Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных

Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к иммунодиагностике опасного антропозооноза - трихинеллеза, и может быть использовано для прижизненной диагностики данного заболевания у плотоядных (кошек, собак) и всеядных животных (свиней).

Трихинеллез относится к числу распространенных и тяжело протекающих гельминтозов человека и животных. По характеру эпидемических вспышек, по массовости и внезапности трихинеллез напоминает многие инфекционные заболевания, а по злокачественности и смертности в случае интенсивного заражения не имеет себе равных [5].

Трихинеллам свойственна высокая патогенность, хорошая выживаемость, большая плодовитость, широкий круг хозяев, прохождение цикла развития в одном организме в независимости от внешних факторов окружающей среды. Взаимная циркуляция возбудителя трихинеллеза между природными и синантропными очагами поддерживается определенными пищевыми связями: в результате поедания слабых зверей более сильными, а также через падаль. Из дикой природы через тушки отстрелянных на охоте хищников, а также грызунами, бродячими собаками, кошками, свиньями, трихинеллез переносится в населенные пункты, где и поддерживается среди домашних животных на протяжении многих лет [3, 6].

Анализ эпизоотологической и эпидемической обстановки по трихинеллезу в Российской Федерации свидетельствует о все возрастающей роли диких промысловых животных в распространении этой инвазии и вспышках трихинеллеза среди населения [4, 7].

Ежегодно в Российской Федерации регистрируется до 700 случаев заболевания этим опасным гельминтозом людей, причем в 40% они носят групповой характер. В большинстве случаев данное заболевание было вызвано употреблением свинины. Способы кормления и содержания свиней в теплый период года на свободном выпасе, местные обычаи населения благоприятствуют очаговому распространению данной инвазии в синантропном очаге, в связи с чем в последние годы участились крупномасштабные вспышки трихинеллеза среди людей [5-7].

Своевременная диагностика, основанная только на клинической картине заболевания, не всегда объективна, хотя именно раннее обнаружение трихинеллеза позволяет назначить эффективное терапевтическое лечение. В связи с этим практическое здравоохранение и ветеринария остро нуждаются в иммунодиагностических тест-системах, позволяющих выявлять специфические антитела в крови инвазированных животных и людей. Разработка эффективной прижизненной диагностики трихинеллеза свиней является ведущим фактором обеспечения санитарного качества мясных продуктов, экономической рентабельности свиноводства, гарантией предупреждения вспышек трихинеллеза среди населения и, в конечном счете, способствует искоренению данного гельминтоза.

Для прижизненной диагностики трихинеллеза домашних плотоядных животных (кошек, собак) коммерческие тест-системы не разработаны не только в РФ, но и в зарубежных странах. В связи с этим практическая ветеринарная медицина остро нуждается в эффективных иммунодиагностических тест-системах, позволяющих выявлять специфические антитела в сыворотке крови спонтанно инвазированных плотоядных и всеядных животных, особенно в синантропных очагах трихинеллеза. Прижизненная иммунологическая диагностика тканевого гельминтоза - трихинеллеза - позволит сохранить жизнь многим кошкам и собакам, обитающим при свиноводческих фермах, поскольку в случае вспышки трихинеллеза в первую очередь уничтожению подлежали все плотоядные животные данного хозяйства.

Цель изобретения состоит в создании технологии производства диагностически эффективной коммерческой тест-системы (ИФТС) на основе иммуноферментного метода для определения специфических антител в сыворотке крови у зараженных трихинеллезом плотоядных(кошек, собак) и всеядных (свиней) животных к антигенам Т.spiralis на всех стадиях развития инвазии, включая раннюю (острую фазу).

Сущность изобретения - разработка и внедрение в ветеринарную практику эффективного способа прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных на основе коммерческой иммуноферментной тест-системы «ИФА-ВИГИС-БИОТЕХ- T.spiralis-стрип».

Наиболее близким прототипом предложенной инновации можно считать эффективные отечественные коммерческие тест-системы для иммунологической диагностики трихинеллеза у человека: иммуноферментная (производства ЗАО «Вектор-Бест, г. Новосибирск) и на основе реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), производства Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (5,8).

Иммунологической диагностикой трихинеллеза свиней в РФ занимались Белозеров С.Н. (испытал реакцию непрямой иммунофлуоресценции РНИФ и ИФР, используя в качестве антигена лиофилизированных личинок трихинелл и некоторые фракции соматического экстракта); Написанова Л.А., Бережко В.К.. Шеховцов Н.В. (использовали в качестве антигена для dot-ELISA и ELISA фракционированный соматический экстракт и продукты метаболизма личинок трихинелл без определения молекулярной массы и степени иммуногенности используемых антигенов, подбирая экспериментальным путем удовлетворительные по специфичности и чувствительности фракции), Сапунов А.Я. (разработал внутрикожную аллергопробу на трихинеллез) (патент на изобретение №2210985 от 27.08.2003 г.) [1, 2, 4, 7, 8].

Недостатками прототипов ветеринарного направления являются: недостаточная чувствительность тестов в период острой фазы трихинеллеза, выявляющих иммунные комплексы только на 19-21 дни инвазии [1, 4], использование лиофилизированного дорогостоящего коммерческого антивидового конъюгата, содержащего иммуноглобулины только одного класса IgG. Отсутствие возможности сохранения контрольных сывороток и конъюгата ИФТС в активном состоянии без лиофильного высушивания на протяжении срока использования существенно увеличивало временные трудозатраты сотрудников на проведение анализа и удорожало стоимость каждой реакции. Разработчики иммуноферментной реакции ELISA для диагностики трихинеллеза свиней использовали в составе трехкомпонентной субстратной смеси вещество ортофенилендиамин (прототипы [1, 4]), что запрещено Министерством Здравоохранения РФ с 2004 г. ввиду канцерогенности данного реактива для персонала лабораторий.

Известны зарубежные исследования по созданию эффективных диагностических тест-систем на основе иммуноферментного анализа как для научных работ, так и для коммерческих целей. Авторы использовали моноклональные антитела, очищенные антигены строго определенной молекулярной массы и конъюгат к иммуноглобулинам одного класса -IgG [9-14].

Ценность изобретения состоит в использовании антивидовых поликлональных конъюгатов собственного приготовления, состоящих из иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе организма зараженного трихинеллезом животного, в применении высокоактивных и специфичных антигенов T.spiralis молекулярной массой 29-63 кД (предыдущий патент авторов №2005105086/13), что в итоге позволяет выявлять специфические иммунные комплексы на всех стадиях болезни, в том числе и в период острой фазы трихинеллеза, на 7-10 дни инвазии. Все параметры ИФТС разработаны с учетом свойств используемых антигенов, сорбированных на твердой фазе (полистироловых микропанелях отечественного производства), что позволяет при исследованиях сывороток крови различных видов плотоядных и всеядных животных использовать стандартный набор реагентов, комплектуя наборы соответствующим антивидовым конъюгатом. Данная инновация существенно расширяет ассортимент выпускаемых ИФТС для прижизненной диагностики трихинеллеза животных и понижает их себестоимость.

Наша работа отличается тем, что:

1. Впервые для нужд ветеринарии РФ разработана технология производства коммерческой ИФТС для прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных.

2. В качестве антигенов для сенсибилизации твердой фазы (полистироловых микропанелей отечественного производства) применены высокоактивные и специфичные антигены T.spiralis молекулярной массой 29-63 кД (предыдущий патент авторов №2005105086/13),

3. В ИФТС используются поликлональные антивидовые конъюгаты собственного приготовления, состоящие из иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе организма зараженного трихинеллезом животного, что в итоге позволяет выявлять специфические иммунные комплексы на всех стадиях болезни, в том числе и в период острой фазы трихинеллеза, на 7-10 дни инвазии.

4. В состав ИФТС введены оригинальные составы реагентов и буферных растворов, что позволило снимать неспецифическое ковалентное и ионное связывание отечественного полистирола с иммуноглобулинами испытуемых сывороток крови плотоядных и всеядных животных, а также существенно снизило стоимость наборов за счет отказа от использования полистироловых микропанелей фирмы Costar, США.

5. Все реагенты представленной тест-системы выпускаются в жидком виде, сохраняют активность в пределах гарантийного срока использования, некоторые компоненты (например, хромогенный субстрат, ТМБ и пероксид водорода), объединены в одном растворе. Это упрощает проведение и сокращает время, затрачиваемое на иммуноферментный анализ.

6. Все параметры ИФТС разработаны с учетом свойств используемых антигенов, сорбированных на твердой фазе (полистироловых микропанелях - стрипах отечественного производства), что позволяет при исследованиях сывороток крови различных видов плотоядных и всеядных животных использовать стандартный набор реагентов, комплектуя наборы соответствующим антивидовым конъюгатом и контрольными сыворотками. Данная инновация существенно расширяет ассортимент выпускаемых ИФТС для прижизненной диагностики трихинеллеза животных и понижает их себестоимость.

Способ прижизненной диагностики трихинеллеза у плотоядных (кошек, собак) и всеядных (свиней) животных включает следующие этапы:

1. Взятие крови у животных, получение и сохранение диагностических сывороток.

2. Технологию производства компонентов ИФТС « ВИГИС-БИОТЕХ-T.spiralis-стрип»

3. Рекомендации по применению ИФТС «ВИГИС-БИОТЕХ-T.spiralis-стрип», примеры конкретного исполнения.

1. Взятие крови у животных, получение и сохранение диагностических сывороток.

Пробы крови отбирают в стерильные сухие пробирки в объеме не менее 1,5-2 мл от каждого животного и помещают в термостат (37°С) на 1 час. Образовавшийся сгусток крови обводят стерильной металлической спицей или стеклянной палочкой и помещают в холодильник (+4°С) на 1-2 часа для отстаивания сыворотки. Пробы сывороток отбирают в пробирки типа «Эппендорф», маркируют и сохраняют в холодильнике при +4-8°С не более 3-х суток до проведения анализа. При наличии осадка эритроцитов сыворотку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут.

2. Технология производства компонентов ИФТС «ВИГИС-БИОТЕХ-T.spiralis-стрип».

2.1. Изготовление специфических реагентов набора: антигена, антивидовых поликлональных конъюгатов, положительных и отрицательных контрольных сывороток плотоядных и всеядных животных.

2.1.1. Получение специфического антигена - иммуногенных петидов трихинелл молекулярной массой 63-29 - кД подробно изложено в предыдущем патенте авторов «Способ получения иммуногенного антигена Trishinella spiralis» (установлен приоритет от 25.02.2005).

Для наработки биомассы трихинелл проводили заражение лабораторных животных (белых крыс и кроликов) инвазионными личинками в дозе 10 лич./грамм живого веса. Через 50-60 дней проводили убой, отделяли мышечную ткань и переваривали ее в искусственном желудочном соке при температуре 38,5-39°С. Выделенных личинок многократно отмывали в физиологическом растворе с антибиотиками и помещали в ИПС ДМЕМ с глутамином. Инкубацию личинок проводили до 5 суток в термостате при температуре 38,5°С с ежедневным отбором экскреторно-секреторных продуктов. Оставшуюся биомассу личинок гомогенизировали, проводили 18-часовую экстракцию и использовали для получения второй белковой фракции при хроматографическом разделении на сефадексе G-100. Белковые продукты очищали центрифугированием при 20000 g, подвергали диализу и концентрировали ПЭГ 6000. Концентрацию белка измеряли по Лоури при длине волны 280 нм. Конечная концентрация белка в антигене T.spiralis составляла от 750 до 800 мкг/мл. Проведенные исследования показали, что полное насыщение твердой фазы (микропанелей из полистирола, производства ГОСНИИПОЛИМЕР, г.Москва) происходит при концентрации антигена трихинелл от 3,5 до 5 мкг/мл. Дальнейшее увеличение дозы антигена к существенному повышению оптической плотности продукта ИФР не приводит.

Для получения активной твердой фазы проводили сенсибилизацию в течение 18 часов при 4°С, по окончании удаляли содержимое лунок, после чего 3-5 раз промывали их 250 мкл ФСБ-Т.

2.1.2. Получение контрольных положительных и отрицательных сывороток крови плотоядных и всеядных животных.

Положительные контрольные сыворотки крови получали от иммунизированных полным соматическим экстрактом и экспериментально зараженных трихинеллезом животных. Динамику титров специфических антител определяли ИФМ, сыворотки отбирали по п.1, для увеличения срока хранения в них добавляли тиомерсал до 0,001% по объему. При комплектовании наборов ИФТС контрольную положительную сыворотку определенного вида животного разводили в соотношении 1:100 реагентом «Иммуностаб» производства ЗАО НВО «Иммунотех», г.Москва, при этом титр специфических антител в ИФА поддерживался на уровне не менее 1:800.

Отрицательные контрольные сыворотки получали от клинически здоровых животных, проверяли в ИФА, далее по п.1, 2.1.2. При отработке параметров ИФА отрицательную сыворотку исследовали в тех же разведениях, что и положительную, для сопоставления показателей оптической плотности, причем все сыворотки начинали титровать с разведения 1:100.

2.1.3. Получение поликлональных антивидовых конъюгатов.

Для получения общеглобулиновой фракции собирали сыворотки крови в количестве не менее 20-25 проб от животных одного вида различных половозрастных групп, свободных от гельминтов и инфекционных болезней. Аликвоты всех проб помещали в общую пробирку, смешивали на вортексе и постепенно добавляли пересыщенный раствор сульфата аммония до 50% концентрации. После инкубации при 4-6°С в течение 12 часов иммуноглобулины осаждали центрифугированием при 15 тыс./об/мин (40 минут). Антитела конъюгировали с модифицированным перийодатом натрия ферментом (пероксидазой хрена) по методу Wilson M.P., NakaneR.K., 1978.

Контроль активности и специфичности антивидового конъюгата определяли прямым твердофазным ИФА путем титрования на полистироловых микропанелях. Иммуноглобулины в предварительно подобранной концентрации (в 0,01М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5) сорбировали на твердой фазе в течение 18 часов при +4°С. Свободные участки пластика блокировали, внося по 200 мкл 0,05% инертного белка. Для титрования антивидового конъюгата готовили двукратные разведения на ФСБ начиная от 1:100 и до 1:25600, ИФА осуществляли по стандартной схеме. По изменению окраски проводили визуальный учет реакции, принимая за титр конъюгата его наибольшее разведение, дающее темно-желтое окрашивание в лунках. Специфичность полученного антивидового конъюгата определяли при испытании гетерологичных сывороток крови (т.е. принадлежавшим животным других видов) тем же способом. Каждая партия синтезированного антивидового конъюгата тестировалась на специфичность и активность, после чего определялось рабочее разведение этого реагента (для плотоядных - 1:6000, для свиней - 1:4000).

2.2. Приготовление неспецифических реагентов набора: фосфатно-солевого буфера, разводящих буферных растворов для сывороток и конъюгата., субстратного раствора на основе ТМБ, стоп-реагента.

2.2.1. Фосфатно-солевой буферный раствор (0,01М ФСБ-Т, рН 7,4) используется для приготовления отмывающей жидкости, а также как компонент разводящих растворов для сывороток и конъюгата. Состоит из калия фосфорнокислого однозамещенного (0,01 М), хлористого калия (0,01 М), калия фосфорнокислого двухзамещенного (0,15 М), хлористого натрия (0,18 М) и твин-20 (0,5%).

2.2.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБРС) представляет собой ФСБ, в котором увеличено содержание хлористого натрия до 0,36 М, и добавлены БСА (бычий сывороточный альбумин - 0,5%), твин-20 (до 1%) и тиомерсал натрия (0,005%).

2.2.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) имеет тот же состав, что и РБРС, (п.2.2.2.), но количество БСА увеличено до 1,5% и твин-20 до 1,5%. Повышенное содержание хлористого натрия, инертного белка (альбумина) и твин-20 блокирует неспецифическое связывание полистирола твердой фазы с антителами испытуемых сывороток.

2.2.4. Однокомпонентный готовый к использованию субстратный раствор на основе ТМБ (ТУ 9398-01/в-11361534-2004) представляет собой стабилизирующий буфер, содержащий 3,3'5,5'-тетраметилбензидин и пероксид водорода. Коммерческий препарат, выпускается ЗАО НВО «Иммунотех», г.Москва, предназначен для ИФА. В процессе реакции, катализируемой пероксидазой, происходит окисление ТМБ пероксидом водорода в продукт, имеющий синюю окраску, которая переходит в желтую при остановке ферментативной реакции добавлением стоп-реагента.

2.2.4. Останавливающий ферментативную реакцию раствор (стоп-реагент) - 0,5 М серная кислота, вносится в количестве 100 мкл в лунку. После добавления стоп-реагента в течение 15 минут проводили учет результатов реакции.

Результаты ИФА оценивали на спектрофотометре 340/АТС фирмы STL-Labsistems (Австрия) с автоматическим ридером и вертикальным лучом света при длине волны 450 нм (ОП 450).

В приложениях (№1, 2, 3,) «Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза (собак, кошек или свиней) в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опыта» подробно описана методика проведения исследования сывороток крови вышеуказанных видов животных для выявления специфических антител к T.spiralis.

Примеры конкретного исполнения:

Пример 1

В этом эксперименте проводили исследование диагностической эффективности ИФТС с сыворотками крови 96 свиней, включая положительный и отрицательный контроли.

Результаты представлены в таблице 1.

№ п/п	Сыворотки крови свиней:	Кол-во проб	Результаты ИФА
Положит. реакция	Отрицат. реакция	Чувствительность	Специфичность
1.	Иммунизированных экстрактом и зараженных личинками трихинелл, в том числе положительный контроль.	9	8	1	88,9,%
3.	Зараженных гетерологичными гельминтозами:	12	6	9		81,6%
эхинококкозом	16	9	11
аскариозом	3	-	3
цистицеркозом тениукольным эзофагостомозом	2	-	2
4.	Клинически здоровых, агельминтозных (в том числе 2 отриц. контроля)	52	1	46

Пример 2.

В данном эксперименте определяли диагностическую эффективность ИФТС с сыворотками крови 48 домашних кошек различных половозрастных групп, собранных в ветеринарных клиниках г.Москвы. В ветеринарные клиники владельцы этих кошек обращались по поводу различных заболеваний внутренних органов неинфекционной природы. В качестве положительных проб использовались сыворотки крови 6 кошек, содержащихся в виварии ВИГИС и иммунизированных антигеном трихинелл с последующим экспериментальным заражением трихинеллезом.

Таблица 2
№ п/п	Сыворотки кошек	Кол-во проб	Результаты ИФА
Положит. реакция	Отрицат. реакция	Чувствительность	Специфичность
1.	Иммунизированных антигеном или зараженных трихинеллезом	6	6	-	100%
2.	Больных внутренними незаразными болезнями	42	7	35		83,3%

Пример 3.

Диагностическую эффективность ИФТС определяли с 48 сыворотками крови собак, собранных в ветеринарных клиниках г.Москвы. Согласно анамнезу животные были клинически здоровы, дегельминтизированы или же страдали неинфекционными заболеваниями. В качестве положительных проб использовались сыворотки крови 2-х иммунизированных экскреторно-секреторными антигенами трихинелл собак и 3-х экспериментально зараженных T.spiralis собак, содержащихся в виварии Государственного Университета Республики Ингушетия, г.Назрань.

№ п/п	Сыворотки крови собак		Результаты ИФА
Положит. реакция	Отрицат. реакция	Чувствительность	Специфичность
1.	Иммунизированных антигенами или зараженных Т.spiralis	5	5	-	100%
2.	Клинически здоровых или больных незаразными болезнями (в том числе 2 отриц. контроля)	43	4	39		90,6%

Источники информации

1. Белозеров С.Н., Гуданавичюс Т.И. Реакция энзим-меченых антител для диагностики трихинеллеза // Ветеринария. - 1982. - 11. - С.41-44.

2. Васерин Ю.И. Иммунодиагностика трихинеллеза человека// Восьмая Всерос. конф. по трихинеллезу. Тез. Докл. - М. - 2000. - С.16-22.

3. Нагорный С.А., Твердохлебова Т.И., Попов М.А. Особенности эпизоотологии и эпидемиологии трихинеллеза на Северном Кавказе, роль диких животных в поддержании синантропных очагов заболевания // Восьмая Всерос. конф. по трихинеллезу. Тез. Докл. - М. - 2000. - С.122-124.

4. Написанова Л.А. ELISA и dot-ELISA в динамике экспериментального трихинеллеза свиней // Материалы докладов к 7-й научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных. - М. - 1996. - С.48-49.

5. Полетаева О.Г., Красовская Н.Н., Глаголева В.А. Характеристика иммуноферментной тест-системы с антигенами трихинелл // Мед. паразитология и паразитарные болезни. - 1986. - 3. - С.51-56.

6. Попов М.А., Васерин Ю.И., Нагорный С.А., Твердохлебова Т.И Диагностика трихинеллеза на Северном Кавказе // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - М. - 2002. - С.246-247.

7. Пшеничный А.А., Сапунов В.А. Новый и необычный источник заражения людей трихинеллезом в Краснодарском крае. // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - М. - 2002. - С.287-290.

8. Твердохлебова Т.И., Васерин Ю.И. Получение диагностикума трихинеллезного антигенного эритроцитарного сухого для РНГА и оценка его эффективности. // Мед. Паразитология и паразитарные болезни. - М. - 2005. - №2. - С.29-32.

9. Gamble H.R., Andersom W.R., Graham., Murrel K.D. Diagnosis of swine trichinosis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using excretory-secretory antigen // Veterinary Parasitology. - 1983. - 13. - 349-361.

10. Gamble H.R., Murrell K.D., Marti Ph. Inoculation of pigs against T.spiralis using excretory-secretory antigens // Amer. J. Vet. Res. - 1986. - 47. - 11. - P.2396-23989.

11. Gamble H.R. Detection of trichinellosis in pigs by artificial digestion and enzyme immunoassay // J. of Food Protection. - 1995. - 58(3). - P.295-298.

12. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell K.D. Evaluation of excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis // Veterinary Parasitoligy. - 1988. - 30. - P.131-134.

13. Gamble H.R., Wisnewski N., Wassom D. Detection of trichinellosis enzyme immunoassay using a synthetic glycan antigen // American Journal of Veterinary. - 1997. - 58. - P.417-421.

14. Gamble H.R., Rapic D., Murinculic A., Murrell K.D. Factors influencing the excretory-secretory antigens in the serodiagnosis of swine trichinellosis // Consejo Superior de Investigaciones Press Madrid Spain. - 1989. - P.202-209.

Приложение 1.

Инструкция по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза свиней в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опыта

Тест-система «ВИГИС - Биотех - T.spiralis-стрип» представляет собой набор реагентов для выявления антител сыворотки крови к антигенам трихинелл.

Активными компонентами тест-системы являются антигены трихинелл, иммобилизованные в лунках стрипов; поликлональный конъюгат антител против иммуноглобулинов свиньи с ферментом пероксидазой, контрольные положительный и отрицательный образцы.

Способ выявления антител к антигенам трихинелл представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сыворотки крови с иммобилизованными в лунках антигенами гельминта происходит связывание специфических антител и образование комплекса «антиген- антитело» на поверхности лунок. После удаления не связавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки стрипов конъюгата против иммуноглобулинов свиньи с пероксидазой происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате состоявшейся в лунках ферментативной реакции с субстратным раствором, содержащем хромоген (ТМБ) и катализатор - пероксид водорода, образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски этого продукта пропорциональна концентрации антител к антигенам трихинелл в анализируемом образце сыворотки.

Компоненты, входящие в набор для диагностики трихинеллеза, предназначены для выявления антител к антигенам T.spiralis в сыворотке крови свиней иммуноферментным методом.

- 2. Набор с увеличенным объемом компонентов расчитан на исследование 192 (96×2) проб, включая положительные и отрицательные контрольные образцы, и содержит следующие реагенты:

- 2.1. Иммуносорбент - 2 полистироловых 96-луночных разборных планшета с сорбированным экскреторно-секреторным антигеном трихинелл, лунки стрипов прозрачные, бесцветные.

- 2.2. Положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови свиней, содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.

- 2.3. Отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови свиней, не содержащая антитела к Т.spiralis, инактивированная, жидкая, светло-соломенного цвета.

- 2.4. Конъюгат антивидовой - 10-кратный концентрат диагностических антител против иммуноглобулинов свиньи, ковалентно связанных с ферментом-пероксидазой хрена в стабилизирующем растворе, жидкий, прозрачный, желтоватого цвета.

- 2.5. Фосфатно-солевой буфер с твином - 20 (ФСБ-Т, 25-кратный концентрат), жидкий, прозрачный, бесцветный.

- 2.6. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость.

- 2.7. Разводящий буферный раствор для разведения сывороток (РБС) - прозрачная жидкость светло-соломенного цвета.

- 2.8. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ (тетраметилбензидином) и пероксидом водорода, готовый к употреблению, бесцветная прозрачная жидкость.

- 2.8. Стоп-реагент - серная кислота к концентрации 0,5 М для остановки ферментативной реакции, прозрачная бесцветная жидкость.

Иммунобиологические свойства.

Тест-система выявляет специфические антитела ко всем основным иммуногенным антигенам Т.spiralis молекулярной массой 63-29 кД в сыворотке крови свиней.

Назначение.

Тест-система предназначена для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе для сероэпизоотлогического моноторинга регионов РФ на свиноводческих комплексах, а также для научных исследований при экспериментальном трихинеллезе.

Меры безопасности.

Несмотря на то что данная тест-система является полностью биологически безопасной, необходимо соблюдать следующие правила: не пипетировать растворы ртом, работать в резиновых перчатках. Твердые отходы (использованные планшеты, наконечники к дозаторам, флаконы из-под реагентов) обеззараживают погружением в 6% раствор пероксида водорода с 0,5% CMC или 3% раствор хлорамина Б. Длительность дезактивации не менее 1 часа. Жидкие отходы (промывные воды) обезвреживают в емкости для инфицированного материала добавлением сухого хлорамина из расчета 200 г/л (длительность дезактивации 1 час) или кипячением в течение 30 минут. Инструменты и оборудование до и после работы протирают 2 раза 70% этиловым спиртом.

Способ применения:

1. Приготовление реагентов для ИФА.

Перед началом работы необходимо все реагенты выдержать 30 минут при температуре от 20 до 24°С.

Все растворы необходимо отбирать новыми наконечниками или стерильными пипетками.

Для проведения ИФА дополнительно потребуются следующие материалы: дистиллированная вода, этиловый спирт, пероксид водорода, резиновые перчатки, стеклянные или полипропиленовые пробирки, автоматические пипетки и наконечники к ним.

1.1. Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т.

При наличии во флаконе с ФСБ-Т визуально определяемого осадка солей флакон с концентратом выдержать при температуре 37°С до полного растворения солей.

Содержимое флакона ФСБ-Т перенести в мерный цилиндр вместимостью 1 литр и довести объем раствора до 650 мл дистиллированной водой.

Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т в течение срока годности набора, приготовленный рабочий раствор - не более 3-х суток при температуре от 2 до 8°С.

1.2. Разводящий буферный раствор для титрования сывороток (РБС) - готов к употреблению.

1.3. Раствор для разведения конъюгата (РРК) - 2-кратный концентрат, перед проведением реакции в зависимости от количества используемых стрипов разводят 1:1 рабочим раствором ФСБ-Т

Для 12 стрипов (полный планшет) к 6 мл РРК добавить 6 мл ФСБ-Т, перемешать. Полученный раствор хранить при температуре 4°С не более 1 суток.

1.4. Подготовка контрольных сывороток.

Положительная и отрицательная контрольные сыворотки (К+ и К-) перед использованием развести 1:10 раствором для титрования сывороток (например, в одной лунке планшета с контрольным образцом на 90 мкл РБС внести 10 мкл К+), что будет соответствовать диагностическому титру 1:100. Разведенные образцы хранению не подлежат.

1.5. Приготовление рабочего разведения конъюгата.

В рабочий раствор РРК в соотношении 1:100 внести концентрат конъюгата, осторожно (не вспенивая) перемешать. На 12 мл РРК внести 120 мкл конъюгата (если используется весь планшет). В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отобрать необходимое количество РРК и добавить соответствующее количество конъюгата. Рабочий раствор конъюгата готовить температуре 20-25°С не ранее чем за 15-20 минут до нанесения на планшет при. Остаток концентрата конъюгата хранить в течение срока годности набора при температуре 2-4°С.

1.6. Однокомпонентный субстратный буферный раствор с хромогеном ТМБ и пероксидом водорода готов к использованию. Раствор хранится в защищенном от света месте при температуре 2-4°С в течение срока годности набора.

1.7. Стоп-реагент - (0,5 М серная кислота) - готов к использованию. Срок использования не ограничен.

Подготовка исследуемых сывороток.

Для выявления специфических антител к T.spiralis использовать сыворотку крови свиней как свежеприготовленную, так и хранившуюся в течение 48 часов при температуре от 2 до 8°С в объеме не менее 50 мкл. Образцы, содержащие агрегаты или осадок, необходимо осветлять центрифугированием. Отобранные образцы предпочтительно сохранять в замороженном состоянии при температуре не выше - 20°С, но подвергать замораживанию и оттаиванию их можно не более 1 раза.

Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в условиях, исключающих бактериальный пророст. Каждый образец сыворотки или раствора отбирать новым наконечником. Для отбора проб и компонентов применять автоматические пипетки с погрешностью измерения объема не более 5%.

Образцы тестируемых сывороток развести в пробирках в буфере для разведения сывороток (БРС) до концентрации 1:100, для чего к 990 мкл (0,9 мл) буфера добавить 10 мкл сыворотки. Для проведения анализа отобрать 100 мкл (0,1 мл) из каждой пробирки и внести в лунку строго индивидуальным наконечником или пипеткой. Остатки разведенных сывороток можно сохранять для титрования сомнительных образцов при необходимости повторного анализа в течение 2-3 суток при температуре +4°С.

3. Проведение ИФА.

Комплект перед проведением анализа выдержать 30 минут при температуре от 20 до 26°С.

3.1. Планшет один раз промыть ФСБ-Т, при этом в каждую лунку внести не менее 200 мкл раствора. По окончанию промывки остатки жидкости удалить активным встряхиванием, постукиванием планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге.

3.2. В лунку планшета А1 внести внести 200 мкл К+, в лунки B1, C1 и Д1 внести по 100 мкл БРС для кратного титрования контрольного образца (до титра не менее 1:800) В одну из лунок вносят 100 мкл сыворотки К-, еще одну лунку используют для контроля качества реагентов, помещая в нее 100 мкл БРС. В остальные лунки внести по 100 мкл исследуемых сывороток в диагностическом титре 1:100. Каждый образец при титровании перемешивать не менее 5 раз пипетированием.

После этого планшет заклеить липкой лентой или поместить в полиэтиленовый пакет и инкубировать в течение 30 минут при температуре 37°С.

3.3 По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т пять раз, как описано в п.3.1.

3.4. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета внести по 100 мкл конъюгата (см. приготовление п.1.4.). Планшет закрыть и инкубировать при 37°С 30 мин.

3.5. По окончании инкубации планшет промыть ФСБ-Т 5 раз, как описано в п.3.1.

3.6. Внести в каждую лунку по 100 мкл однокомпонентного раствора субстрата с хромогеном ТМБ и поместить на 10-15 минут в защищенное от света место под наблюдение. При развитии интенсивного голубого окрашивания положительного контрольного образца реакцию останавливают добавлением стоп-реагента в количестве 50 мкл и через 2-5 минут регистрируют результаты ИФА.

Учет результатов.

Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре, оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Настройку прибора проводят «по воздуху». Реакцию учитывают, если значения оптической плотности в лунках с отрицательным контролем меньше 0,2, в лунке с контролем реагентов (конъюгата) не превышает 0,15, а с положительным (К+) равно или больше 0,6 о.п.

В случае невозможности проведения инструментального учета результатов реакции применяют визуальную оценку интенсивности окрашивания раствора в лунках, сравнивая испытуемые сыворотки с образцами К+ и К-. Исследуемую сыворотку считают положительно реагирующей с антигеном, если обусловленная ею окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом на стрипах с этим же антигеном. При определении титра антител в исследуемой сыворотке за титр ИФА к используемому антигену принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором окраска субстратной смеси более интенсивна, чем в лунках с диагностическим контрольным образцом.

Высокочувствительные методы ИФА иногда могут давать ложноположительные результаты, которые обусловлены разными причинами: загрязнением образцов, некачественной отмывкой иммуносорбента, содержанием в некоторых образцах веществ, способных неспецифически связываться с иммуносорбентами, взаимодействием антител с гетерологичными паразитарными антигенами за счет иммунологических перекрестов.

Шкала визуальной оценки реакции:

«+++» - сильноположительная, цвет темно-желтый.

«++» - положительная, цвет интесивно желтый.

«+» - сомнительная (или ложноположительная), цвет соломенно-желтый, данную пробу следует повторить в ИФА.

«-» отрицательная, окрашивание отсутствует или слабый фон.

Приложение 2.

Инструкция по применению набора компонентов для диагностики трихинеллеза кошек в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) в порядке производственного опыта

Тест-система «ВИГИС - Биотех - T.spiralis-стрип» представляет собой набор реагентов для выявления антител сыворотки крови к антигенам трихинелл.

Активными компонентами тест-системы являются антигены трихинелл, иммобилизованные в лунках стрипов; поликлональный конъюгат антител против иммуноглобулинов кошек с ферментом пероксидазой, контрольные положительный и отрицательный образцы.

Способ выявления антител к антигенам трихинелл представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в ходе которого при взаимодействии исследуемых образцов сыворотки крови с иммобилизованными в лунках антигенами гельминта происходит связывание специфических антител и образование комплекса «антиген- антитело» на поверхности лунок. После удаления несвязавшихся компонентов сыворотки и добавления в лунки стрипов конъюгата против иммуноглобулинов кошки с пероксидазой происходит включение ферментной метки в иммунный комплекс. В результате состоявшейся в лунках ферментативной реакции с субстратным раствором, содержащим хромоген (ТМБ) и катализатор - пероксид водорода, образуется окрашенный продукт. Интенсивность окраски этого продукта пропорциональна концентрации а