Способ селекции липид-продуцирующих грибов

Способ селекции липид-продуцирующих грибов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Данное изобретение предлагает способ селекции липид-продуцирующих грибов, главным образом, способ селекции липид-продуцирующих грибов, принадлежащих роду Mortierella, который осуществляется с помощью трансформации, а не селекции с использованием антибиотиков.

Уровень техники

На практике были разработаны и усовершенствованы способы (в широком смысле - способ ферментации) производства полезных веществ с использованием метаболизма микроорганизмов. Конкретным примером являются липид-продуцирующие виды грибов, способные продуцировать липиды в большом количестве за счет своего метаболизма. Виды грибов, принадлежащие роду Mortierella, такие как Mortierella alpina, являются типичными продуцентами липидов. Вид Mortierella alpina, который, как известно, продуцирует полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), такие как арахидоновая кислота, используется в промышленности (например, см. Публикацию Японского патента, Tokukouhei №7-34752 от 19 апреля 1995 года, соответствующую Публикации Нерассмотренного Японского Патента, Tokukaisho, от 25 февраля 1988 г.)

Селекция (улучшение штаммов, изолятов) с целью улучшения их генетических свойств проведена для различных полезных организмов, включая такие микроорганизмы как липид-продуцирующие грибы и им подобные. Селекция очень важна, особенно в ферментационных технологиях и в микробиологических производствах различных соединений, для достижения большей эффективности, снижения стоимости продукта и т.д.

Способ селекции в своей основе включает стадию создания популяции с необходимым генетическим разнообразием (далее для краткости эта стадия называется стадией создания популяции) и стадию отбора популяции с желаемыми свойствами (далее для краткости эта стадия называется стадией отбора). На стадиях создания и отбора популяции могут использоваться различные методы в зависимости от того, к какому виду относится выращиваемый организм. Для таких микроорганизмов, как липид-продуцирующие грибы и им подобные, на стадии создания популяции выбирают в основном: обработку мутагеном (1) или трансформацию (2).

(1) Процесс обработки мутагеном

На стадии создания популяции, включающей процесс обработки мутагеном, популяцию создают посредством индуцирования у микроорганизмов мутаций различными способами.

Воздействие мутагена вызывает множество случайных мутаций. Следовательно, даже если на стадии отбора получен вид (штамм), имеющий требуемую характеристику, всегда существует вероятность того, что вид будет иметь непредсказуемые повреждения в других генах, не относящихся к гену, контролирующему данное свойство. Например, мутация будет повреждать такие функции липид-продуцирующего гриба, как размножение, способность образовывать споры и т.д., даже если она способствует синтезу липид-продуцирующими грибами липидов другого вида. Поэтому, стадия создания популяции, включающая обработку мутагеном, не гарантирует, что будет получен продуктивный штамм.

Более того, этот способ приводит к созданию популяции, состоящей из индивидуальных организмов с множеством случайно полученных мутаций. Следовательно, если стадия селекции, следующая за стадией создания популяции, не имеет подходящего способа отбора (способа скрининга), чтобы выделить мутант (штамм), имеющий требуемые характеристики, для определения типа мутаций нужно исследовать все организмы, составляющие популяцию. Это чрезвычайно трудоемкий процесс.

(2) Процесс трансформации

Стадия создания популяции, включающая процесс трансформации, позволяет создать популяцию трансформанта за счет переноса в подходящий организм фрагмента ДНК, необходимого для получения требуемого свойства (т.е. трансформации). Таким образом, стадия создания популяции, включающая процесс трансформации, позволяет создать популяцию, где контролируется только экспрессия специфического гена, отвечающего за необходимое свойство. Поэтому после стадии создания популяции требуется только отбор желаемого вида (штамма) из полученных трансформантов, то есть скрининг на стадии отбора значительно облегчен. Более того, можно избежать непредсказуемых повреждений других генов, не контролирующих требуемое свойство. Поэтому этот метод существенно снижает трудовые затраты в процессе селекции.

Как упоминалось выше, в стадию создания популяции при селекции предпочтительно включать процесс трансформации. Например, было разработано множество методов трансформации мицелиальных грибов, к которым принадлежит род Mortierella.

В частности, (а) документы 1-3, представленные ниже, описывают способ трансформации мицелиальных грибов, таких как Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, методом доставки частиц (particle delivery method). В этом способе в качестве трансформируемого штамма-хозяина используют штаммы, ауксотрофные по урацилу, а гены, комплементарные гену, определяющему ауксотрофностьпо урацилу, используют в качестве маркеров для отбора трансформантов.

(б) В документе 4, представленном ниже, описан способ трансформации М. alpina. В этом способе протопласты приготовляют из спор, а ген вводят в клетку электропорацией. Скрининг трансформантов выполняют с использованием гена устойчивости к гигромицину В (hpt), полученного из Esherichia coli в качестве маркера. Затем трансформант может быть отобран как организм, который способен расти на среде, содержащей гигромицин.

Документ 1: Fungaro М.Н. et al. Fems microbial Lett, 25, 293-297, 1995.

Документ 2: Herzog R.W. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 333-337, 1996.

Документ 3: Armaleo, D. et al. Curr. Genet, 17, 97-103, 1990.

Документ 4: Mackenzie D.A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000.

Однако данные способы, использующие трансформацию, являются неудобными, поскольку трудно эффективно и рационально провести селекцию липид-продуцирующего гриба, который продуцирует ПНЖК.

Например, в способе (а), включающем трансформацию мицелиального гриба методом доставки частиц, мицелиальные грибы, используемые для трансформации (A. nidulans и N. Crassa), не подходят для промышленного производства таких липидов, как ПНЖК, в связи с низкой производительностью липидов у мицелиальных грибов.

Способ (б), рассмотренный в документе 4, является способом трансформации М. alpina, который известен в качестве липид-продуцирующего гриба, пригодного для использования в промышленности. Таким образом, способ (б) более подходит для промышленного применения, чем способ (а). Однако род Mortierella, и, в частности, вид М. alpina, не чувствителен к гигромицину. Следовательно, если толерантный к гигромицину гриб рода Mortierella используется в качестве штамма-хозяина, устойчивость к гигромицину нельзя использовать в качестве маркера.

Большинство ПНЖК являются необходимыми жирными кислотами, которые имеют отношение к сложным физиологическим функциям in vivo. Поэтому, ПНЖК в последнее время привлекают большое внимание как важный компонент питания. Следовательно, существует потребность в способе ферментации, который позволил бы более эффективно производить ПНЖК. Для разработки такого способа необходимо обеспечить методику эффективной и рациональной селекции грибов рода Mortierella, являющихся высоко эффективными продуцентами липипдов.

Данное изобретение направлено на преодоление вышеизложенной проблемы. Цель данного изобретения состоит в создании селекции липид-продуцирующего гриба, принадлежащего роду Mortierella, который позволил бы эффективно и рационально проводить селекцию липид-продуцирующего гриба без использования антибиотиков.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проанализировав вышеизложенную проблему, авторы данного изобретения обнаружили, что эффективно и рационально провести трансформацию для всех штаммов грибов рода Mortierella, было бы возможно в случае:

- получения ауксотрофного штамма грибов рода Mortierella, который является продуцентом липидов,

- создания системы, в которой трансформацию выполняют с использованием в качестве маркера гена, комплементарного гену, несущему ауксотрофность в штамме-хозяине.

Авторы также обнаружили, что использование такой системы позволяет проводить самоклонирование (self-cloning), делая в связи с этим селекцию более эффективной и рациональной. Данное изобретение основано на перечисленных заключениях.

Способ, разработанный в данном изобретении, является способом селекции липид-продуцирующих грибов, принадлежащих роду Mortierella, и включает стадию трансформации. Стадия трансформации состоит из:

- стадии переноса маркерного гена в штамм-хозяин, где указанный штамм-хозяин представляет собой ауксотрофный штамм липид-продуцирующего гриба, а маркерный ген комплементарен гену, несущему ауксотрофность в штамме-хозяине, и

- стадии отбора трансформанта, где в качестве маркера используют восстановление прототрофности штамма-хозяина (компенсация свойства ауксотрофности).

Данный способ является наиболее подходящим для таких видов липид-продуцирующих грибов, как Mortierella alpina, Mortierella hygrophila или Mortierella chlamydospora. Кроме того, данный способ является наиболее подходящим для штаммов, ауксотрофных по урацилу, а также для использования в качестве маркерного гена оротидин-5'-фосфат декарбоксилазы или гена пирофосфорилазы оротидиловой кислоты.

На стадии переноса в данном способе можно использовать способ электропорации или способ доставки частиц.

Кроме того, способ может включать стадию получения ауксотрофного штамма из липид-продуцирующего гриба дикого типа.

Дополнительные цели, возможности и достоинства данного изобретения будут понятными из дальнейшего описания.

СПОСОБ РЕАЛИЗАЦИИ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из вариантов реализации данного изобретения описан ниже. Однако необходимо отметить, что способы реализации изобретения не ограничиваются этим вариантом.

В данном изобретении популяцию, обладающую требуемой генетической вариабельностью, создают посредством трансформации, при которой в качестве маркера используют ауксотрофность. Был получен ауксотрофный штамм гриба рода Mortierella, являющийся продуцентом липидов. Этот штамм используют в качестве штамма-хозяина, в клетки которого передают ген, комплементарный гену, несущему ауксотрофную мутацию в хозяине (трансформация). Из популяции отбирают трансформант, а в качестве маркера отбора используют восстановление прототрофности штамма-хозяина.

Далее подробно описываются виды грибов рода Mortierella, которые используют в данном изобретении, способ селекции в соответствии с настоящим изобретением и его применение.

(1) Грибы рода Mortierella.

Выбор вида грибов рода Mortierella для использования в данном изобретении практически ничем не ограничен. Например, могут быть использованы различные виды мицелиальных грибов, принадлежащие роду Mortierella. Род Mortierella делится на два подрода - Mortierella и Micromucor. Все виды, принадлежащие подроду Mortierella, продуцируют жирные кислоты с количеством углеродных атомов равным 20, такие как арахидоновая кислота, в то время как виды подрода Micromucor продуцируют жирные кислоты с числом углеродных атомов, равным 18 и меньше. Виды грибов рода Mortierella, используемые в данном изобретении, могут принадлежать и подроду Mortierella и подроду Micromucor.

Характерными примерами видов грибов, принадлежащих роду Mortierella, являются: М. alpina, M. elongata, M. exigua, M. hygrophila, M. isabelina, М. turficola, M. gamsii, M. cogitans, M. capitata, M. vinacea, M. chlamydospora, и им подобные. Нужно заметить, что данное изобретение не ограничено этими видами. Среди вышеперечисленных видов М. alpina (Mortierella alpina), широко применяющийся в качестве липид-продуцирующего гриба, является наиболее предпочтительным для использования в данном изобретении. Известно, что штаммы вида М. alpina накапливают внутри плодового тела гриба такие ПНЖК как арахидоновая кислота (АРК). Этот вид широко используют не только в исследованиях биосинтеза ПНЖК, но и в промышленном производстве ПНЖК.

Грибы рода Mortierella, включая вид М. alpina, можно получить из разных источников. Получить грибы можно в таких организациях по хранению микроорганизмов, как Институт ферментации, Осака (Institute for fermentation, Osaka), AKOK - Американская коллекция образцов культур (АТСС - American Type Culture Collection), или в других подобных институтах. Штаммы, на которые была подана патентная заявка, можно получить из Международного Хранилища Патентованных Организмов Национального Института Науки и Техники Современного Производства (International Patent Organism Depository of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology). Кроме того, можно получить и использовать неизвестные штаммы, принадлежащие роду Mortierella, из природной среды, используя хорошо известный способ скрининга.

(2) Способ селекции липид-продуцирующего гриба в соответствии с данным изобретением.

Способ селекции согласно настоящему изобретению можно осуществить любым путем, с условием, что стадия создания популяции будет включать стадию трансформации (здесь и далее стадия трансформации). Однако для способа селекции согласно настоящему изобретению предпочтительной является стадия получения ауксотрофного штамма (здесь и далее стадия получения ауксотрофного штамма). Конечно, способ селекции может включать стадию (стадии), отличающуюся от указанных. Более подробно эти стадии описываются ниже.

<Стадия получения ауксотрофного штамма>

Выбор методики на стадии получения ауксотрофного штамма ничем не ограничен, при условии, что эта методика будет направлена на получение ауксотрофного штамма (ауксотрофного мутанта) гриба рода Mortierella дикого типа. Для получения ауксотрофного штамма может быть выбран любой широко известный способ. К примеру, в случае, когда известен ген, связанный с ауксотрофностью (т.е., если ген найден либо в результате анализа целого генома, либо другим способом), возможно получение ауксотрофного штамма "выключением" (knock out) этого гена.

Данное изобретение не ограничено каким-либо особым типом ауксотрофности, которую несет штамм. Например, штамм может быть ауксотрофным по таким аминокислотам, как лейцин, гистидин, метионин, аргинин, триптофан, лизин и др.; ауксотрофным по основаниям нуклеиновых кислот, таким как урацил, аденин и др.; ауксотрофным по витаминам; ауксотрофным по другим веществам.

В данном изобретении, например, используют штамм, ауксотрофный по урацилу (здесь и далее урацил-ауксотрофный штамм) как описано в нижеследующих примерах. В случае грибов рода Mortierella применение урацил-ауксотрофных штаммов является наиболее целесообразным, потому что для данных штаммов возможно использование устойчивости к 5-фтороротовой кислоте (5-FOA) в качестве маркера для позитивной селекции при скрининге.

Стадию получения ауксотрофного штамма можно проводить для получения штамма, который не может расти на синтетической среде без определенного питательного вещества. На данной стадии также возможно применение скрининга веществом, ограничивающим рост штамма с мутантным геном. К примеру, скрининг с помощью 5-FOA может быть проведен для получения урацил-ауксотрофных штаммов, несущих мутацию в гене URA3 или в гене URA5. Скрининг аминоадипиновой кислотой может выполняться для получения штаммов, ауксотрофных по лизину с мутациями в генах LYS2 или LYS5. Предпочтительно получать ауксотрофные штаммы, в которых число мутантных генов ограничено. Это нужно для точного определения маркерного гена, используемого на стадии трансформации.

<Трансформация, стадия 1: перенос гена>

Стадия трансформации, как описано выше, представляет собой стадию осуществления трансформации на стадии создания популяции в процессе селекции организма. Стадия трансформации включает стадию переноса гена и стадию отбора. При необходимости стадия трансформации может включать этап (этапы), отличающиеся от указанных.

Выбор способа для переноса гена в данном изобретении не имеет особых ограничений при условии, что на стадии переноса гена маркерный ген переносят в штамм-хозяин, где хозяином является ауксотрофный штамм гриба (липид-прдуцирующего гриба) рода Mortierella, а маркерный ген комплементарен гену, несущему ауксотрофность в штамме-хозяине.

Подбор маркерного гена также ничем не ограничен при условии, что маркерный ген комплементарен гену, несущему мутацию, определяющему ауксотрофност в ауксотрофном штамме. Конкретными примерами маркерных генов могут быть: ген leu2 для лейцин- ауксотрофного штамма, ген his3 для гистидин-ауксотрофного штамма, ген lys2 для лизин-ауксотрофного штамма, ген trp1 для триптофан-ауксотрофного штамма, ген ura3 или ген ura5 для урацил-ауксотрофного штамма, ген ade2 для аденин-ауксотрофного штамма.

Например, согласно настоящему изобретению, как описано в примерах, штаммом-хозяином может являться урацил-ауксотрофный штамм, а маркерным геном - ген ura5.

Не существует ограничений на то, как получить маркетрный ген. Маркерный ген может быть получен с использованием широко известных способов, применяемых для других видов (микро)организмов (таких как дрожжи), отличных от грибов.. Также, можно использовать коммерчески доступный ген. В качестве альтернативы, исходя из того, что к данному изобретению применимо самоклонирование, маркерный ген может быть получен из грибов рода Mortierella, которые используют в качестве штамма-хозяина. Например, как описано в нижеприведенных примерах, ген ura5 был получен из М. alpina (штамм-хозяин), с использованием последовательности оснований гена ura5, взятой из трех видов дрожжей.

Вопрос о том, как передать ген (т.е. как трансформировать) на стадии переноса гена не принципиален. Могут быть использованы традиционные, хорошо известные способы, такие как электропорация, способ доставки частиц или другой подходящий способ. В случае применения электропорации для грибов рода Mortierella предпочтительно, чтобы плодовые тела грибов были превращены в протопласты.

Одной из вариаций способа доставки частиц является метод выстреливания частиц (метод баллистической трансфекции). Хотя, конечно, метод доставки частиц не ограничивается только этой разновидностью.

Маркерный ген не имеет особых ограничений в отношении специфики его структуры, при условии, что этот ген может быть передан в плодовые тела грибов рода Mortierella. так, чтобы была возможна его экспрессия. В данном изобретении маркерный ген готовят в виде генной конструкции, полученной сшиванием (а) области рекомбинации (здесь и далее область рекомбинации), которая затем рекомбинирует с хромосомой (встраивание), с (б) кассетой экспрессии, куда лигируют нужный промотор. Генная конструкция может быть передана в штамм-хозяина как с помощью вектора, в который она встроена, так и напрямую, без использования векторов.

Кассету экспрессии маркерного гена, которую содержит генная конструкция, конструируют так, что промотор находится выше по направлению транскрипции от маркерного гена. Предпочтительно, чтобы терминатор находился ниже по направлению транскрипции от маркерного гена.

Помимо кассет экспрессии маркерного гена и рекомбинантной области, генная конструкция может содержать поликлональный сайт (сайт множественного клонирования) для того, чтобы в нее можно было встраивать кассеты экспрессии различных генов. Генная конструкция может дополнительно содержать фрагменты ДНК, отличные от кассеты экспрессии маркерного гена (которая содержит промотор, маркерный ген и терминатор), рекомбинантной области и поликлонального сайта. Генная конструкция не имеет особых ограничений в отношении ее специфической структуры.

Не существует особых ограничений в отношении структуры специфических фрагментов ДНК, описанных выше. Например, структура промотора никак не регламентируется при условии, что промотор приводит к эффективной экспрессии маркерного гена. В данном изобретении можно использовать уже известный промотор. Однако данное изобретение не ограничивается использованием других промоторов, помимо промотора hisH4, который описан в следующих примерах. Также нет особых ограничений в отношении терминатора, при условии, что терминатор функционирует как сайт терминации (прекращения) транскрипции. В данном изобретении можно использовать известный терминатор. Необходимо отметить, что данное изобретение не ограничивается использованием терминатора trpC, который описан в приведенных примерах. Кроме того, нет особых ограничений в отношении структуры рекомбинантной области, при условии, что рекомбинантная область является сегментом ДНК, посредством которого маркерный ген передаваемый в плодовые тела грибов рода Mortierella, встраивается в хромосому. В нижеописанном примере рекомбинантной областью является рибосомная ДНК 18S.

Выбор рекомбинантного вектора экспрессии в случае, когда генная конструкция вводится в вектор для получения вектора экспрессии, ничем не ограничен. Вектор экспрессии может быть эквивалентен стандартному рекомбинантному вектору экспрессии. Рекомбинантный вектор экспрессии получают с использованием плазмиды, фага, космиды и.т.п. Особых ограничений на способ получения рекомбинантного вектора экспрессии не накладывается. Более того, получение рекомбинантного вектора экспрессии может быть выполнено при использовании известного способа. Предпочтительным образом, при получении рекомбинантного вектора экспрессии используют плазмиду.

<Трансформация, стадия 2: селективный отбор>

Стадия отбора на стадии трансформации не имеет существенных ограничений при условии, что на стадии отбора трансформантов в качестве маркера используют восстановление прототрофности штамма-хозяина. Стадию селективного отбора можно выполнять с использованием наиболее подходящего известного способа. Например, стадия селективного отбора трансформанта, полученного после стадии переноса гена, можно выполнять с применением синтетической среды, в которой в зависимости от типа ауксотрофности, используемой как маркер, отсутствует определенный источник питания, который определяеется. Этим способом можно легко и эффективно отбирать трансформанты.

Как описано выше, ауксотрофность используют в качестве маркера на стадии трансформации. Преимуществами ауксотрофности как маркера являются простота использования и низкий фон (уровень ошибочного отбора). Более того, использование ауксотрофного маркера дает преимущество возможности использования гена, полученного из гриба рода Mortierella, используемого в качестве штамма-хозяина. Ауксотрофность в качестве маркера предпочтительно использовать на пищевом производстве по сравнению с маркером устойчивости к антителам.

Использование ауксотрофности более подробно описано для способа в документе 4, упомянутом в разделе "Уровень техники". Как пример, в указанном способе в качестве маркера используют устойчивость к гигромицину. Для того, чтобы отбираемые трансформанты стабильно росли, в среду необходимо добавить гигромицин. В результате продуцирующиеся с использованием трансформантов липиды будут загрязнены гигромицином, чего желательно избегать при использовании липидов в качестве пищевого продукта.

Однако при использовании, например, урацил-ауксотрофного штамма в реальном производстве используют питательную среду без урацила. Это позволяет продуцировать липиды за счет селективного роста грибов, в которые передан ген (например ген ura5 или другой ген), комплементарный гену, несущему (урацил) ауксотрофную мутацию в штамме-хозяине. То есть, используя ауксотрофность в качестве маркера, можно избежать загрязнения гигромицином (антителами) и при этом обеспечить селективное культивирование. Соответственно, в данном изобретении предпочтительно использовать ауксотрофный маркер.

<Стадия селекции>

Согласно способу селекции согласно настоящему изобретению для селекции липид-продуцирующих грибов, в которых в качестве маркера используют ауксотрофность, могут быть получены популяции штаммов с различными характеристиками за счет переноса различных генов на стадии трансформации. Следовательно, данное изобретение можно реализовать с включением стадии селективного отбора из полученной популяции - трансформантов, имеющих желаемые характеристики. "Стадия селекции" отличается от "селективного отбора" на стадии трансформации. Стадия селекции не предназначена для отбора трансформантов с использованием ауксотрофности в качестве маркера. Стадия селекции направлена на отбор трансформантов, которые обладают предпочтительными характеристиками по отношении к основной массе полученных трансформантов.

На выбор методики проведения стадии селекции особых ограничений не накладывается. Для отбора трансформантов, имеющих предпочтительные характеристики, можно использовать стадию селекции в соответствии с целью улучшения требуемых видовых характеристик. Селекция может проводиться известным способом в условиях, которые позволяют отбирать трансформант, имеющий требуемое свойство.

(3) Применение настоящего изобретения

Способ селекции согласно настоящему изобретению направлен, как описано выше, на селекцию липид-продуцирующих грибов, а именно на получение трансформантов с желаемыми свойствами, которые отбирают из популяции, обладающей генетическим разнообразием. В качестве маркера для отбора трансформантов используют ауксотрофность. Благодаря этому создается возможность эффективно и рационально получать новые виды (новые штаммы) из липид-продуцирующих грибов дикого типа, принадлежащих роду Mortierella. Грибы этого рода в особенности хорошо известны как продуценты липидов. В особенности известны грибы вида М. alpina, как надежные продуценты липидов. Возможно эффективно и просто получать штаммы, например, с улучшенными характеристиками производительности липидов.

Кроме того, в способе селекции согласно настоящему изобретению, можно проводить трансформацию с использованием только генов липид-продуцирующего гриба, предназначенного для трансформации. Также в данном изобретении можно применять самоклонирование. Таким образом, можно получить подходящий фрагмент ДНК из штамма грибарода Mortierella дикого типа и перенести указанный фрагмент в ауксотрофный штамм, контролируя таким образом экспрессию определенного гена (высокий уровень экспрессии, временные характеристики экспрессии, ингибирование экспрессии и т.д.). Это дает возможность получить трансформант (то есть новый штамм), который будет обладать такими характеристиками, как увеличение уровня продуцирования липидов, модификация вида или состава продуцируемых липидов и т.д. Конечно, данное изобретение подразумевает и возможность переноса в ауксотрофный штамм фрагмента ДНК, полученного из другого вида, без осуществления самоклонирования.

Способ селекции согласно настоящему изобретению не ограничивает выбор применяемых в нем методик (например, получения фрагмента ДНК) и может включать любые известные способы. Например, в случае самоклонирования способ получения подходящего фрагмента ДНК из грибов рода Mortierella дикого типа (штамм-хозяин) практически ничем не ограничен и может выполняться известным способом. Кроме того, не накладывается особых ограничений на подходящий фрагмент ДНК (например, передаваемый ген и т.п.) при условии, что указанный фрагмент ДНК выполняет требуемые и желаемые функции или может выполнять желаемые функции.

Например, фрагмент ДНК может представлять собой кассету экспрессии, лигированную, по крайней мере, с промотором и, желательно, с терминатором и встроенную в рекомбинантный вектор экспрессии. Однако данное изобретение не ограничивается именно такой структурой фрагмента. Более того, в описанных ниже примерах показано, что данное изобретение не сводится к применению гена GLELO, который использовался в качестве фрагмента ДНК в нижеприведенных Примерах.

Далее данное изобретение подробно описано посредством примеров. Однако необходимо отметить, что способы реализации настоящего изобретения не ограничиваются приведенными примерами.

[Пример 1]

Представлен характерный пример способа селекции согласно данному изобретению. В примере был получен штамм, ауксотрофный по урацилу, и выполнены трансформация и отбор штамма, ауксотрофного по урацилу.

(1) Получение штамма, ауксотрофного по урацилу (стадия получения ауксотрофного штамма)

Для получения спор штамм М. alpina рассевали на среде Чапека-Докса (3% сахароза, 0.2% NaNO₃, 0.1% KH₂PO₄, 0.05% KCl, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 0.001% FeSO₄·7H₂O, 2% агар; рН 6.0) и инкубировали в течение 2 недель при 28°С. Затем выросшую массу суспендировали в водном растворе Tween 80 (1 капля/100 мл Н₂O). Для получения раствора спор гифы отделяли с помощью стеклянного фильтра (Iwaki Glass Co., Ltd.; Product No.: 3G1). Обработку мутагеном выполняли с помощью N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (МННГ) в соответствии со способом Яреонкитмонгкола с соавторами (S. Jareonkitmongkol et al. JAOCS, 69, 939-944, 1992), количество спор было в пределах 10×10⁸-10⁹.

Споры, обработанные мутагеном, рассевали на среде GY (2% глюкоза, 1% дрожжевой экстракт, 2% агар; рН 6.0), содержащей 1.0 мг/мл 5-FOA (5-фтороротовая кислота), 0.05 мг/мл урацила, и затем инкубировали 4 дня при 28°С. Таким образом, было получено шесть штаммов, устойчивых к 5-FOA. Затем определяли, являются ли полученные штаммы ауксотрофными по урацилу.

Для этого сравнивали рост этих штаммов на синтетической среде (SC) и на среде SC с добавлением урацила. (SC среда: дрожжевые источники азота без аминокислот и сульфата аммония (Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids & Ammonium Sulfate, Difco) 5.0 г, (NH₄)₂SO₄ 1.7 г, глюкоза 20 г, агар 20 г, аденин 20 мг, тирозин 30 мг, метионин 1.0 мг, аргинин 2.0 мг, гистидин 2.0 мг, лизин 4.0 мг, триптофан 4.0 мг, треонин 5.0 мг, изолейцин 6.0 мг, лейцин 6.0 мг, фенилаланин 6.0 мг/литр; среда SC с добавлением урацила: урацил 50 мг/литр).

Сравнение показало, что все шесть штаммов, устойчивых к 5-FOA, могут расти на среде с добавлением урацила как и родительский штамм, но очень плохо растут на среде, не содержащей урацила. Два из шести штаммов, устойчивых к 5-FOA, не могли расти на среде без урацила. Эти штаммы были названы Δura-1 и Δura-2.

(2) Оценка ферментативной активности

Когда штамм проявляет устойчивость к 5-FOA и фенотип ауксотрофности по урацилу, то одним из возможных объяснений этого является то, что штамм утрачивает активность оротидин-5'-фосфат карбоксилазы (фермента, кодируемого геном ura3, здесь и далее имеющего аббревиатуру ura3p) или пирофосфорилазы оротидиловой кислоты (фермента, кодируемого геном ura5, и имеющего аббревиатуру ura5p). Для определения, в каком именно гене произошла мутация, были оценены активности этих ферментов в штамме Δura-1 и в штамме Δura-2.

Штаммы инкубировали на урацил-содержащей среде GY 4 дня при 28°С при перемешивании. Приготовление раствора бесклеточного экстракта плодовых тел гриба выполняли согласно модифицированному способу Винна (J.P.Wynn et al., Microbiology, 146, 2325-2331, 2000)).

Плодовые тела грибов, полученные после инкубации в жидкой среде GY, содержащей урацил в количестве 0.05 мг/мл, в течение 4-х дней при 28°С, суспендировали в 0.1М буфере TRIS (рН 7.5), содержащем β-меркаптоэтанол. Затем клетки разрушали с использованием французского пресса (French press) при давлении 35 МПа. Полученный раствор центрифугировали для получения надосадочной жидкости, которая является раствором бесклеточного экстракта. Далее надосадочную жидкость подвергали ультрацентрифугированию при 100000 g в течение 60 мин, для отделения органелл. Центрифугированием получали растворимую фракцию.

Активность белка ura3p измеряли с помощью полученной растворимой фракции по способу Ешимото с соавторами (A. Yoshimoto et al., Methods in Enzymology Vol 51, 74-79, ACADEMIC PRESS 1978). Активность белка ura5p измеряли с помощью полученной растворимой фракции по способу Умезу с соавторами (К. Umezu et al. J. Biochem., 70, 249-262, 1971). Результаты сравнения ферментативных активностей биосинтеза пиримидина представлены в таблице 1.

Таблица 1
Штамм	ura3p (мЕд/мг)	ura5p (мЕд/мг)
Дикий тип	15.2	20.2
Δura-1	12.6	-
Δura-2	21.2	-
"-" не обнаружено

Как видно из таблицы 1, оба штамма имели активность ura3p, эквивалентную родительскому штамму, а активности ura5p обнаружено не было.

Затем отдельно приготовленные споры в количестве 10⁸-10⁹ подвергали такой же обработке мутагеном. В результате чего получили пять 5-FOA устойчивых штаммов, три из которых не могли расти на среде без урацила.

(3) Получение геномной ДНК М. alpina и библиотеки кДНК

Вид М. alpina и урацил-ауксотрофные штаммы (штамм Δura-1 и штамм Δura-2), полученные из гриба М. alpina дикого типа, соответствующим образом инкубировали в жидкой среде G

Y в течение 5 дней при 28°С. Из полученных плодовых тел выделяли геномную ДНК согласно способу Сакурадани с соавторами (Е. Sakuradani et al. Eur. J. Biochem., 260, 208-216, 1999).

Споры М. alpina высевали в жидкую среду (2% глюкоза, 1% дрожжевой экстракт; рН 6.0) и инкубировали в течение 4 дней при 28°С, затем из среды выделяли плодовые тела. Тотальную РНК выделяли способом гуанидин гидрохлорид/CsCl. Молекулы мРНК веделяли из общей РНК с использованием Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit (From Total RNA) (коммерчески доступного от Takara Bio Inc.). Затем создали библиотеку кДНК с помощью ZAP-cDNA Synhesis Kit (коммерчески доступного от STRATAGENE).

4) Получение кДНК гена ura5 из М. alpina

У трех видов дрожжей, а именно Glomerella graminicola, Saccharomyces cerevisiae и Sordaria macrospora, аминокислотные последовательности белка ura5p имеют высокую гомологию между собой в следующих двух областях:

Область 1: FGPAYKGIP (см. SEQ. ID. NO. 1)

Область 2: KEAKDHGEG (см. SEQ. ID NO. 2)

Основываясь на аминокислотных последовательностях этих областей, были синтезированы смысловые и антисмысловые праймеры, соответственно имеющие следующие последовательности оснований:

Смысловой праймер: 5'-TTYGGHCCIGCITAYAARGGHATYCC-3' (см. SEQ. ID. NO. 3)

Антисмысловой праймер: 5'-CCCTCDCCRTGRTCYTTIGCYTCYTT-3' (см. SEQ. ID. NO. 4)

"I" в последовательности праймера означает инозин. Обратите внимание, что в таблице последовательностей "n" означает сайт, соответствующий инозину.

Затем провели ПЦР с (а) геномной ДНК М. alpina в качестве матрицы, (б) двумя праймерами, упомянутыми выше, и (в) полимеразой Ex Taq (Takara Bio Inc.) с использованием термоциклера с температурным градиентом (Т Gradient thermocycler, название продукта: Biometra). ПЦР осуществляли за 35 циклов: 1 мин при 94°С, 1 мин при 52°С, 2 мин при 72°С и затем 10 минут удлинения цепи при 72°С.

ПЦР позволила синтезировать фрагмент ДНК размером приблизительно 130 п.о., последовательность оснований которого была затем определена. Было обнаружено, что данный фрагмент ДНК является высоко гомологичным по отношению к известному гену ura5. Используя ДНК в качестве зонда, библиотеку кДНК М. Alpine, полученную в (3), проверили с помощью гибридизации на бляшках, с получением плазмиды pBMAURA5, включающей кДНК гена ura5.

кДНК гена ura5 имеет последовательность оснований, показанную в SEQ. ID. NO. 5. Ген ura5 кодирует белок ura5p с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ. ID. NO. 6.

(5) Клонирование геномной ДНК гена ura5

Основываясь на последовательности кДНК (SEQ. ID. NO. 5) гена ura5, были синтезированы праймеры CRON1 и CRON2:

Праймер CRON 1: CTTCTCTTCAGCCCCCAGCCGCATCGGTCC (SEQ. ID. NO. 7)

Праймер CRON 2: GAGTCCACGAAAACTGCTGATGAGCAGCAC (SEQ. ID. NO. 8)

Используя в качестве матрицы геномную ДНК М. alpina, геномную ДНК гена ura5 клонировали с помощью ПЦР. ПЦР проводили за 30 циклов: 1 мин при 94°С, 1 мин при 55°С, 2 мин при 72°С, а затем 10 минут удлинения цепи при 72°С. В результате было обнаружено, что в гене ura5 отсутствуют интроны.

(6) Идентификация сайта мутации в ауксотрофном штамме

Провели ПЦР с использованием праймеров CRON 1 и CRON 2, где в качестве матрицы взяли геномную ДНК урацил-ауксотрофных штаммов Δura-1 и Δura-2. Таким способом были клонированы геномные последовательности гена ura5 из соответствующих штаммов. ПЦР выполнили за 30 циклов: 1 мин при 94°С, 1 мин при 55°С, 2 мин при 72°С, а затем 10 минут удлинения цепи при 72°С. Обнаружили, что в штамме Δura-1 в 93 положение по отношению к инициирующему кодону встроен остаток аденина, что привело к сдвигу открытой рамки считывания. В штамме Δura-2 остаток гуанина в 398 положении замещен аденином, а глицин в 133 положении соответствующей аминокислотной последовательности белка замещен остатком аспарагиновой кислоты. Это указывает на то, что данные мутации инактивируют активность белка ura5p в двух исследуемых штаммах.

(7) Рекомбинантный вектор экспрессии: конструирование pDura5

Плазмиду pD4 (предоставленная D.В.Archer, см.документ 4) расщепляли рестриктазами Ncol и BamHI и концы разрезов были сделаны тупыми с использованием DNA Blunting Kit (коммерчески доступного от Takara Bio Inc.). Затем фрагмент ДНК размером 5:4 т.п.н. очистили с использованием GFX PCR DNA и Gel