алкинилгуанин), 7-деаза-8-замещенного гуанина, гипоксантина, 2,6-диаминопурина, 2-аминопурина, пурина, 8-замещенного гуанина, такого как 8-гидроксигуанин и 6-тиогуанин, 2-аминопурина и водорода.

В некоторых вариантах осуществления изобретения октамерная последовательность содержит мотив ТТТТ. В других вариантах осуществления изобретения октамерная последовательность содержит два динуклеотида YZ. Оба динуклеотида YZ, но необязательно, имеют фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения октамерная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

где * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи и где _ означает присутствие фосфодиэфирной межнуклеотидной связи.

В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид имеет длину 8-40 нуклеотидов.

Фосфодиэфироподобная связь может представлять собой боранфосфонат или диастереомерно чистый фосфортиоат Rp. Стабилизированными межнуклеотидными связями являются, но необязательно, фосфортиоатная, фосфордитиоатная, метилфосфонатная, метилфосфортиоатная или любая их комбинация.

Олигонуклеотид может иметь 3'-3'-связь с одним или двумя доступными 5'-концами. В некоторых предпочтительных вариантах олигонуклеотид имеет два доступных 5'-конца, каждым из которых является 5'TCG.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, содержащему: 5'TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT3' (SEQ ID NO:368). По крайней мере, один динуклеотид CG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, а олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную межнуклеотидную связь.

В других своих аспектах настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, содержащему 5'GNC3', где N представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 4-10 нуклеотидов; которая, по крайней мере, на 50% состоит из Т и не содержит динуклеотид CG, а олигонуклеотид содержит, по крайней мере, одну стабилизированную межнуклеотидную связь. В одном из вариантов осуществления изобретения N содержит мотив ТТТТ. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из G*T*T*T*T*G*T*C и G*T*T*T*T*G*А*C, где * означает присутствие стабилизированной межнуклеотидной связи.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, имеющей, по крайней мере, один внутренний динуклеотид "пиримидин-пурин" (YZ) и необязательно динуклеотид "пиримидин-гуанозин" (YG), и химерная основная цепь, где, по крайней мере, один внутренний динуклеотид YZ имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, где каждый дополнительный внутренний динуклеотид YZ имеет, но необязательно, фосфодиэфирную, фосфодиэфироподобную или стабилизированную межнуклеотидную связь и где все остальные межнуклеотидные связи являются стабилизированными. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит множество внутренних динуклеотидов YZ, каждый из которых имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь. В одном из вариантов осуществления изобретения каждый внутренний динуклеотид YZ имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, _ означает фосфодиэфир, U означает 2'-дезоксиурацил, а 7 означает 7-деазагуанин.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, содержащей химерную основную цепь и, по крайней мере, одну последовательность N₁YGN₂, где в каждой последовательности N₁YGN₂ YG независимо представляет собой внутренний динуклеотид "пиримидин-гуанозин" (YG), N₁ и N₂ независимо представляют собой любой нуклеотид и где, по крайней мере, в одной последовательности N₁YGN₂ и необязательно в каждой дополнительной последовательности N₁YGN₂: динуклеотид YG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, при этом N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, а G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид, либо N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, а G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид, где все остальные межнуклеотидные связи являются стабилизированными.

В одном из вариантов осуществления изобретения иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит множество последовательностей N₁YGN₂, где в каждой последовательности N₁YGN₂: динуклеотид YG имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, при этом N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, а G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид, либо N₁ и Y связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₁ представляет собой внутренний нуклеотид, а G и N₂ связаны фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью, если N₂ представляет собой внутренний нуклеотид.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:

где * означает фосфортиоат, а _ означает фосфодиэфир.

В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG, имеющим фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, является CG. В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG, имеющим фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, является TG.

В одном из вариантов осуществления изобретения фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является фосфодиэфир. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфодиэфироподобной связью является боранфосфонат или диастереомерно чистый фосфортиоат Rp.

В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизированные межнуклеотидные связи выбраны из группы, состоящей из фосфортиоатной, фосфордитиоатной, метилфосфонатной, метилфосфортиоатной и любой их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизированными межнуклеотидными связями является фосфортиоатная связь.

В одном из вариантов осуществления изобретения иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты является молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты В-класса. В одном из вариантов осуществления изобретения указанной иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты является молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты С-класса.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 4-100 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 6-40 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 6-19 нуклеотидов.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты не является антисмысловым олигонуклеотидом; олигонуклеотидом, образующим тройную спираль; или рибозимом.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который содержит:

N₁-C_G-N₂-C_G-N₃

где каждый из N₁ и N₃ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 1-20 нуклеотидов и где _ означает внутреннюю фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, N₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-20 нуклеотидов, а G-N₂-С содержит 1 или 2 стабилизированных связи.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который содержит:

N₁-C_G-N₂-C_G-N₃

где каждый из N₁ и N₃ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 1-20 нуклеотидов и где _ означает внутреннюю фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь, N₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 4-20 нуклеотидов, а G-N₂-С содержит, по крайней мере, 5 стабилизированных связей.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который содержит:

N₁-C_G-N₂-C_G-N₃

где каждый из N₁, N₂ и N₃ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-20 нуклеотидов, где _ означает внутреннюю фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь и где указанный олигонуклеотид не является антисмысловым олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, образующим тройную спираль, или рибозимом.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, который содержит:

Х₁-N₁-(GTCGTT)_n-N₂-Х₂ (SEQ ID NO:18-20 и 57)

где каждый из N₁ и N₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты длиной 0-20 нуклеотидов, где n=2 или n=4-6, а каждый из Х₁ и Х₂ независимо представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую фосфортиоатные межнуклеотидные связи и имеющую длину 3-10 нуклеотидов; и где N₁-(GTCGTT)_n-N₂ содержит, по крайней мере, одну фосфодиэфирную межнуклеотидную связь, а 3'- и 5'-нуклеотиды указанного олигонуклеотида не содержат поли-G-, поли-А-, поли-Т-, или поли-С-последовательности.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная нуклеиновая кислота имеет основную цепь, содержащую дезоксирибозу или рибозу.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный олигонуклеотид имеет основную цепь, содержащую дезоксирибозу или рибозу.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный олигонуклеотид находится в фармацевтической композиции, необязательно содержащей фармацевтически приемлемый носитель.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный олигонуклеотид, кроме того, содержит адъювант или цитокин.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный олигонуклеотид, кроме того, содержит антиген, где указанным олигонуклеотидом является вакцина-адъювант.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный антиген выбран из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, грибкового антигена, паразитарного антигена и опухолевого антигена. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный антиген кодируется векторной нуклеиновой кислотой. В одном из вариантов осуществления изобретения указанным антигеном является пептидный антиген. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный антиген ковалентно связан с олигонуклеотидом или с иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления изобретения указанный антиген не является ковалентно связанным с олигонуклеотидом или с иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации относительной эффективности или токсичности тестируемой иммуностимулирующей молекулы нуклеиновой кислоты. Указанный способ предусматривает отбор известной иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, имеющей известную последовательность, стабилизированную основную цепь и обладающей известной иммуностимулирующей активностью или токсичностью; отбор тестируемой иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, имеющей известную последовательность, фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную связь вместо стабилизированной связи между Y и N, по крайней мере, одного внутреннего динуклеотида YN в известной последовательности, где Y представляет собой пиримидин, а N представляет собой любой нуклеотид, и обладающей тестируемой иммуностимулирующей активностью или токсичностью; и сравнение тестируемой иммуностимулирующей активности или токсичности с известной иммуностимулирующей активностью или токсичностью для идентификации относительной активности или токсичности тестируемой иммуностимулирующей молекулы нуклеиновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления изобретения тестируемая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота является более сильным индуктором активности, направленной на передачу TLR9-сигнала, чем известная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления изобретения тестируемая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота является более сильным индуктором интерферона типа 1, чем известная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления изобретения тестируемая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота является более сильным индуктором IP-10, чем известная иммуностимулирующая нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов осуществления изобретения YN представляет собой YG. В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG является CG. В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG является TG.

В одном из вариантов осуществления изобретения тестируемая иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит множество внутренних динуклеотидов YG, каждый из которых имеет фосфодиэфирную или фосфодиэфироподобную межнуклеотидную связь. В одном из вариантов осуществления изобретения, по крайней мере, одним внутренним динуклеотидом YG является каждый внутренний динуклеотид YG.

В одном из вариантов осуществления изобретения фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной межнуклеотидной связью является фосфодиэфир. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфодиэфироподобной связью является боранфосфонат или диастереомерно чистый фосфортиоат Rp.

В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизированные межнуклеотидные связи выбраны из группы, состоящей из фосфортиоатной, фосфордитиоатной, метилфосфонатной, метилфосфортиоатной и любой их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизированная основная цепь содержит множество фосфортиоатных межнуклеотидных связей.

В одном из вариантов осуществления изобретения известной иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты является молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты В-класса. В одном из вариантов осуществления изобретения известной иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты является молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты С-класса.

В одном из вариантов осуществления изобретения известная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 4-100 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления изобретения известная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 6-40 нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления изобретения известная молекула иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты имеет длину 6-19 нуклеотидов.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу конструирования стабилизированной иммуностимулирующей молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей длину менее чем 20 нуклеотидов. Указанный способ предусматривает отбор последовательности длиной 6-19 нуклеотидов, где указанная последовательность содержит, по крайней мере, один внутренний динуклеотид CG; отбор фосфодиэфирной или фосфодиэфироподобной связи между С и G, по крайней мере, одного внутреннего динуклеотида CG; независимый отбор фосфодиэфирной, фосфодиэфироподобной или стабилизированной связи между С и G каждого присоединенного внутреннего динуклеотида CG; и отбор стабилизированной связи для всех других межнуклеотидных связей.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики аллергии или астмы. Указанный способ осуществляют путем введения субъекту описанного здесь иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в количестве, эффективном для лечения или профилактики аллергии или астмы. В одном из вариантов осуществления изобретения олигонуклеотид доставляют к поверхности слизистой. В других вариантах осуществления изобретения указанный олигонуклеотид вводят в виде аэрозольной композиции. Указанный олигонуклеотид может быть введен интраназально.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу индукции продуцирования цитокинов. Указанный способ осуществляют путем введения субъекту описанного здесь иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в количестве, эффективном для индуцирования цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, хемокинов и IFN-γ.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей описанные здесь иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды в комбинации с антигеном или с другим терапевтическим соединением, таким как противомикробный агент. Указанным противомикробным агентом может быть, например, противовирусный агент, противопаразитарный агент, антибактериальный агент или противогрибковый агент.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, изготовленной в форме препарата пролонгировнного действия, содержащего описанные здесь иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды.

Указанная композиция может, но необязательно, содержать фармацевтический носитель, и/или она может быть приготовлена в виде препарата для доставки. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат для доставки выбран из группы, состоящей из катионных липидов; белков, проникающих в клетку, и препаратов пролонгированного действия. В одном из вариантов осуществления изобретения препарат пролонгированного действия представляет собой биологически разлагаемый полимер или микрочастицу.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа. Этот способ предусматривает введение субъекту иммуностимулирующего CpG-олигонуклеотида в количестве, эффективном для индуцирования у данного субъекта иммунного ответа. Иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид предпочтительно вводят перорально, местно, в виде препарата пролонгированного действия, через слизистую, системно, парентерально или внутримышечно. Если иммуностимулирующий CpG-олигонуклеотид вводят на поверхность слизистой, то он может быть доставлен в количестве, эффективном для индуцирования иммунного ответа в слизистой или системного иммунного ответа. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения поверхность слизистой выбрана из группы, состоящей из поверхности полости рта, носа, прямой кишки, влагалища и глаза.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ предусматривает введение субъекту антигена, где продуцируемый иммунный ответ является ангиген-специфическим иммунным ответом. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный антиген выбран из группы, состоящей из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена, паразитарного антигена и пептидного антигена.

Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут обладать способностью стимулировать иммунные ответы широкого спектра. Так, например, эти иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть использованы для переориентации иммунного Th2-ответа на иммунный Th1-ответ. Иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть также использованы для активации иммунных клеток, таких как лимфоцит (например, В- и Т-клетки), дендритная клетка и NK-клетка. Такая активация может быть осуществлена in vivo, in vitro или ex vivo, то есть путем выделения иммунной клетки у субъекта, контактирования указанной иммунной клетки с иммуностимулирующим CpG-олигонуклеотидом в количестве, эффективном для активации иммунной клетки, и последующего введения активированной иммунной клетки указанному субъекту. В некоторых вариантах осуществления изобретения дендритная клетка представляет раковый антиген. Указанная дендритная клетка может быть подвергнута воздействию ракового антигена ex vivo.

Иммунный ответ, продуцируемый иммуностимулирующими CpG-олигонуклеотидами, может также приводить к индукции продуцирования цитокинов, например, продуцирования IL-6, IL-8, IL-12, IL-16, TNF, IFN-α, хемокинов и IFN-γ.

В еще одном варианте осуществления изобретения иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды могут быть использованы для лечения злокачественной опухоли. В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения иммуностимулирующие CpG-олигонуклеотиды также могут быть использованы для профилактики злокачественной опухоли (например, уменьшения риска развития злокачественной опухоли) у субъекта с риском разви