Способ экспрессного определения устойчивости к изониазиду у микобактерий туберкулеза

Способ экспрессного определения устойчивости к изониазиду у микобактерий туберкулеза

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного определения устойчивости к изониазиду у микобактерий туберкулеза.

Эффективное применение современных схем лечения туберкулеза затруднено селекцией и циркуляцией штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к основным противотуберкулезным препаратам первого ряда, в частности к рифампицину (RIF), изониазиду (INH), стрептомицину. Мультирезистентными считаются штаммы МБТ, устойчивые к RIF и INH. В то время как устойчивость к RIF связана с мутациями в коротком участке одного гена (rpoB), развитие устойчивости к INH находится под контролем сложной системы, включающей гены katG, inhA, kasA, ahpC, ndh [1-3]. В то же время, многочисленные исследования показали, что наиболее часто маркером устойчивости к INH являются мутации в гене katG [1, 2]. Изониазид, применяемый в терапии, подвергается каталитической активации в микробной клетке; эту функцию выполняет каталаза-пероксидаза, продукт гена katG [1, 2]. Основной путь развития устойчивости к INH, опосредованный изменениями в katG, состоит в отборе спонтанных мутаций, которые снижают каталазную активность, но сохраняют достаточный для жизнедеятельности микробной клетки уровень пероксидазной активности фермента. Мутация в кодоне 315 AGC→ACC (Ser→Thr) является примером такой мутации, обеспечивающей высокий уровень устойчивости к INH (1-10 mg/l) [4]. Эта мутация выявляется у большинства циркулирующих INH-устойчивых штаммов МБТ в странах с высоким уровнем заболеваемости туберкулезом [1, 2, 5], в том числе и в России (до 94%) [6-8].

Традиционные фенотипические методы определения лекарственной чувствительности требуют больших затрат времени (до 1,5 месяцев), и даже внедрение более современных методов (например, Bactec - 6-10 дней) не позволяет обеспечить экспрессный анализ. Применение молекулярно-генетических методов исследования генетических детерминант устойчивости, не требующих длительного культивирования, позволяет решить эту проблему. Применяемые в настоящее время многочисленные методы определения мутаций в katG315 включали прямое секвенирование ДНК, анализ полиморфизма одноцепочечной ДНК, полиморфизма длины продуктов кливазного расщепления и полиморфизма длины фрагментов рестрикции, метод "молекулярных маячков" и дот-гибридизацию [3-11]. Недостатками указанных методов являются трудоемкость и длительность, сложность и/или высокая стоимость оборудования, не всегда достаточная воспроизводимость и неоднозначная интерпретация результата.

В качестве прототипа предлагается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагмента гена katG в "реальном времени" (метод "молекулярных маячков" [10]); при этом внутренний олигонуклеотид взаимодействует с продуктом ПЦР только при отсутствии в нем мутаций резистентности, что сопровождается флуоресценцией. Метод требует использования специального термоциклера, стоимость которого в 3-6 раз превышает стоимость оборудования для стандартной ПЦР, и агарозного гель-электрофореза.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции устойчивости микобактерий туберкулеза к изониазиду на основе выявления мутаций в кодоне 315 гена katG.

Поставленная задача достигается определением специфических мутаций в гене katG315 методом ПЦР с аллель-специфическим праймером для кодона 315. При отсутствии мутаций в данном кодоне происходит аллель-специфическая амплификация фрагмента гена katG; наличие мутации в позиции, соответствующей 3'-концу праймера, ведет к неспариванию праймера и матрицы и неспособности полимеразы к синтезу комплементарного фрагмента. Таким образом, наличие мутации (INH-резистентного фенотипа) приводит к отсутствию индикаторного фрагмента. Обратный аллель-специфический праймер соответствует по своему 3'-концу второму основанию кодона 315 (Фиг.1). При этом выявляются мутации и во втором, и в третьем основаниях данного кодона, обеспечивающих устойчивость к INH у более 90% INH-устойчивых штаммов МБТ в России [6-8]. Анализ результатов проводится путем электрофореза продуктов ПЦР в горизонтальном агарозном мини-геле.

Преимущества предлагаемого способа:

- быстрота (один день от момента выделения ДНК),

- простая и однозначная интерпретация результатов,

- простое оборудование для стандартной ПЦР и агарозного гель-электрофореза,

- возможность быстрого анализа больших коллекций штаммов МБТ для оценки применимости метода на данной территории и при популяционных исследованиях.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где:

Фиг.1. Схематическое изображение фрагмента гена katG, анализируемого в аллель-специфической ПЦР. wt (wild type) - дикий аллель katG315. Короткие стрелки показывают праймеры (katg0F, katg5R, katg4R), длинные двусторонние стрелки - индикаторные продукты ПЦР.

Фиг.2. Анализ препаратов очищенной ДНК из штаммов М. tuberculosis методом МАС-ПЦР.

Дорожки: 1, 3, 4 - штаммы с мутацией katG315 AGC→ACC; 2, 5, 6 - штаммы с диким аллелем katG315; 7 - штамм с мутацией AGC→ACA (штамм W).

М - маркер молекулярных весов "100 bp DNA Ladder" (Amersham Biosciences).

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК из культуры МБТ, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена, проводят по van Embden et al. [12] при выделении очищенной ДНК и по Mazars et al. [13] при получении клеточных лизатов. В первом случае суспендируют 1 петлю культуры в общем объеме 400 мкл буфера ТЕ 1х и инкубируют 20 мин при 85°С. Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмонийбромида. Полученный лизат обрабатывают смесью хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл ТЕ х0.5. При получении грубого препарата ДНК (клеточного лизата) 1 петлю культуры суспендируют в 100 мкл буфера ТЕ 1х, кипятят 20 мин, центрифугируют 15 мин (12000 об/мин), и полученный супернатант используют для ПЦР.

Вариант одношаговой мультиплексной аллель-специфической ПЦР (МАС-ПЦР) с использованием сконструированных праймеров. Материал для реакции - чистая ДНК достаточно хорошего качества и количества. Проводят реакцию ПЦР фрагмента гена katG, включающего кодон 315, с использованием двух внешних праймеров (katg0F и katg4R) и одного внутреннего аллель-специфического katg5R (Фиг.1). Продукты ПЦР разделяют в агарозном 1.5% гель-электрофорезе. Отсутствие фрагмента длиной 292 пн (пн - пар нуклеотидов) (и амплификация фрагмента 435 пн) свидетельствует о присутствии мутации в кодоне 315 и, следовательно, о INH-резистентности штамма МБТ (Фиг.2). Метод использует три праймера. 3'-конец внутреннего обратного праймера соответствует 2-му основанию в кодоне katG315 AGC (дикого типа). (Фиг.1).

Следующие праймеры были использованы для MAC-ПЦР фрагмента katG315 (позиции в гене katG 669-1103 в штамме H37Rv [номер доступа в GenBank X68081, позиции 2647-3081]): два внешних праймера, прямой katg0F (5'-GCAGATGGGGCTGATCTACG) и обратный katg4R (5'-AACGGGTCCGGGATGGTG), и внутренний обратный праймер katg5R (5'-ATACGACCTCGATGCCGC). Очищенная ДНК (0.1-0.5 мкл) добавляется к смеси ПЦР (конечный объем 30 мкл), содержащей 1,5 mM MgCl₂, 1 U rTaq ДНК полимеразы (MBI Fermentas), 200 μM каждого из дНТФ, праймеры katg0F и katg5R (по 30 pmole), и katg4R (40 pmole). ПЦР проводили в термоциклере РТС-100 (MJ Research, Inc.) в следующих условиях: 96°С, 3'; 5 циклов 95°С, 45 с, 64°С, 1', 72°С, 30 с; 5 циклов 95°С, 40 с, 62°С, 40 с, 72°С, 30 с; 20 циклов 94°С, 50 с, 60°С, 40 с, 72°С, 20 с; заключительная элонгация 72°С, 3'. Продукты ПЦР (10 μ1) разделяли электрофорезом в 1,5% агарозном геле и визуализировали на УФ-трансиллюминаторе.

Оценка результатов.

В отсутствие мутации в кодоне 315 праймер участвует в ПЦР и амплифицирует фрагмент 292 пн (Фиг.2В, Дор. 2, 5, 6). В случае мутации (например, AGC→ACC) возникает неспаривание на 3'-конце внутреннего праймера и отсутствие амплификации фрагмента длиной 292 пн. Два внешних праймера katg0F и katg4R фланкируют весь изучаемый участок гена katG (Фиг.1). В случае дикого аллеля katG315 амплификация фрагмента длиной 435 пн не происходит из-за конкурентной амплификации фрагмента длиной 292 пн праймером katg5R. Фрагмент длиной 435 пн амплифицируется только у штаммов с мутацией в katG315 (Фиг.2В, Дор. 1, 3, 4, 7) и таким образом является индикатором INH-резистентного фенотипа.

Условия предлагаемого метода были отработаны на 46 штаммах с известной последовательностью katG315 [6], имевших следующее распределение аллелей: дикий тип (AGC) - 23, АСС - 22, АСА - 1.

Пример 1. Анализ 204 проб ДНК фенотипически INH-устойчивых штаммов, выделенных от эпидемиологически не связанных больных в 1997-2002 гг. (Санкт-Петербург, Ленинградская и Новгородская области). Мутации в katG315 были выявлены у 191 (93.6%) штаммов. Другие исследования, проведенные в России, показали наличие данных мутаций у 98% из 113 INH-устойчивых штаммов [7]. Таким образом, этот метод обеспечивает высокую чувствительность определения устойчивости МБТ к изониазиду в России.

Пример 2. Анализ проб из 25 клеточных лизатов. Во всех случаях результаты анализа лизатов и очищенной ДНК тех же штаммов совпадали.

Пример 3. Известный штамм W, вызвавший эпидемию мультирезистентного туберкулеза в Нью-Йорке в начале 1990-х гг. [14], устойчив к изониазиду вследствие редкой двойной мутации в katG315 AGC→ACA. Применение метода МАС-ПЦР позволило успешно определить наличие этой мутации в образце ДНК штамма W, предоставленном Питером Смоллом (Стэнфордский университет, США).

Литература

1. Ramaswami, S.V, and J.M.Musser. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update // Tuberc. Lung Dis. - 1998. - Vol.79. - P.3-29.

2. Slayden R.A., and C.E.Barry, 3^rd. The genetics and biochemistry of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis // Microbes Infection. - 2000. - Vol.2. - P.659-669.

3. Victor Т.С., P.D. van Helden, and R. Warren. Prediction of drug resistance in M. tuberculosis: molecular mechanisms, tools and applications. // IUBMB Life. - 2002. - Vol.53. - P.231-237.

4. van Soolingen D, de Haas PEW, van Doorn HR, Kuijper E, Rinder H, Borgdorff MW. Mutations in amino acid position 315 of the katG gene are associated with high-level resistance to isoniazid, other drug resistance, and successful transmission of Mycobacterium tuberculosis in the Netherlands // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol.182. - P.1788-1790.

5. van Rie, A. R.Warren, I. Mshanga, A.M.Jordaan, G.D. van der Spuy, M. Richardson, J. Simpson, R.P.Gie, D.A.Enarson, N.Beyers, P.D. van Helden, and T.C.Victor. Analysis for a limited number of gene codons can predict drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in a high-incidence community // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol.39. - P.636-641.

6. Mokrousov I., Narvskaya O., Otten Т., Limeschenko E., Steklova L., Vyshnevskyi B. High prevalence of KatG Ser315Thr substitution among isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from northwestern Russia, 1996-2001 // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol.46. - P.1417-1424.

7. Shemyakin IG, Stepanshina VN, Ivanov IY, Lipin MY, Anisimova VA, Onasenko AG, Korobova OV, Shinnick TM. Characterization of drug-resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis derived from Russian inmates // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2004. - Vol.8. - P.1194-1203.

8. Marttila, H.J., H.Soini, E.Eerola, E.Vyshnevskaya, B.I.Vyshnevskiy, T.F.Otten, A.V.Vasilyef, and M.K.Viljanen. A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates originating from the St. Petersburg area in Russia // Antimicrob. Agents Chemother. - 1998. - Vol.42. - P.2443-2445.

9. Cockerill FR, 3^rd. Genetic methods for assessing antimicrobial resistance // Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol.43. - P.199-212.

10. Piatek A.S., A.Telenti, M.R.Murray, H.El-Hajj, W.R.Jacobs, Jr., F.R.Kramer, and D.Alland. Genotypic analysis of Mycobacterium tuberculosis in two distinct populations using molecular beacons: implication for rapid susceptibility testing // Antimicrob. Agents Chemother. - 2000. - Vol.44. - P.103-110.

12. van Embden, J.D.A., M.D.Cave, J.T.Crawford, J.W.Dale, K.D.Eisenach, B.Gicquel, P.Hermans, C.Martin, R.McAdam, T.M.Shinnik, et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology // J. Clin. Microbiol. - 1993. - Vol.31. - P.406-409.

13. Mazars E., Lesjean S., Banuls A.-L., Gilbert M., Vincent V., Gicquel В., Tibayrenc M., Locht C., Supply P. High-resolution mini-satellite-based typing as a portable approach to global analysis of Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - Vol.98. - P.1901-1906.

14. Bifani P.J., Mathema В., Liu Z., Moghazeh S.L., Shopsin В., Tempalski В., Driscol J., Frothingham R., Musser J.M., Alcabes P., Kreiswirth B.N. Identification of a W variant outbreak of Mycobacterium tuberculosis via population-based molecular epidemiology // JAMA. - 1999. - Vol.282. - P.2321-2327.

Способ экспрессного определения устойчивости к изониазиду у микобактерий туберкулеза путем определения специфических мутаций в кодоне 315 гена katG посредством ПЦР, отличающийся тем, что применяют мультиплексную ПЦР с использованием двух внешнимх праймеров для фрагмента 669-1103 katG и внутреннего обратного аллельспецифического праймера, 3′-конец которого соответствует 2-му основанию в кодоне katG315 AGC, и при амплификации фрагмента ДНК длиной 435 пн и отсутствии амплификации фрагмента ДНК длиной 292 пн судят о наличии штаммов с мутацией АСС и АСА в указанном кодоне, устойчивых к изониазиду.