Флуоресцирующие белки и хромопротеины из видов hydrozoa, не относящихся к aequorea, и способы их получения

Флуоресцирующие белки и хромопротеины из видов hydrozoa, не относящихся к aequorea, и способы их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Это изобретение относится в основном к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на флуоресцирующие белки.

Уровень техники

Введение меток в белки, клетки или организмы, представляющие интерес, играет важную роль во многих биохимических, молекулярных биологических и медицинских диагностических применениях. Множество различных меток было разработано и использовалось в данной области, включая мечение радиоизотопами, красителями, флуоресцирующими метками, хемилюминесцентными метками и т.п., с различными свойствами и оптимальными применениями. Однако существует постоянный интерес в разработке новых меток. Особым интересом является разработка новых белковых меток, включая флуоресцирующие белковые метки.

Зеленый флуоресцирующий белок (GFP), его мутанты и гомологи, широко известные сегодня вследствие их интенсивного использования как флуоресцирующие маркеры in vivo в биомедицине, рассмотрены подробно Lippincott-Schwartz и Patterson в Science (2003) 300 (5616):87-91). GFP из гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria), обнаруженный Johnson et ai. в J Cell Comp Physiol. (1962), 60:85-104, был обнаружен как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играл роль вторичного источника, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет. Затем сходные белки были выделены из нескольких биолюминесцентных кишечнополостных, включая гидроидную медузу Phialidium gregarium, морских перьев Renilla (класс Anthozoa) и других (см. Ward et al. in Photochem. Photobiol. (1982), 35: 803-808; Levine et al. in Comp. Biochem. Physiol. (1982), 72B: 77-85; Chalfie in Photochem. Photobiol. (1995), 62:651-656). Все эти белки демонстрируют зеленую фуюоресценцию, (излучение при 497-509 нм) и действовали как вторичные источники в биолюминесценции. Флуоресцирующие белки были также выделены из видов Physalia и их N-концевые аминокислотные последовательности были определены. (WO 03/017937).

кДНК, кодирующая GFP A. victoria, была клонирована Prasher et al. (Gene (1992), 111(2):229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP самостоятельно образовывать флуорофор (Chalfie et al., Gene (1992), 111(2):229-233). Эти сведения открывают широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологии в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.

GFP широко использовался в различных областях применений, включая изучение экспрессии гена и локализации белка (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, и Heim et al. in Proc. Nat Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), как средство для того, чтобы визуализировать внутриклеточное распределение органелл в клетках (Rizzuto et al, Curr. Biology (1995), 5: 635-642), для визуализации белкового переноса по секреторному пути (Kaether and Gerdes, FEES Letters (1995), 369: 267-271).

Проводились многие исследования для улучшения свойств GFP и для производства GFP-реактивов, пригодных и оптимизированных для ряда исследовательских целей. Были разработаны новые варианты GFP, такие как ДНК "гуманизированного" GFP, белковый продукт которой имеет повышенный синтез в клетках млекопитающих (Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Один такой гуманизированный белок представляет собой "усиленный зеленый флуоресцирующий белок" (EGFP). Другие мутации к GFP привели к вариантам, излучающим сине-, сине-зеленый и желто-зеленый свет. Однако несмотря на большую полезность GFP, другие флуоресцирующие белки со свойствами, сходными или отличными от GFP, были бы полезны в данной области. В частности, преимущества от новых флуоресцирующих белков включают возможности флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), возможности которого основаны на новых спектрах и лучшей пригодности при широком спектре возбуждения. В 1999 году гомологи GFP были клонированы из небиолюминесцентных видов Anthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Это открытие показало, что эти белки не являются необходимыми компонентами биолюминисцентного механизма. Извлеченные из Anthozoa GFP-сходые белки показали большое спектральное разнообразие, включая сине-зеленые, зеленые, желтые, красные флуоресцирующие белки и фиолетово-синие нефлуоресцирующие хромопротеины (CPs) (Matz et al., Bioessays (2002), 24(10):953-959).

Главный недостаток извлеченных из Anthozoa GFP-сходых белков представляет собой сильную олигомеризацию, которая препятствует использованию этих белков во многих применениях (Lauf et al., FEBS Lett. (2001), 498: 11-15; Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002), 99: 7877-7882; Mizuno et al., Biochemistry (2001), 40: 2502-2510). Соответственно, целью является обеспечение новых мономерных флуоресцирующих белков различных цветов, так же, как и ДНК, кодирующих их, которые не имеют недостатков известного GFP.

Вид Hydrozoa представляет собой потенциальный источник таких белков. Кроме GFP из Aequorea victoria и гомологов GFP из других видов Aequorea, подобно очень близким гомологам GFP из Aequorea macrodactyla (GenBank, инвентарные номера AF435427-AF435433) и Aequorea coerulescens (Gurskaya et al., Biochem J. (2003), 373(Pt 2): 403-408), никакие другие гены, кодирующие флуоресцирующие белки из Hydrozoa, до настоящего времени не клонировались, хотя некоторые из них были охарактеризованы на белковом уровне очень давно. Клонирование и мутагенез флуоресцирующих белков из других источников, не относящихся к Aequorea Hydrozoa, представляет собой перспективный способ получения новых флуоресцирующих меток с улучшенными свойствами.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих флуоресцирующие или хромобелки и их мутанты, и их производные. Указанная нуклеиновая кислота может быть выделена, синтезирована или присутствовать в своей искусственной среде.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота настоящего изобретения выделена из вида, не относящегося к Aequorea Hydrozoa, включая Phialidium sp. и двух флуоресцирующих медуз или гидроидной медузы 1 и 2 (гидромедузы 1 и 2) подотряда Anthomedusae, или мутантов или их производных.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует белок, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует гомолог, мутант, производное соединение, миметик или фрагмент указанного белка.

В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21 или которая является гомологичной, по существу такой же, или идентичной к указанным. Последовательности нуклеиновой кислоты, которые отличаются от представленных последовательностей нуклеиновой кислоты, вследствие вырожденности генетического кода или гибридизуемые с ними, также входят в рамки настоящего изобретения.

В других воплощениях изобретение направлено на белки, которые кодируются заявленными нуклеиновыми кислотами или по существу сходными с ними, или гомологами, производными или их мутантами, или направлено на слитые белки, включающие белки настоящего изобретения.

Также обеспечиваются фрагменты нуклеиновых кислот настоящего изобретения и нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в условиях высокой жесткости с нуклеиновыми кислотами настоящего изобретения.

В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке.

В еще одном воплощении обеспечиваются способы получения хромогенного и/или флуоресцентного белка, включающие экспрессию белка в соответствующей клетке-хозяине и выделение из нее белка. Указанный способ включает (а) обеспечение молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, кодирующей флуоресцентный или хромо-белок, соединенной с соответствующими последовательностями, регулирующими экспрессию, (b) экспрессию белка из указанной молекулы нуклеиновой кислоты, и (с) выделение белка, по существу свободного от других белков.

Кроме того, обеспечиваются антитела, специфические к белкам настоящего изобретения или их фрагментам.

Дополнительно, обеспечиваются клетки-хозяева, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, содержащие нуклеиновые кислоты, векторы или кассеты экспрессии настоящего изобретения.

В еще одном воплощении обеспечиваются олигонуклеотиды или зонды, включающие нуклеотидные последовательности, способные к гибридизации с заявленными нуклеиновыми кислотами.

Также обеспечиваются способы, в которых используется хромо- или флуоресцирующий белок настоящего изобретения или кодирующая его нуклеиновая кислота.

В предпочтительном воплощении обеспечивается способ введения меток в биологическую молекулу, где указанный способ включает связывание указанной биологической молекулы с белком настоящего изобретения.

В другом предпочтительном воплощении обеспечивается способ введения меток в клетку, где указанный способ включает продуцирование белка настоящего изобретения в клетке.

В другом предпочтительном воплощении обеспечивается способ введения меток в органеллу клетки, где указанный способ включает получение белка настоящего изобретения, слитого с подходящим внутриклеточным сигналом локализации в клетке.

В еще одном предпочтительном воплощении обеспечивается способ анализа биологической молекулы, клетки или органеллы клетки, где указанный способ включает обнаружение флуоресцирующего сигнала от белка настоящего изобретения.

В еще одном предпочтительном воплощении обеспечивается способ анализа биологической молекулы, клетки или органеллы клетки, где указанный способ включает экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в клетке.

Дополнительно обеспечиваются наборы, включающие нуклеиновые кислоты или векторы или кассеты экспрессии, содержащие в себе указанные нуклеиновые кислоты, или белок настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг.1 проиллюстрировано выравнивание GFP, phiYFP, hydr1GFP и hm2CP аминокислотных последовательностей. Введенные разрывы показаны точками. Остатки, идентичные соответствующим аминокислотам в GFP, представлены штриховыми линиями.

Фиг.2 показывает спектры возбуждения (пунктирная линия) и излучения (сплошная линия) для дикого типа phiYFP (A) и его мутантов: phiYFP-Y1 (B), phiYFP-M0 (C), и phiYFP-М1 (D).

Фиг.3 показывает спектры возбуждения-излучения для белков phiYFP-M1G1 (A) и phiYFP-M1C1 (B).

Фиг.4 представляет зарисовку гидромедузы 1 (A) и гидромедузы 2 (B) подотряда Anthomedusae.

Фиг.5 показывает спектры возбуждения-излучения для дикого типа hydr1GFP.

Фиг.6 показывает спектр поглощения для дикого типа hm2CP.

Фиг.7 показывает спектры возбуждения-излучения для дикого типа hm2CP.

Фиг.8 показывает спектры возбуждения-излучения для красного флуоресцирующего мутанта S3-2 белка hm2CP.

Подробное описание изобретения

Как здесь используется, термин "флуоресцирующий белок" или "флуоропротеин" означает белок, который является флуоресцирующим; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флюоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство этих белков представляет собой такое свойство, которое является результатом взаимодействия двух или более аминокислотных остатков белка, а не одного аминокислотного остатка. Также флуоресцирующие белки настоящего изобретения не включают белки, которые проявляют флюоресценцию только от остатков, которые флуоресцируют сами как внутренние флуорофоры, то есть триптофан, тирозин и фенилаланин.

Как здесь используется, термин "хромопротеин" или "хромогенный белок" означает цветной белок, который может быть флуоресцирующим, слабо- или нефлуоресцирующим. Как здесь используется, термины "хромопротеин" и "флуоресцирующий белок" не включают люциферазы, такие как люцифераза Renilla.

Как здесь используется, термин "GFP" относится к зеленому флуоресцирующему белку из Aequorea victoria, включая варианты GFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей флюоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа GFP была раскрыта в Prasher et al., Gene 111 (1992), 229-33.

Как здесь используется, термин "EGFP" относится к мутантному варианту GFP, имеющего две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664).

Как здесь используется, термин "выделенный" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.

Как здесь используется, термин "фрагмент" предназначен, чтобы, включить, например, альтернативно сплайсированную или усеченную, или иначе расщепленную молекулу нуклеиновой кислоты или белка.

Как здесь используется, термин "производное" относится к мутанту или измененной за счет РНК, или химически модифицированной или иначе измененной молекуле нуклеиновой кислоты или к мутанту, или химически модифицированному или иначе измененному белку.

Как здесь используется, термин "мутант" относится к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или C-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения.

Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.

Как здесь используется, "гомолог или гомология" являются термином, использованным в данной области для описания связанности нуклеотида или пептидной последовательности с другим нуклеотидом или пептидной последовательностью, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.

Если подвести итог вышеуказанному, настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие флуоресцирующие и хромобелки и мутанты, варианты и их производные, так же, как белки и пептиды, кодируемые этими нуклеиновыми кислотами. Молекулы нуклеиновой кислоты и белки, представляющие интерес, выделены из вида, не относящегося к Aequorea Hydrozoa. Целевые белки, представляющие интерес, включают желтый флуоресцирующий белок, phiYFP, из Phialidium sp., зеленый флуоресцирующий белок hydr1GFP из гидроидной медузы 1 (гидромедуза 1) подотряда Anthomedusae, и фиолетового хромопротеина, hm2CP из гидроидной медузы 2 (гидромедуза 2) подотряда Anthomedusae. Также белками, представляющими интерес, являются те, которые по существу являются сходными или производными, или гомологами, или мутантами вышеупомянутых специфических белков. Также обеспечиваются фрагменты нуклеиновых кислот и пептиды, кодируемые ими, так же, как и антитела, специфические к белкам и пептидам изобретения. Кроме того, обеспечиваются клетки-хозяева, стабильные клеточные линии и трансгенные организмы, включающие вышеупомянутые молекулы нуклеиновой кислоты. Заявленные композиции белка и нуклеиновых кислот находят использование в ряде различных применений и способов, в частности, для применения при мечении белков. В итоге, обеспечиваются наборы для использования в таких способах и применениях.

Молекулы нуклеиновой кислоты

Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие флуоресцирующие/хромобелки из вида Hydrozoa, отличного от рода Aequorea, производные, мутанты и гомологи этих белков, так же, как их фрагменты. Молекула нуклеиновой кислоты, как здесь используется, представляет собой молекулы ДНК, такие как геномные молекулы ДНК или молекулы кДНК, или РНК молекулы, такие как молекулы мРНК. В частности, указанные молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой молекулы кДНК, имеющие открытую рамку считывания, которая кодирует хромо/флуоресцирующий белок изобретения из Hydrozoa или его фрагмент и способна, при подходящих условиях, к тому, чтобы обеспечить экспрессию как флуоресцирующего/хромобелка или белкового фрагмента (пептида) по изобретению.

Изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, которые являются гомологичными, по существу сходными, идентичными, производными или миметиками нуклеиновых кислот, кодирующих белки или белковые фрагменты настоящего изобретения. Заявленные нуклеиновые кислоты присутствуют в среде, отличной от их естественной среды; например, они выделены, присутствуют в обогащенных количествах, или присутствуют или экспрессированы in vitro или в клетке, или в организме, другом чем их естественно встречающаяся среда окружения.

Специфические молекулы нуклеиновой кислоты, представляющие интерес, представляют собой такие молекулы, которые кодируют следующие хромо/флуоропротеины из Hydrozoa (и их гомологи/производные/мутанты): желтый флуоресцирующий белок, phiYFP из Phialidium sp., зеленый флуоресцирующий белок, hydr1GFP из гидроидной медузы 1 из подотряда Anthomedusae, и фиолетовый хромопротеин, hm2CP из гидроидной медузы 2 из подотряда Anthomedusae. Каждый из этих специфических типов молекул нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, теперь индивидуально раскрывается более детально.

phiYFP

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие флуоресцирующие/хромопротеины могут быть выделены из организма класса Hydrozoa, предпочтительно отряда Hydroida, более предпочтительно подотряда Leptomedusae, более предпочтительно из семейства Campanulariidae, и даже более предпочтительно из рода Phialidium. В особенно предпочтительном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, выделенная из Phialidiumsp., кодирует специфический белок, называемый PhiYFP. Гомологи/мутанты/производные этого белка, такие как phiYFP-Y1, phiYFP-М1, phiYFP-M0, phiYFP-M1G1 (то есть phiYFP-G1 или phiGFPl), и phiYFP-MlCl (то есть phiYFP-G1 или phiGFP1), описанные ниже более детально в экспериментальной части, также представляющие интерес. Выведенная кодирующая последовательность кДНК дикого типа для PhiYFP, показана на SEQ ID NO: 01.

hydr1GFP

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие ф флуоресцирующие/хромопротеины могут быть выделены из организма класса Hydrozoa, предпочтительно отряда Hydroida, более предпочтительно подотряда Anthomedusae. Специфический белок, кодируемый такой молекулой нуклеиновой кислоты, называют hydr1GFP (то есть anmGFP1). Гомологи/мутанты/производные этого белка также представляют интерес. Выведенная последовательность кодирующая кДНК дикого типа для hydr1GFP, показана на SEQ ID NO: 11.

hm2CP

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие флуоресцирующие/хромопротеины могут быть выделены из организма класса Hydrozoa, предпочтительно отряда Hydroida, более предпочтительно подотряда Anthomedusae. Специфический белок, кодируемый такой молекулой нуклеиновой кислоты, называют hm2CP (то есть anm2CP). Гомологи/мутанты этого белка, такие как S3-2 красный флуоресцирующий мутант hm2CP, описанный ниже более детально в экспериментальной части, также представляющий интерес. Выведенная последовательность кодирующая кДНК дикого типа для hm2CP, показана на SEQ ID NO: 13.

Гомологи вышеописанных молекул нуклеиновой кислоты также являются объектом интереса. Источник гомологичных нуклеиновых кислот может быть любым видом растения или животного или последовательность, может быть полностью или частично синтетическим, включая миметики нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота настоящего изобретения имеет идентичность последовательности с соответствующими гомологами на нуклеотидных или аминокислотных уровнях по меньшей мере приблизительно 40% и, предпочтительно приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или больше, включая 75%, 80%, 85%, 90% и 95% или больше. Референсная последовательность обычно будет по меньшей мере размером приблизительно в 60 нуклеотидов, чаще по меньшей мере размером приблизительно в 80 нуклеотидов, и может простираться на полную последовательность, с которой сравнивается. Идентичность последовательности рассчитывается исходя из референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp. 403-10 (1990) (например, с использованием установок по умолчанию, то есть, с параметрами w=4 и T=17).

Гомологи идентифицируются любыми из множества способов. Фрагмент кДНК настоящего изобретения может использоваться как гибридизационный зонд против библиотеки кДНК от целевого организма, с использованием условий низкой жесткости. Зонд может быть большим фрагментом или одним или более коротким вырожденным праймером. Нуклеиновые кислоты, имеющие сходство последовательности, детектируются гибридизацией в условиях низкой жесткости, например, при 50°С и 6×SSC (0,9М хлористого натрия /0,09М цитрата натрия) с последующей промывкой при 55×С в 1×SSC (01,15М хлористого натрия/0,015 М цитрата натрия). Идентичность последовательности может быть определена гибридизацией в условиях высокой жесткости, например, при 50°С или выше и 0,1×SSC (15 мМ хлористого натрия/ 1,5 мМ цитрата натрия). Нуклеиновые кислоты, имеющие область, по существу идентичную представленным последовательностям, например аллельным вариантам, генетически-измененным вариантам нуклеиновой кислоты, и т.д., связываются с представленными последовательностями в условиях высокой жесткости гибридизации. С использованием зондов, в частности меченых зондов последовательностей ДНК, можно выделить гомологичные или схожие гены.

Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с вышеописанными нуклеиновыми кислотами в жестких условиях, предпочтительно в условиях высокой жесткости (то есть, комплементарные предварительно описанным нуклеиновым кислотам). Примером гибридизации в жестких условиях является при 50°С или выше и 0,1×SSC (15 мМ хлористого натрия/ 1,5 мМ цитрата натрия). Другим примером гибридизации в условиях высокой жесткости является инкубация в течение ночи при 42°С в 50% растворе формамида, 5×SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрий цитрат), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5 × раствора Денхардта, 10% сульфата декстрана, и 20 мкг/мл денатурированной, разрезанной ДНК семенной жидкости лосося, с предварительной промывкой в 0,1×SSC при приблизительно 65°С. Другие условия высокой жесткости гибридизации известны в данной области и могут также использоваться для определения нуклеиновых кислот изобретения.

Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты, мутанты или производные белков изобретения. Мутанты или производные могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см. например Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; and Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp.15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР, перестановку, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный ensemble мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, неспецифический мутагенез, генное реассемблирование, генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственное реассемблирование с лигацией (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены способом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил-содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез с искусственными генами, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации. В некоторых воплощениях флуоресцирующие белки, кодируемые мутантом или производными нуклеиновых кислот, имеют те же самые флуоресцентные свойства как флуоресцирующий белок дикого типа. В других воплощениях мутант или производные нуклеиновых кислот кодируют флуоресцирующие белки с измененными спектральными свойствами, как здесь описано более подробно для мутантов phiYFP-Y1, phiYFP-М1, phiYFP-M1G1, phiYFP-M1С1, S3-2.

Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют белки настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении, кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах в клетке-хозяине, заменены кодонами, которые излишне представлены в кодирующих последовательностях в генах в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту. Особенным интересом является гуманизированные версии нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "гуманизированный" относится к заменам, сделанным в последовательности нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов для экспрессии белка в клетках млекопитающих (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). См. также Патент США № 5795737, который описывает гуманизацию белков, раскрытие которого здесь включено ссылкой.

Термин "кДНК", как здесь используется, предназначен для включения нуклеиновых кислот, которые отражают расположение элементов последовательности, находящихся в нативной зрелой разновидности мРНК, где элементы последовательности представляют собой экзоны и 5-' и 3'-некодирующие области. Обычно разновидность мРНК имеет смежные экзоны, с промежуточными интронами, которые, если присутствуют, удаляются ядерным РНК сплайсингом, чтобы создавать непрерывное кодирование белка открытой рамки считывания.

Геномная последовательность, представляющая интерес, может включать нуклеиновую кислоту, присутствующую между инициирующим кодоном и терминирующим кодоном, как определено в перечисленных последовательностях, включая все интроны, которые обычно присутствуют в нативной хромосоме. Геномная последовательность, представляющая интерес, дополнительно может включать 5'- и 3'-нетранслируемые области, находящиеся в зрелой мРНК, так же как специфические транскрипционные и трансляционные регулирующие последовательности, такие как промоторы, энхансеры, и т.д., включающие фланкирующую геномную ДНК размером приблизительно 1 т.п.н., но возможно и больше, у 5'- или 3'-конца транскрибированной области.

Молекулы нуклеиновой кислоты изобретения могут кодировать весь или часть заявленных белков. Двух- и одноцепочечные фрагменты могут быть получены из последовательности ДНК путем химического синтеза олигонуклеотидов в соответствии со стандартными способами, рестрикционной ферментной дигестией, амплификацией ПЦР и т.д. В основном, фрагменты ДНК будут иметь размер по меньшей мере приблизительно 15 нуклеотидов, обычно по меньшей мере приблизительно 18 нуклеотидов или приблизительно 25 нуклеотидов и могут быть по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов. В некоторых воплощениях заявленные молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь размер приблизительно 100, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700 нуклеотидов или более. Заявленные нуклеиновые кислоты могут кодировать фрагменты заявленных белков или полных белков; например, заявленные нуклеиновые кислоты могут кодировать полипептиды приблизительно из 25 аминокислот, приблизительно из 50, приблизительно из 75, приблизительно из 100, приблизительно из 125, приблизительно из 150, приблизительно из 200 аминокислот вплоть до полной длины белка.

Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются по меньшей мере приблизительно на 50% чистыми, обычно по меньшей мере приблизительно на 90% чистыми и являются обычно "рекомбинантными", то есть фланкированы одним или более нуклеотидов, с которыми она обычно не связывается в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.

Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, например, имеющие последовательность SEQ ID NO: 01, 03, 05, 07, 09, 11, 13, 15, 17, 19 или 21, соответствующие кДНК, гены полной длины и конструкции, могут быть получены искусственно в соответствии со множеством различных методик, известных специалистам в данной области. Подходящие конструкции нуклеиновой кислоты очищаются, с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и согласно инструкциям, описанным, например, в United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research.

Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют слитые белки, включающие белок настоящего изобретения, или их фрагменты, которые ниже рассматриваются более детально.

Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Соответствующие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д., последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области, и много таких векторов доступны коммерчески. Для приготовления конструкции частичная нуклеиновая кислота или полной длины обычно вставляются в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляются лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.

Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных хромогенных или флуоресцирующих белков или их белков-вставок или для снятия реплики заявленных молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. Для экспрессии генный продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжи, насекомое, амфибию или млекопитающее. В векторе экспрессии указанная нуклеиновая кислота является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включить промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. Способы получения кассеты экспрессии или систем, способных к экспрессии желательного продукта, известны специалистом, квалифицированным в данной области.

Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, котрансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным определение и выделение транфицированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).

Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клети высшего организма, такого как позвоночные, например COS 7 клетки, HEK 293, CHO, ооциты Xenopus и т.д.

Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.

Также представляют интерес промоторные последовательности геномных последовательностей настоящего изобретения, где последовательность 5'-концевых участков может использоваться для промоторных элементов, включая энхансерные связывающие сайты, которые, например, обеспечивают регуляцию экспрессии в клетках/тканях, где экспрессирован ген заявленных белков.

Также обеспечиваются малые фрагменты ДНК заявленных нуклеиновых кислот, которые применяются как праймеры для ПЦР, гибридизации скрининговых проб и т.д. Большие фрагменты ДНК применяются для получения кодируемых полипептидов, как ранее описано. Однако для использования в геометрических реакциях амплификации, таких как геометрическая ПЦР, используется пара малых фрагментов ДНК, то есть праймеров. Точная композиция последовательностей праймера не является критической для изобретения, но для большинства применений праймеры будут гибридизоваться с заявленной последовательностью в жестких условиях, как известно в данной области. Предпочтительно выбрать пару праймеров, которые дадут продукт амплификации по меньшей мере приблизительно из 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 100 нуклеотидов и могут простираться на полную последовательность нуклеиновой кислоты. Алгоритмы отбора последовательностей праймера обычно известны, и доступны в коммерческих пакетах программ. Праймеры амплификации гибридизуются с комплементарными цепочками ДНК и будут примировать навстречу друг к другу.

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также могут применяться для определения экспрессии гена в биологическом образце. Метод, в котором исследуются клетки на наличие специфических последовательностей нуклеотида, таких как геномная ДНК или РНК, хорошо отработан в данной области. Кратко, ДНК или мРНК выделяются из образца клетки. мРНК может быть амплифицирована ОТ-ПЦР с использованием обратной транскриптазы для формирования комплементарной цепочки ДНК, с предварительной полимеразной цепной реакцией амплификации, с использованием праймеров, специфических для заявленных последовательностей ДНК. Альтернативно, образец мРНК отделяется гель-электрофорезом, переносится на подходящий носитель, например нитроцеллюлозу, нейлон и т.д., и затем зондируется фрагментом заявленной ДНК в качестве зонда. Могут также использоваться другие способы, такие как анализы сшивания олигонуклеотида, гибридизация in situ и гибридизация ДНК-зондами, прикрепленными на твердый чип. Обнаружение мРНК, гибридизованной с заявленной последовательностью, показательно из экспрессии гена в образце.

Заявленные нуклеиновые кислоты, включая фланкирующие участки промотора и кодирующих участков, могут мутироваться различными способами, известными в данной области для получения целенаправленных изменений в силе промотора или изменить последовательность кодируемого белка или свойства кодируемого белка, включая флуоресцентные свойства кодируемого белка.

Во многих воплощениях нуклеиновые кислоты, найденные в виде Aequorea, не включены в объем изобретения. В некоторых воплощениях, гомолог GFP и нуклеиновые кислоты, кодирующие его, из Aequorea victoria, Aequorea macrodactyla, и Aequorea coeridscens не включены в объем заявленного изобретения.

Белки

Также обеспечиваются в соответствии с заявленным изобретением хромо- и флуоресцирующие белки из других видов, не относящихся к Aequorea Hydrozoa, и их мутанты, включая белки полной длины, так же, как их части или фрагменты. Также обеспечиваются вариации встреч