Селективная культуральная среда для выделения и выявления видов рода streptococcus

Селективная культуральная среда для выделения и выявления видов рода streptococcus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к микробиологии, и в частности к клинической и ветеринарной диагностике, контролю качества продуктов питания и исследованиям загрязнения окружающей среды, при которых необходимо выделение и выявление видов Streptococcus.

Стрептококки считаются родом, требовательных к питательным средам микроорганизмов, идентификация которых является чрезвычайно важной в клинической диагностике. В классификации, разработанной Lancefield, имеются многочисленные патогенные для человека виды, такие как: Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Enterococcus avium, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, возбудители септицемии, неонатального менингита, эндокардита и инфекций мочевых путей (Giuseppe, N. y Vito Mar N., 1989, Diccionario de Bacteriologia Humana, ediciyn espacola Menarini). Хотя стрептококки не являются микроорганизмами, которые чаще вызывают сепсис мочевых путей, их выявление необходимо, так как, в частности, гемолитические стрептококки являются наиболее частой причиной неонатального сепсиса, поэтому их выявление позволяет интранатально профилактически вводить антибиотики и предотвращать перинатальную инфекцию данным микроорганизмом (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. y Salgado, M., 1998, Unilidad de un medio selectivo disao-caldo para la detecciyn de esreptococo del grupo B en la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Vol 16(2). Частота раннего неонатального сепсиса составляет 1,48-4,08/1000 живых новорожденных детей со смертностью 8,7-10,5% (Montero, R.; Barbadillo, F.; Anso, S.; Marrero, M.; Carpintero I.; Sastre E. у Alonso В.: Sepsis neonatal por Streptococcus agalactiae. Qué hacer? An-Esp-Pediatr. 1998; 48(3), p.288-92; Juncosa, Т.; Bosch, J.; Dopico, E.; Guardia, C.; Lite, J.; Sierra, M.; Barranco, M.; Matas, L.; Sanchez, F.; Sanfeliu, I. y Vinas, L. 1998. Infeccion neonatal por Streptococcus agalactiae. Estudio multicéntrico en el área de Barcelona. Enferm-Infecc-Microbiol-Clin.; 16(7), p. 312-5).

Возбудителем указанного заболевания главным образом является Streptococcus agalactiae, обычный обитатель женских половых путей. Также обнаруживаются более новые, неизвестные патогены мочевых путей, такие как Streptococcus urinalis sp.nov., хотя они имеют сходство с Streptococcus pyogenes и Streptococcus canis. Предполагается новый вид рода Streptococcus, и его таксономическим названием является Streptococcus urinalis sp.nov., тип штамма CCUG 41590T (Collins, M.D.; Hutson, R.A.; Falsen, E.; Nikolaitchouk, N.; La Claire, L. and Facklam, R.R. 2000. An unusual Streptococcus from human urine, Streptococcus urinalis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol; 50 Pt 3, p. 1173-1178).

В настоящее время на рынке имеется много культуральных сред, которые разработаны для выделения и/или выявления различных видов рода Streptococcus. Среди них можно назвать: кровяной агар, кровяной агар Колумбия, триптон-соевый агар с добавлением крови, агар с настоем мозга и сердца и другие (Manual of cultivation Means OXOID. 1995. UNIPATH, Espaca; MERCK Microbiology Manual. 2000. Merck KgaA, Darmstadt; Manual DIFCO de Bacteriologia. 1984. Décima Editiyn, Francisco Soria Melguizo, S.A., Madrid).

Указанные неселективные среды не позволяют различать патогенные и непатогенные виды. Указанные среды являются неизбирательными и позволяют расти другим грамположительным и грамотрицательным бактериям, которые конкурируют со стрептококками за питательные вещества. Например, в случае Proteus штаммы, которые при развитии «расползаются», мешают выделению колоний-мишеней.

В составах сред нет высокопитательных веществ, поэтому необходимо добавление крови, что мешает обработке и повышает риск загрязнения. Кроме того, это не позволяет продлить срок годности среды, так как кровь является биологически нестабильным соединением.

Среду CLED, предлагаемую ранее упомянутыми фирмами, широко используют в лабораториях, и она считается одним из лучших вариантов. Она позволяет расти всем патогенам мочевых путей, в том числе Streptococcus, и другим грамположительным микроорганизмам, которые невозможно различить, так как они обладают одними и теми же характеристиками культуры. Рост Streptococcus является медленным. Энтерококки (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и Enterococcus avium) можно спутать с видами Shigella.

В руководстве MERCK по культуральным средам (Merck Microbiology Manual, 2000, Merck KgaA, Darmstadt) описана агаровая среда и бульон для избирательного обогащения Streptococcus, в котором используют азид натрия и сульфит натрия в качестве ингибиторов грамотрицательных организмов. В качестве недостатка указанных сред можно назвать их высокую токсичность из-за присутствия азида натрия (высокотоксичного ингредиента) и невозможность отличать виды в бульоне, который используют специально для стимуляции роста микроорганизмов.

В руководстве OXOID (Manual of culture media, OXOID, 1995, UNIPATH, Spain) описана селективная среда для Streptococcus, которая требует добавления крови и селективной добавки, которая содержит сульфат колистина и оксолиновую кислоту. Однако для нее также обязательна инкубация в атмосфере 5% CO₂. Вместе с указанными выше трудностями для нее требуется добавление крови, использование антибиотиков в качестве добавки. Кроме того, это затрудняет приготовление среды и не гарантирует фактического ингибирования нежелательной сопутствующей микробиоты вследствие проявления, причем с каждым разом все более частого, явления резистентности к антибиотикам, главным образом у грамотрицательных организмов.

Кроме того, необходимость инкубировать среду в атмосфере 5% CO₂ делает неудобным способ выделения в тех случаях, когда этот способ не направлен на идентификацию или установление различий, так что необходимо использовать культуральную среду или биохимические и серологические тесты, чтобы идентифицировать виды-мишени Streptococcus.

В упомянутом выше руководстве также описан состав селективной среды для Streptococcus/Staphylococcus, которая требует добавления стерильной крови и добавки антибиотика, налидиксовой кислоты и сульфата колистина. Применение этого состава имеет такие же недостатки, как недостатки, указанные выше в отношении использования крови и антибиотиков.

Селективной средой для быстрого выделения Streptococcus agalactiae и других стрептококков, связанных с маститом у коров, является среда Эдварда (модифицированная). Она описана в руководстве OXOID 1995 г. Это среда с добавлением крови, и она содержит сульфат талия и кристаллический фиолетовый в качестве ингибиторов. Указанная диагностика обеспечивает рост Streptococcus agalactiae и других Streptococcus при использовании подобно принципу идентификации только гидролиза эскулина. Группа стрептококков D образует осадок в среде (черные колонии) вследствие их метаболической активности, а другие микроорганизмы дают отрицательный ответ (голубые колонии), и их невозможно различить.

Кристаллический фиолетовый, используемый в качестве селективного агента, может ингибировать рост клетки Streptococcus. Сульфат талия также считается высокотоксичным соединением, вредным для здоровья человека и чрезвычайно опасным для окружающей среды. Следовательно, в то же самое время это очень неудобно для способа производства, приготовления и избавления от отходов среды.

Среду Тодда-Хевитта с гентамицином и налидиксовой кислотой, колистиновый кровяной агар с колистином и налидиксовой кислотой, бульон Мюллера-Хинтона с 5% сывороткой и амикацином (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. у Salgado, M. 1998. Utilidad de un medio selectivo disco-caldo para la detecciyn de estreptococo del grupo В en la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 16(2)) и среду с азидом, эскулином и оксолиновой кислотой уже использовали для выявления и идентификации конкретных видов Streptococcus. Среды имеют недостатки, сходные с описанными ранее (Figueras, 15 M.J; Inza, I.; Polo, F. and Guarro, J. 1998. Evaluation of the oxolinic acid-esculin-azide medium for the isolation and enumeration of faecal streptococci in a routine monitoring programme for bathing waters. Can. J. Microbiol. 44, p. 998-1002).

На группу изобретений, которые направлены на культивирование конкретных видов Streptococcus, поданы заявки на выдачу патентов или получены патенты. Некоторые из них указаны ниже.

De la Rosa Fraile описывает дегидратированную среду для идентификации Streptococcus группы B в патенте EP 1098002 A1, представленном 05.09.2001 (Dehydrated immediate reconstruction culture medium to identify group В Streptococci (Streptococcus agalactiae) by detection of their pigment), в которой дифференциацию осуществляют по продукции их собственного пигмента. Сущность изобретения заключается в добавлении к среде Granada сефадекса 200 в качестве гелеобразующего агента.

Ограничения указанных выше изобретений можно подытожить, как показано ниже:

- среда позволяет идентифицировать только Streptococcus agalactiae,

- необходимо добавление конской сыворотки,

- приготовленная среда имеет срок годности менее 2 месяцев вследствие нестабильности соединений,

- существует необходимость в дополнительном добавлении таких антибиотиков, как метронидазол и колистин, что уже представляет собой недостатки, сходные с недостатками, описанными для предыдущих составов,

- нельзя наблюдать характерные свойства культуры микроорганизма, так как среда является полутвердой.

Приготовление является сложным и включает в себя различные стадии, такие как приготовление основной среды, добавление геля, встряхивание, чтобы выловить пузырьки, добавление добавок и инкубирование в бульоне Maria.

За несколько лет до этого тот же самый автор разработал состав для выявления Streptococcus agalactiae Years before the same author developed a formulation for the detection of Streptococcus agalactiae (De La Rosa Fraile, Manuel; Patente: ES 2088827, 1996.09.16. Culture medium for Streptococcus agalactiae which activates the formation of pigment by amylases and/or (G((alpha 1-4)G) (n(2) glucooligosaccharides added as chemical compounds, as polysaccharide hydrolysates or generated in the same medium using enzymes and polysaccharides), который содержал антибиотики в форме добавки, амилазы, мальтоолигосахариды, крахмал для продукции характерного пигмента указанного микроорганизма. Этот состав сложен в приготовлении, он содержит нестабильные ферменты, вносимые в качестве добавки, и сложные химические и нестабильные соединения (мальтоолигосахариды). Поэтому его применение для получения культуральных сред не получило широкого распространения.

Другая среда, разработанная для идентификации гемолитических Streptococcus группы B, основана на образовании цветного оранжевого пигмента. Она была разработана Tanaka Yoshihiro и Takahashi Hisayoshi (JP 9313171 A2, 1997.12.09. Culture medium for group B hemolytic Streptococcus). Среда содержит глюкозу, пируват натрия, мясной пептон, MgSO₄, MOPS-фосфат, метотрексат и антибактериальное средство (неактивное по отношению к Streptococcus группы B). При использовании такого состава другие стрептококки не могут быть идентифицированы.

В патенте JP 59159797 (Kojima, H., et al. 1984.09.10. Culture medium for selective proliferation of Streptococcus hemolyticus) описана селективная среда для размножения Streptococcus hemolyticus. Она содержит липиды и жирные кислоты в качестве селективных агентов для стимуляции роста данного вида. Применение сои в этой среде усложняет ее приготовление, а также селективные агенты не ингибируют рост других видов-мишеней Streptococcus.

Deyloff John защитил патентом культуральную среду для дифференцированного выявления Streptococcus mutans (US 4468456, 1984.08.28. Medium for differentiating Streptococcus mutans), состоящую из фосфатных солей, агара, дрожжевого экстракта, сахарозы и индикатора pH. Приготовление продукта является сложным, так как он состоит из двух отверждаемых слоев. К одному из которых необходимо добавлять суспензию фосфата кальция, который труднорастворим. Среда является недостаточно ингибирующей для других грамположительных видов.

Другие среды и способы были разработаны для культивирования конкретных видов Streptococcus, чтобы получать некоторые метаболиты или даже для диагностики. Эти продукты в любом случае обеспечивают возможность дифференциации или выявления значительного количества видов Streptococcus. Среди них можно отметить Park et al. и Inoue et al. (US 5496726, 1996. Streptococcus zooepidemicus medium and process for preparing hyaluronic acid; US 4 306 024, 1981.12.15. Process for cultivation of hemolytic Streptococcus pyogenes).

Blareau Jean Pierre и соавторы (патент: FR 2723960-A1, 1994.08.31. Cultures of Streptococcus thermophilus to activite beta-galactosidase elevee, leur proceeds d'obtention, et leurs utilisations) запатентовали культуральную среду для Streptococcus thermophilus, которая содержит только гидролизаты белков молока, лактозу и дрожжевой экстракт. Среда не предназначена ни для клинической диагностики, ни для контроля за качеством пищевых продуктов и не является селективной средой для выявления Streptococcus.

Другая группа изобретений, наоборот, направлена на культивирование нескольких родов или видов Streptococcus и не позволяет осуществлять среди них дифференциацию или соответствующую идентификацию, различные примеры указаны далее.

В последние годы возросло применение хромогенных и флуорогенных субстратов, которые включали в традиционные среды или в новые культуральные среды, разработанные специально для некоторых микроорганизмов в соответствии с их метаболическими потребностями. Указанные хромогенные реакции имеют некоторые преимущества по сравнению с обычными средами, такие как быстрота получения результатов, высокая специфичность и чувствительность вследствие деградации специфичного субстрата фермента.

Manafi в различных статьях и всесторонних обзорах отмечал, что хромогенные и флуорогенные субстраты чаще используют в качестве соединений для культуральных сред. Кроме того, он дал объяснения их возможным применениям при идентификации некоторых видов Streptococcus. Например, в статье «New developments in chromogenic and fluorogenic culture media» (Manafi, M. 2000. International Journal of Food Microbiology 60, p. 205-218) он обращается к указанным средам, которые имеют некоторые ограничения или недостатки:

- Enterolert (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine) и планшет для микротитрования MUST (Sanofi, France), которые содержат специфичные флуорогенные субстраты для D-глюкозидазы, предназначенные для выявления энтерококков в воде. Хотя они не позволяют проводить дифференциацию и идентификацию других стрептококков и содержат в качестве специфичного маркера фермента только флуорогенный субстрат.

- Агар предназначали для подсчета энтерококков в морской воде или пресной воде. Он содержит налидиксовую кислоту, циклогексимид, хлорид трифенилтетразолия и индоксил-β3D-глюкозамид в качестве субстрата. Недостатком данной среды является применение антибиотиков в качестве селективных агентов, а также наличием единственного ферментативного маркера, который делает невозможной идентификацию других Streptococcus. Необходимо длительные периоды инкубации (24-48 часа), и чувствительность среды не так высока.

- Модификация указанной среды уменьшением концентрации хлорида трифенилтетразолия и увеличением концентрации индоксил-βD-глюкозида уменьшала период инкубации до 24 часов, но не увеличивала диагностические возможности среды.

- В бульоне для энтерококков Chromocult (CEB) (BBL) и бульоне для энтерококков Readycult (MERCK) используют 5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид в качестве субстрата для идентификации Enterococcus и азид натрия для ингибирования других микроорганизмов. Однако в среде выявляются ложно-позитивные результаты, такие как Leuconostoc, Lactococcus lactis и Aeromonas sp. Другие стрептококки не идентифицируются, и среда содержит токсичные ингредиенты.

Ориентировочная среда CHROMagar (BBL) делает возможной предполагаемую одновременную идентификацию грамположительных, грамотрицательных организмов и дрожжей (Carricajo, A.; Boiste, S.; Thore, J.; Aubert, G.; Gille, Y and Freydiere, AM. 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and identification of urinary tract pathogens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(11), p. 796-803; Samra, Z.; Heifetz, M.; Talmor, J.; Bain, E. and Bahar, J. 1998. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol., 36(4), p. 990-994; Hengstler, KA; Hammann, R. and Fahr, AM. 1998. Evaluation of BBL CHROMagar orientation medium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol. 36(5), p. 1464; Merlino, L; Siarakas, S.; Robertson, GJ.; Funnell, GR.; Gottlieb, T and Bradbury, R. 1997. Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiating and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcns species. J Clin Microbiol 35(8), p. 2190).

К микроорганизмам, которые можно идентифицировать, относятся стрептококки (группы D, B и C), хотя группы B и C невозможно различить, так что для их идентификации необходимы дополнительные биохимические тесты. Большое разнообразие окраски сильно затрудняет интерпретацию результатов, и в некоторых случаях требуется обращать особое внимание на морфологию, размер и характеристики колоний (блеск или непрозрачность), что еще больше мешает интерпретации результатов. Сходство окраски некоторых стрептококков с микроорганизмами родов Klebsiella, Enterobacter и Citrobacter заставляет проводить дополнительные тесты, что требует больше часов для осуществления. Также бросается в глаза, что среда является чувствительной к свету, который изменяет исходную окраску, инкубация и регистрация также должны проводиться немедленно.

Среда UTI medium (OXOID Inc.) предназначена для предполагаемой идентификации и дифференциации микроорганизмов, вызывающих инфекцию мочевыводящих путей. Она содержит хромогенный субстрат x-glu для идентификации энтерококков. Этот состав имеет тот недостаток, что другие стрептококки не могут быть идентифицированы, растут другие грамотрицательные микроорганизмы, которые вообще присутствуют при инфекциях мочевых путей в более высоких концентрациях, чем Streptococcus, и его применение ограничено образцами мочи.

В 1999 Alain Rambach запатентовал способ идентификации микроорганизмов по меньшей мере с использованием двух хромогенных субстратов (US 5962251, 1999.10.05 «Method for the identification of microorganisms with at least two chromogens»). Среда содержит агар, пептон, хлорид натрия, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и углеводы (глюкозу), а также хромогенные субстраты, производные индоксила (среди прочих броминдоксил, хлориндоксил, дихлориндоксил, хлорброминдоксил). Ее главное применение заключается в выявлении присутствия или отсутствия дрожжей, относящихся к роду Candida, в частности Candida albicans и Candida tropicalis, хотя микроорганизмы других родов, а также грамположительные и грамотрицательные организмы растут с разными тонами окраски и среди прочих стрептококки. Однако разнообразие развивающихся организмов, подобно предыдущему случаю, замедляет интерпретацию результатов. Имеет место большая конкуренция за субстраты, так что стрептококки могут быть ингибированы, и становится невозможно отличить друг от друга виды Streptococcus (не относящиеся к группе D).

Другая группа хромогенных культуральных сред, разработанных для выявления, подсчета и идентификации мочевых патогенов, которые, в частности, позволяют идентифицировать Streptococcus группы D, включает CPS ID2 (bioMerieux, France), Uriselect 3 (Sanofi Diagnostic) и Rainbow UTI (Biolog, USES) (Carricajo et al., 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and identification of urinary tract pathogens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(11), p. 796-803; Navarro et al., 1996. Evaluation of chromogenic medium CPS ID2 (bioMerieux) in urine cultures. Enferm Infecc Microbiol Clin Apr; 14(4), p.215-9; Reisner and Austin, 1997. Evaluation of CPS ID2 chromogenic agar as a single medium for urine culture. Diagn Microbiol Infect Dis Jul; 28(3), p.113-7; Willinger and Manafi, 1995. Evaluation of a new chromogenic agar medium for the identification of urinary tract pathogens. Lett Appl Microbiol May 20(5), p.300-2) и другие (Bochner B. US 5464755. 1995.10.07. Microbiological medium and method of assay; Yagupsky et al., 2000. Clinical evaluation of a novel chromogenic agar dipslide for diagnosis of urinary tract infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 19, p. 694-698).

Chen, Chun-Ming и соавторы подали заявку на выдачу патента, относящегося к способу и среде для выявления резистентных к ванкомицину энтерококков (Chen, Chun-Ming et al. заявка на выдачу патента 20020132285-A1. 2002.09.19. Method and medium for detecting vancomycin-resistant enterococcus). Изобретение заключается в применении ингредиента, который дает реакцию, будучи метаболизированным микроорганизмами, в данном случае ферментов β-D-глюкозидазы и пирролидонилариламидазы. Следует отметить, что эта среда не позволяет идентифицировать ни чувствительные к ванкомицину энтерококки, ни другие виды Streptococcus. Ее приготовление является трудным, так как требует добавления антибиотиков, и ванкомицин не ингибирует некоторые грамотрицательные бактерии, которые могут расти в среде. Требуются дополнительные тесты для идентификации видов.

В заявке на выдачу патента США номер 20020086278-A1, 2002.06.04, Gosnell и соавторы (Chromogenic half containing blood or hemin) описывают среду, которая содержит кровь или гемин, а также хромогенные субстраты, такие как, среди прочих, фуксин, x-глюкозидаза, x-глюкуронид, Mag-фосфат. Среда дает возможность для роста и идентификации различных видов по морфологическим характеристикам, появлению разнообразных оттенков цвета, флуоресценции и гемолитическим реакциям. Это изобретение можно рассматривать как ближайший прототип, и указанная среда обладает следующими недостатками.

- Присутствие крови или гемина создает трудности для правильной интерпретации хромогенных реакций. Кроме того, эта композиция позволяет ингибировать грамотрицательные бактерии, среди которых большое разнообразие микроорганизмов с ферментативной активностью, сходной с активностью Streptococcus.

- Период стабильности среды ограничен вследствие присутствия биологических соединений (кровь или гемин), и ее приготовление неудобно.

- Эта культуральная среда не содержит ингибирующих агентов, не является селективной средой, таким образом, она позволяет развиваться другим грамположительным и грамотрицательным родам, которые конкурируют за питательные вещества, и, как следствие, микроорганизмы-мишени (Streptococcus) не могут расти соответствующим образом.

- Применение добавок крови и гемина осложняет приготовление этой среды и увеличивает риск ее загрязнения.

- Необходимо использование дополнительных биохимических тестов для дальнейшего дифференцированного выявления Streptococcus, что требует дополнительного времени для проведения соответствующей идентификации микроорганизмов-мишеней. В частности, необходимо проведение дополнительного теста PYR, чтобы дифференцированно выявить Streptococcus pyogenes группы D Streptococcus (Enterococcus).

- Для идентификации некоторых микроорганизмов необходимо учитывать морфологию, размер и другие характеристики колоний, которые очень изменчивы, так как они зависят, наряду с другими факторами, от типа образца, начальной концентрации микроорганизма и сопутствующей микробиоты.

- Возможность того, что микроорганизмы других родов растут подобно Proteus, основной характеристикой которых является «ползучее» образование в среде, делает невозможной идентификацию колоний.

- Другие микроорганизмы, которые обладают гидролитической способностью по отношению к белкам, могут гидролизовать альбумин и мешать идентификации.

- Для приготовления среды хромогенные субстраты могут быть добавлены к свежей среде, приготовленной асептически, так как некоторые из них нестабильны при высоких температурах, что осложняет их приготовление.

- Растворы хромогенных субстратов в некоторых случаях образуют нерастворимый осадок, который может быть более нестабильным после хранения в течение одной недели, что ограничивает период пригодности диагностики «in vitro».

- При использовании подобно основе шоколадного агара среду инкубируют в атмосфере 5% CO₂.

- Некоторые хромогенные субстраты необходимо растворять в органическом растворителе диметилсульфоксиде (ДМСО), что затрудняет приготовление среды.

- В некоторых случаях (пример 3) стрептококки группы D окрашиваются так же, как другие микроорганизмы (голубые), например: Candida albicans, Staphylococcus epidermidis и некоторые грамотрицательные организмы.

- Субстраты, в частности фуксин, могут делать более темной окраску кровяной среды после инкубации, что снижает ясность считывания информации и затрудняет наблюдение гемолитических реакций.

- Хромогенные субстраты, которые дают окрашивание до фиолетовых, красных и пурпурных колоний, не воспринимаются соответствующим образом на красном фоне среды.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является получение селективной среды для выделения и выявления видов рода Streptococcus, облегчающей дифференциацию Streptococcus, имеющих клиническое значение, таких как: Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes и Streptococcus группы D (Enterococcus) в ранние периоды культивирования (2-24 часа) и с высокой чувствительностью и аналитической специфичностью.

Новизна предлагаемого изобретения заключается в комбинации специально подобранных основных питательных веществ в количестве от 15 до 58 г/л, что обеспечивает содержание общего азота, по существу полученного из белков, от 10 до 14%. Кроме того, новизна заключается в специально разработанной смеси ингибиторов грамотрицательных микроорганизмов в количестве от 0,55 до 1,63 г/л. Кроме того, новизна заключается в смеси хромогенных и/или флуорогенных субстратов, которая должна выявлять по меньшей мере один специфичный фермент каждого вида, в количестве от 0,3 до 1,5 г/л, и соединениях, являющихся индикаторами активности дезаминазы, в количестве от 1 до 3 г/л.

Исходная смесь питательных основ состоит из экстрактов и гидролизатов разного происхождения, в частности, выбранных из

- гидролизата бычьей крови от 5 до 10 г/л,

- экстракта бычьего сердца от 1 до 12 г/л,

- ферментативного гидролизата бычьей сердечной мышцы от 1 до 5 г/л,

- ферментативного гидролизата белков молока от 5 до 20 г/л,

- ферментативного гидролизата белков соевых бобов от 2 до 15 г/л,

- ферментативного гидролизата тканей животных 1-5 г/л,

- аутолизата или гидролизата дрожжей Saccharomyces cerevisiae от 2 до 15 г/л.

Ни разу не описанная специальная смесь ингибиторов включает в себя комбинацию

ацетата талия от 0,55 до 1,6 г/л,

налидиксовой кислоты от 0,005 до 0,030 г/л.

Другой особый признак изобретения заключается в применении смеси хромогенных и флуорогенных субстратов, которая выявляет активность фосфатазы, глюкозидазы и глюкуронидазы, чтобы дифференцировать различные виды Streptococcus. Смесь содержит пара-нитрофенилфосфатную соль динатрия (PNP) от 0,2 до 0,8 г/л; x-glu (5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозид, Mu-glu (4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозид), Salmon-glu (6-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозид) от 0,05 до 0,4 г/л и x-gluc (циклогексиламмониевая соль 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида), Magenta-Gluc (циклогексиламмониевая соль 5-бром-6-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида) и MUG (тригидрат 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида) от 0,05 до 0,2 г/л.

Указанные хромогенные вещества объединяются в нестандартной форме, чтобы обеспечить появление окраски или флуоресценции, разной для каждого выявляемого вида. Среди них можно назвать

a) PNP+x-glu+Magenta-gluc или MUG;

b) PNP+Salmon-glu+x-gluc или MUG;

c) PNP+MU-glu+Magenta glue или x-gluc.

Другой особый аспект изобретения заключается в том, что добавляют несколько соединений, которые показывают активность дезаминазы в среде, таких как соли тривалентных металлов, предпочтительно цитрат железа-аммония в количестве от 0,5 до 1,0 г/л, и ароматические аминокислоты, предпочтительно фенилаланин и триптофан, в количестве от 1,0 до 2,0 г/л.

К указанной выше композиции добавляют от 10,0 до 14,0 г/дл агара. Полученная среда позволяет наблюдать характеристики культуры организмов-мишеней.

Приготовленная среда имеет значение pH от 7 до 7,4, и ее концентрация в воде может варьироваться от 25 до 80 г/л.

Среда впервые позволяет выделять и выявлять исключительно различные виды Streptococcus, в основном патогены человека, только по специфичной окраске колоний некоторых родов и изменению окрашивания среды. Впервые предлагается селективная среда, которая помогает одновременно отличать стрептококки группы D (Enterococcus) от остальной их части и различать виды рода Streptococcus. Например, Streptococcus agalactiae и Streptococcus pyogenes, которые растут хорошо, в то время как другие грамположительные и грамотрицательные виды подавлены.

Преимущества среды, предлагаемой в настоящем изобретении, заключается в следующем.

- Впервые облегчается дифференцирование патогенных и большинства непатогенных видов Streptococcus.

- Среда является высокоселективной для Streptococcus, ингибирует большинство грамотрицательных видов бактерий, за исключением Proteus mirabilis ATCC 7002, рост которой сильно ингибирован в среде, кроме того, этот организм может быть идентифицирован по изменению окраски среды до окраски, отличной от среды в случае видов Streptococci. Также очень немного видов других ингибированных грамположительных организмов могут развивать минимальный рост в среде, и они принимают окраску, которая не мешает обильному росту микроорганизмов-мишеней.

- Среда содержит сложную и новую смесь питательных основ, полученных из различных источников с разными составами, которая обеспечивает присутствие аминокислот, пептидов, полипептидов, протеаз и пептонов, и неожиданно они способствуют обильному росту видов-мишеней и позволяют исключить нестабильные вещества, такие как гемин и кровь.

- Фактом значимости и новизны является исключение ферментативного гидролизата крови в указанной выше смеси. Это обеспечивает в среде веществ, полученных из крови или их фракций, которые необходимы для роста Streptococcus, и позволяет избежать трудностей при идентификации. С другой стороны, расщепленные белки крови не влияют на стабильность среды.

- Вследствие присутствия достаточного количества питательных веществ для быстрого роста стрептококков в среде и ингибирующих веществ, которые обеспечивают отсутствие других конкурирующих организмов, представители данного рода могут быть выявлены быстрее и могут быть выделены и идентифицированы не позже чем через 6-24 часа инкубации.

- Значения чувствительности и специфичности являются более высокими по той причине, что стрептококки не могут быть спутаны с грамотрицательными бактериями, такими как: Shigella и Escherichia coli, так как указанные микроорганизмы не растут в среде. Также немногие грамположительные виды, которые способны расти в среде (Staphylococcus xylosus и Staphylococcus saprophyticus) имеют другие характерные признаки культуры и являются почти полностью ингибированными, так, их нельзя спутать с остальной частью микроорганизмов. Если какой-либо штамм имеет характерные признаки роста, сходные с Streptococcus, его можно отличить по прямому каталазному тесту на планшете.

- В настоящем изобретении не используют ни высокотоксичных веществ, ни загрязнителей окружающей среды. По этой причине среду можно легко приготовить, например, как в промышленном масштабе, так и в лаборатории, при соответствующих и специальных условиях процесса.

- Эффективность ингибиторов, указанных в составе, позволяет избегать применения нестабильных антибиотиков, так что приготовление среды является простым, и не возникает ошибок идентификации вследствие явлений резистентности к противомикробным агентам.

- Комбинация ингибиторов и концентрация в среде и их соотношение с питательными веществами делает возможным то, что ни один вид Streptococcus не ингибирован в среде. Данный факт делает среду очень подходящей, как никогда ранее, для специфичной диагностики данного рода.

- Может быть получен более быстрый диагноз, поскольку когда стрептококки-мишени соответствующим образом выявляются и различаются с высокими значениями чувствительности и специфичности, нет необходимости в проведении дополнительных биохимических тестов.

- Приготовление этой среды чрезвычайно просто, так как в некоторых случаях не нужно автоклавировать, а в других необходимо добавить только одну добавку.

- Стабильность приготовленной среды высокая, поскольку она содержит ингибиторы большинства загрязнителей окружающей среды и не содержит нестабильных вещества (таких как гемин, кровь и антибиотики).

- Когда идентификацию бактерий-мишеней осуществляют только по характерным признакам культуры (окраска среду или колонии), то это исключает необходимость it excludes the necessity to observe подробно исследовать морфологические характеристики колоний, облегчая интерпретацию результатов для обученного, но не специального персонала.

- Применение более чем одного ферментного маркера для дифференциации разных видов рода Streptococcus увеличивает диагностическую специфичность и чувствительность.

- Состав, о котором сообщается в заявке, облегчает приготовление среды с разными концентрациями для множества применений (например, с основной концентраций в гелеобразной среде, двойной концентрацией в способе мембранного фильтрования или в форме бульона и еще более высокой концентрацией для миниатюрных систем).

- Указанной средой можно заменить применение разных традиционных или хромогенных сред, используемых при идентификации разных видов в пределах рода Streptococcus.

- Предлагаемый состав способствует его применению при скрининге Streptococcus в клинических или ветеринарных образцах, в воде и других элементах окружающей среды, а также в продуктах питания.

- Осуществляют выделение и одновременную идентификацию в одну стадию в итоге с уменьшением времени, ресурсов и персонала.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для определения состава среды компоненты, используемые в препарате, предпочтительно представляли собой твердые вещества. Описание стадий, которые должны быть осуществлены для приготовления среды, представлены ниже.

Смесь питательных основ, общее содержание азота в которых составляет от 10 до 14%, просеивают, чтобы получить однородность по размеру частиц.

Количество указанных ингредиентов белковой природы варьирует от 15 до 58 г/л. Конкретно пределы количества описаны ниже.

- гидролизат бычьей крови от 5 до 10 г/л,

- экстракт бычьего сердца от 1 до 12 г/л,

- ферментативный гидролизат бычьей сердечной мышцы от 1 до 5 г/л,

- ферментативный гидролизат белков молока от 5 до 20 г/л,

- ферментативный гидролизат белков соевых бобов от 2 до 15 г/л,

- ферментативный гидролизат животной ткани 1-5 г/л,

- аутолизат или гидролизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae от 2 до 15 г/л.

Селективные агенты выбраны из: ацетата талия от 0,55 до 1,6 г/л и налидиксовой кислоты от 0,05 до 0,030 г/л. Таким же образом их просевают, чтобы подготовить для смешивания с остальной частью соединений. Предварительно смешивают хромогенные и флуорогенные соединения для выявления активности глюкозидазы, фосфатазы и глюкуронидазы в количествах от 0,3 до 1,5 г/л. Кроме того, их можно перед гомогенизацией измельчить и просеять. Если процедура смешивания эффективна и при взвешивании количество предварительной смеси равно сумме количеств каждого компонента в композиции, то должно достигаться соответствующее распределение каждого компонента.

В соответствии с назначением среды хромогенные и флуорогенные субстраты могут быть выбраны из

пара-нитрофенилфосфатной соли динатрия (от 0,2 до 0,8 г/л);

x-glu (5-бром-4-хлор-3-индолил-βD-глюкопиранозида, Mu-glu (4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозида), Salmon-glu (6-хлор-3-индолил-β-D-глюкопиранозида) (от 0,05 до 0,4 г/л);

x-gluc (циклогексиламмониевой соли 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида), Magenta-Gluc (циклогексиламмониевой соли 5-бром-6-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронида) и MUG (тригидрата 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида) (от 0,05 до 0,2 г/л).

Получали структуру смеси хромогенных и флуорогенных веществ, которые могут деградироваться по меньшей мере одним ферментом каждого вида. Комбинации, которые обеспечивают появление окрасок или различной флуоресценции для каждого вида, описаны ниже:

PNP+x-glu+Magenta-gluc или MUG

PNP+Salmon-glu+x-gluc или MUG

PNP+Mu-glu+Magenta-gluc или x-gluc

Гелеобразующий агент, предпочтительно агар, с плотностью от 400 до 700 г/см² используют в диапазоне от 10,0 до 14,0 г/л, в частности, для твердой среды. Перед добавлением к среде он должен быть высушен и просеян.

Все указанные выше соединения, а также предварительную смесь объединяют и гомогенизируют до достижения единообразной смеси со значением pH от 7,0 до 7,4. Смесь распределяют в плотно закрытые флаконы, которые защищают от света и хранят при температуре окружающей среды.

Порошок суспендируют в дистиллированной или деионизованной воде в количестве от 30 до 80 г/л.

Композицию можно приготовить в лабораторном масштабе, взвешивая ингредиенты по отдельности внутри сосуда и выдерживая указанные выше пропорции. Затем постепенно добавляют воду к порошкообразной смеси вплоть до достижения полного растворения. Тщательно перемешивают суспензию и оставляют по меньшей мере на 10 минут. Если необходимо приготовить твердую среду, то ее либо можно стерилизовать, либо нет, предусматривая добавление пара-нитрофенилфосфатной соли динатрия. Если были предприняты меры предосторожности при приготовлении, то достаточно нагревания до кипения, поскольку среда является в высокой степени ингибирующей для микроорганизмов окружающей среды, которые могли бы ее испортить. В противном случае среду необходимо стерилизовать в течение 10 минут при 115°C, и затем после ее охлаждения до 45-50°C добавляют стерильно профильтрованный раствор PNP. В случае жидкой среды ее всегда стерилизуют в автоклаве и затем добавляют стерильную добавку. Когда готовят бульон, он должен быть разлит в окончательных емкостях.

В зависимости от консистенции среды, твердой или жидкой, можно использовать разные способы инокуляции.

После инокуляции их инкубируют при температуре от 30 до 37°C в течение по меньшей мере от 2 до 6 часов в случае жидкой среды и от 18 до 24 часов в случае твердой среды.

Результаты регистрации получают в случае твердой среды, наблюдая окраску колоний, изолированных на поверхности среды. В случае жидкой среды наблюдают только изменение окрашивания среды и флуоресценцию. Таким образом можно отличить стрептококки группы D от остальных видов данного рода. Стафилококки, как правило, не развиваются в ср