Способ детектирования специфичности активированных лимфоцитов и среда для его осуществления

Способ детектирования специфичности активированных лимфоцитов и среда для его осуществления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в общем относится к способу детектирования специфичности активированных лимфоцитов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу детектирования специфичности активированных лимфоцитов in vivo после трансплантации, вирусной/бактериальной инфекции или вакцинации.

Уровень техники

Иммунность или иммунитет представляет собой ответ на биологическое узнавание чужеродных антигенов (патогенов) и их элиминацию. Большинство антигенов не являются аутогенными, а происходят из экзогенных источников (чужеродные антигены). После внедрения в организм чужеродные антигены распознаются и оперативно удаляются при помощи ряда иммунных ответов, инициированных иммунной системой организма.

Во время трансплантации антигенные различия между донором и реципиентом, например, различия между антигеном главного комплекса гистосовметимости (МНС) и антигеном минорного комплекса гистосовметимости (mH-антиген), могут индуцировать у реципиента продуцирование специфических активированных лимфоцитов, нацеленных на антигены, которые присутствуют в органе/ткани донора и отличаются от соответствующих антигенов реципиента. Лимфоциты, продуцируемые таким образом, затем будут атаковать трансплантированный орган, приводя к реакции отторжения. Специфические активированные лимфоциты, нацеленные на различные патогены, также могут продуцироваться, если организм стимулирован/инфицирован патогенными микроорганизмами, такими как вирус кори, респираторный синцитиальный вирус, вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирусы гепатита Е и F, вирусы ветряной оспы и опоясывающего герпеса, вирус простого герпеса, цитомегаловирус, Вирус Эпштейна-Барр, коронавирус, ротавирус, вирус коксаки, ECHO-вирус, вирус Эбола, вирус желтой лихорадки, аденовирус, вирус лесного энцефалита, вирус краснухи, вирус эпидемического энцефалита В, антирабический вирус, SARS-вирус, вирус гриппа (включая человеческий и птичий), вирус эпидемического паротита, вирус геморрагической лихорадки, ВИЧ, вирус полимиелита, риккетсия, эпидемический энцефалитный диплококк, Bacillus typhi или Bacillus paratyphosus, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus diphtheriae, Bordetella pertussis, Bacillus anthracis, Bacterium burgeri, Yersinia pestis, Lepra bacillus, атипичная микобактерия, Leptospire, Treponema pallidum, Spirochaeta recurrentis, Clamudia, Cyptozoite, Leishmania, Toxoplasma, Schistosome, Paragonimiasis, Chinese liver fluke, Fasciolopsis, Filaria и т.п. В одном и том же организме может существовать множество различных специфических активированных лимфоцитов, нацеленных на различные антигены, например, у пациента, у которого произошло отторжение и который был инфицирован вирусом герпеса после трансплантации сердца, его организм будет генерировать как специфические активированные лимфоциты против МНС, так и специфические активированные лимфоциты против вируса герпеса.

Трансплантация является последней надеждой при выборе лечения на последней стадии заболевания многих органов. После трансплантации различия в МНС и mH-антигенах между донором и реципиентом всегда приводят к отторжению, которое остается основной причиной смертности в течение 3, 5 и 10 лет после трансплантации органов, таких как сердце, печень, почка и трансплантации костного мозга, а также клеточной трансплантации, и отторжение начинается с активации лимфоцитов. Наличие у реципиента лимфоцитов, специфически активированных против донора, обычно означает, что организм начал или начинает атаку на орган донора. Следовательно, для того, чтобы добиться нормального функционирования трансплантированного органа у реципиента, следует своевременно предпринимать соответствующие меры, например, увеличение дозы используемого иммуносупрессивного агента или замену на другой тип иммуносупрессивного агента, тем самым улучшая качество жизни и удлиняя время жизни реципиента.

Биопсия, которая представляет собой инвазивный способ и не может повторяться ежедневно, в настоящее время является "золотым стандартом" для диагноза отторжения во всем мире. Однако этот способ не был широко принят врачами и пациентами, поскольку он является болезненным, опасным и дорогим. Более того, из-за того, что очаги опасности находятся в определенных частях органа, а образец биопсии может быть взят только из некоторой части органа, доля неверно поставленного диагноза может быть высокой. К тому же, целью биопсии является выявление патологических изменений, например, обнаружение патологических изменений, действительно указывающих на орган, который уже поврежден. Следовательно, для улучшения качества жизни органа реципиента и удлинения срока жизни трансплантированного органа необходимы неинвазивный диагностический способ, который был бы быстр, прост и имел бы высокую чувствительность к реакции отторжения. Отторжение начинается в виде активации лимфоцитов, следовательно, активированные лимфоциты должны присутствовать еще до патологических изменений. Таким образом, настоящее изобретение разработано для диагностирования реакции отторжения путем детектирования специфических лимфоцитов, активированных МНС- или mH-антигеном в периферической крови. В результате способом, предоставленным в настоящем изобретении, можно диагностировать реакцию отторжения задолго до того, как в трансплантированном органе произойдут патологические изменения. Более того, в способе устранены недостатки, присущие анализу с применением биопсии, и он обеспечивает быстрый, точный и ясный диагностический результат в отношении реакции отторжения. Способ также может быть использован для улучшения качества жизни пациентов и увеличения срока жизни имплантата.

Многие патогенные микроорганизмы, такие как вирус кори, вирус ветряной оспы, вирус эпидемического энцефалита В, Mycobacterium tuberculosis и т.д., до проявления заболеваний имеют латентный период, во время которого симптомы обычно являются нетипичными, например, в виде повышенной температуры и т.д. Однако диагноз заболеваний, вызванных этими патогенами, обычно зависит от диагноза, основанного на типичных симптомах (специфичных симптомах), проявление которых в таких заболеваниях всегда задерживается из-за латентного периода. В результате процент постановки неверных диагнозов может быть высоким.

Настоящее изобретение также может быть использовано для диагностики инфекции патогенными микроорганизмами. Обеспечен точный и быстрый способ детектирования заболеваний во время латентного периода и на ранней стадии. Следовательно, было бы существенным реализовать задачи своевременного детектирования, своевременного введения карантина, своевременного лечения и уменьшения скорости распространения инфекции.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к способу детектирования специфичности активированных лимфоцитов, включающему в себя следующие этапы:

1) разбавление образца антигена средой, причем антиген может активировать лимфоциты в организме, и при этом среда содержит, дополнительно к стандартным ингредиентам для культивирования клеток, нейтрализующие антитела против цитокинов, которые индуцируют клеточную пролиферацию, и/или цитокины, которые индуцируют апоптоз мононуклеарных клеток или ингибируют клеточную активность или ингибируют клеточную пролиферацию;

2) приготовление суспензии мононуклеарных клеток в среде, причем суспензия содержит активированные лимфоциты;

3) инкубацию смеси антигена и указанной суспензии мононуклеарных клеток, содержащей активированные лимфоциты, на планшете для клеточных культур;

4) определение наличия антиген-специфических активированных лимфоцитов путем сравнения различий в детектируемых сигналах между тестовыми лунками и контрольными лунками.

В одном из аспектов настоящий способ может быть использован для детектирования специфичности активированных лимфоцитов, продуцированных организмом, который был стимулирован каким-либо антигеном.

В другом аспекте антиген, используемый в настоящем изобретении, может быть аллогенным антигеном, гетероантигеном или антигеном патогенных микроорганизмов различного типа. Образцы аллогенных антигенов и гетероантигенов могут представлять собой единичные антигены или могут быть смешанными антигенами от одного или нескольких индивидуумов. Антигены могут быть представлены в виде конкретного антигена, находящегося на клеточных мембранах клеток человека или животного, или на клеточных мембранах или клеточных стенках плесневых грибов или бактерий, или на оболочках или капсидах вирусов. Антиген(антигены) также могут быть представлены в виде растворимых антигенов, растворенных в растворах.

В одном из аспектов аллогенные антигены могут представлять собой непосредственный или опосредованный продукт аллелей, который может быть распознан как антиген другим членом того же биологического вида. Продукты аллелей включают в себя не только полипептиды, но также и специфические полисахариды и липиды, синтезированные ферментами, кодируемыми этими аллелями. Аллогенные антигены, используемые в настоящем изобретении, представляют собой антигены гистосовместимости, включающие главный антиген гистосовместимости (МНС) (также известный как "HLA" у человека, "SLA" у свиньи, "MAMU" у макаки, "PYCY" у желтого павиана, Н₂-антиген у мышей, RT₁-антиген у крыс) и минорный антиген гистосовместимости (Hm-антиген).

Гетероантигены, как используются в настоящем описании, относятся к веществам (например, полипептидам, специфическим полисахаридам, липидам и т.д.), которые существуют только в одном из двух биологических видов. Они могут быть опознаны другими видами и, следовательно, могут индуцировать иммунный ответ. Например, если орган свиньи собираются трансплантировать человеку, обезьяне, павиану или шимпанзе и т.д., то вещества (как описано выше), присутствующие у свиньи, но не присутствующие в организме человека, обезьяны, павиана или шимпанзе и т.д., называются гетероантигенами.

В одном из аспектов антиген патогенного микроорганизма представляет собой специфический антиген бактерии или вируса. В качестве альтернативы, антиген патогенного микроорганизма представляет собой смесь антигенов бактерий и/или вирусов (каждая бактерия или вирус может экспрессировать антигены многих типов). Он может быть предоставлен в виде композиции, приготовленной путем обработки бактериальных или вирусных частиц неионным очищающим средством и липидным растворителем или 10% формальдегидом. Антигены бактерий и вирусов также могут быть экспрессированы на клеточных мембранах клеток человека/животного. Антигены также могут быть предоставлены в виде растворимого антигена, растворенного в растворах.

В настоящем описании "целевой антиген(антигены)" относится к антигенам, которые используются при анализе, и специфические, активированные ими лимфоциты уже могут присутствовать у субъектов, которые могут быть идентифицированы при помощи этого анализа.

В настоящем описании "нерелевантный антиген(антигены)" относится к антигенам, которые при анализе используются в качестве контроля, и специфические, активированные ими лимфоциты не должны присутствовать у субъектов. Нерелевантные антигены могут различаться, в зависимости от целей анализа. Нерелевантные антигены могут быть дополнительно добавлены при анализе, или они могут быть добавлены в тот же измерительный планшет в качестве контрольных антигенов.

Антиген(антигены), используемые в настоящем изобретении, может быть конкретным антигеном, таким как антиген(антигены) ВИЧ, переносимый клетками, бактериями или вирусами; или вирусный антиген или бактериальный антиген, переносимый определенной клеткой, бактериями или вирусами. В качестве альтернативы, антигены могут быть растворимыми антигенами, такими как молекулы аллогенных антигенов или молекулы гетероантигенов, или некоторые специфические белковые молекулы определенного вируса или бактерии.

Антиген(антигены), используемый в настоящем изобретении, может относиться к одному типу аллогенных или гетерогенных молекул, а также может представлять собой смесь, содержащую несколько или все HLA-антигены и mH-антигены человека. Антиген(антигены) также может представлять собой один тип специфического антигена вируса или бактерии. Антиген(антигены), кроме того, может представлять собой смешанные антигены множества различных вирусов или бактерий. Использование одного антигена или использование смешанных антигенов может иметь результатом разную точность. Например, если при анализе используется смешанный аллогенный антиген, положительный результат может означать только наличие лимфоцитов, активированных аллогенными антигенами, т.е. иммунная система организма инициировала реакцию отторжения против донорского органа, но точно не известно, какая молекула антигена действительно индуцировала реакцию отторжения. Однако при использовании измерительного планшета, разделяющего различные HLA- и mH-антигены в отдельных камерах/лунках, положительный результат может точно указать на активированные лимфоциты, которые действительно активированы одним или несколькими аллогенными антигенами. Аналогично для диагноза вирусного или бактериального инфекционного заболевания, если при анализе используются смешанные антигены респираторно-синцитиального вируса, короновируса, аденовируса, вируса гриппа и вируса парагриппа, вируса кори, вируса ветряной оспы, вируса свинки, вируса герпеса и т.д., то положительный результат может означать только то, что субъект инфицирован одним из вышеуказанных патогенов, но при этом невозможно указать, какой из них является причиной. Напротив, если в качестве антигена при анализе используется один специфический белок определенного вируса или по существу один тип специфического белка определенного вируса, то, исходя из результатов анализа, можно установить, какой именно вирус является патогеном.

Антиген(антигены) в настоящем изобретении может быть получен следующим способом:

1. Были выбраны специфические реципиенты (HLA-антигены разных реципиентов обычно отличаются) с тем, чтобы получить все человеческие HLA-I-антигены, HLA-II-антигены и mH-антигены, присутствующие на мембранах В-клеток периферической крови. У разных индивидов естественным образом образуются различные комбинации, что позволяет сделать выбор, определяемый только необходимостью. У каждого субъекта брали по 0,5 мл периферической крови и помещали ее в культуральный флакон, содержащий подходящее количество среды для клеточных культур, например, среды 1640 (компании GIBCO), DMEM (компании GIBCO) или Eagle (компании GIBCO), среды, содержащей 10% телячьей сыворотки или фетальной телячьей сыворотки (компании GIBCO). Одновременно добавляли подходящее количество супернатанта культивируемой клеточной линии В958 (коммерчески доступной от компании АТСС), которая может секретировать вирус Эпштейна-Барр в среду для клеточных культур во время инкубации. Количество супернатанта должно содержать достаточное количество вирусов Эпштейна-Барр, чтобы трансформировать все В-клетки в 0,5 мл крови (обычно 5-10 мл супернатанта суспензии клеточной культуры В958, которую инкубировали в течение 3 дней, и исходная концентрация клеток составляла 500000 клеток В958 на мл). Затем флакон с клеточной культурой помещали в СО₂-инкубатор при 37°С на 15 дней (во время которых каждые 5 дней добавляли по 5-10 мл среды), до тех пор, пока в суспензии не появлялись агрегированные опухолевые клетки. После появления агрегированных опухолевых клеток среду можно заменить, и клетки можно культивировать таким же способом, как клетки других обычных клеточных культур, за исключением того, что все инструменты, которые контактируют непосредственно или опосредованно с клеточной линией В958, должны быть очень тщательно стерилизованы для удаления вируса Эпштейна-Барр (хотя вирус Эпштейна-Барр существует повсеместно, даже в носоглоточной полости здорового человека, процедура стерилизации все же необходима). Обработанную таким образом периферическую кровь субъектов можно было использовать для получения из нее различных линий В-клеток. После клонирования, размножения и заморозки были получены линии В-клеток, которые могли стабильно экспрессировать определенные типы HLA-антигенов и/или mH-антиген.

2. Клеточные линии, содержащие человеческие антигены HLA и mH, также можно получить способами генной инженерии: были выбраны человеческие клеточные линии, которые не экспрессируют человеческие антигены HLA и/или mH, такие как U937 (коммерчески доступная от компании АТСС) и К562 (коммерчески доступная от компании АТСС) и использованы в качестве векторов антигенов. Для получения мРНК белых кровяных клеток из периферической крови субъектов использовали обычные методы молекулярной биологии. Обычные методы генной инженерии, такие как ПЦР обратной транскрипции, сплайсинг и т.д. могут быть использованы для создания векторов экспрессии, которые могут экспрессировать различные виды HLA-антигена. Эти векторы затем трансфецировали в U937, К562 или другие клетки, которые изначально не экспрессировали HLA- и mH-антигены, для создания клеточных линий, каждая из которых может экспрессировать конкретный тип HLA-антигена, т.е. все человеческие HLA-антигены. Векторы экспрессии могут быть отобраны из различных ретровирусов. Векторы экспрессии также могут быть получены способом, описанным в Immunogenetics (25:1-6, 1987) и т.д. Эти способы также могут быть использованы для экспрессии антигенов. Для каждого HLA-антигена, соответственно, могут быть созданы отдельные клеточные линии таким образом, что каждая клеточная линия может экспрессировать один HLA-антиген. При создании более 100 клеточных линий охватываются все человеческие HLA-антигены. После клонирования, размножения и заморозки, соответственно, могут быть получены клеточные линии, которые стабильно экспрессируют определенные человеческие HLA- и mH-антигены.

3. Клеточные линии, содержащие человеческие HLA- и mH-антигены, также могут быть получены согласно следующему способу:

3.1 В качестве опухолевых клеточных линий были выбраны и использовались человеческие клеточные линии, для которых известно, что они либо экспрессируют, либо не экспрессируют человеческий HLA- и/или mH-антиген, такие как Raji (коммерчески доступная от компании АТСС), U937 (коммерчески доступная от компании АТСС), К562 (коммерчески доступная от компании АТСС) и опухолевая клеточная линия SP2/0 мышиного асцита. Отбирали В-клетки, содержащие известный HLA-антиген(антигены) в периферической крови (Abe и др. J Immunol Methods, 90: 111-123) (Principles and techniques of culture in vitro) (Xue Qingshan, Science Publishing House, 2001, издание 1), (SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY) (изданная Barbara B. Mishell and Stanley M. Shiigi W.H. Freeman and Company, San Francisco, 1980) и 〈Concise Immunology Techniques〉 (Zhu Zhengmei and Liu Hui, Science Publishing House, July 2002, издание 1), затем добавляли бактериальный липополисахарид (LPS) (SIGMA) до его конечной концентрации 2-25 мкг/мл. Смесь из фактора роста В-клеток (BCGF) (созданную самими авторами, см. 3.2), античеловеческих IgM (компании Sigma), митогена лаконоса (PWM) (компании Sigma) (конечная концентрация составила 1-25 мкг/мл) и протеина А стафилококка (компании Sigma) (конечная концентрация 1/1000-1/10000) инкубировали в течение 2-3 недель. Затем клетки Raji, U937 или К562 сливали с человеческими мононуклеарными клетками с известным антигеном, которые были стимулированы смесью из фактора роста В-клеток (BCGF), античеловеческого IgM, протеина А стафилококка, бактериального липополисахарида и митогена лаконоса (PWM) в течение 2-3 недель, для получения иммортализованной клеточной линии, которая может экспрессировать определенный вид(виды) HLA-антигена при помощи технологии, описанной в "Techniques of Monoclonal Antibody" (Science and Technlolgy, Publishing House in Shaanxi Province, под редакцией Xu Zhikai, China, January, 1992, издание 1). Таким образом, были созданы клеточные линии, которые могут экспрессировать различные комбинации HLA-антигенов. Тем самым было создано множество различных клеточных линий, содержащих почти все человеческие HLA-антигены.

3.2 Создание линии В-клеток: см. "Principles and techniques of culture in vitro" (Xue Qingshan, Science Publishing House, 2001, edition 1).

1) Получение лимфоцитов: у пациента отбирали периферическую кровь с известными HLA-антигенами, добавляли гепарин (компании Sigma) для антикоагуляции, выделяли мононуклеарные клетки, используя раствор для отделения лимфоцитов (компании Sigma), готовили суспензию (концентрация: 1×10⁶ клеток/мл) в среде RPMI-1640 (компании Gibco), содержащей 10% FCS, инкубировали клетки во флаконе для клеточной культуры в течение 4-8 часов, встряхивали флаконы для получения суспендированных клеток, центрифугировали суспензию в течение 10 мин при 1000 об/мин, и собирали преципитаты, которые представляли собой очищенные лимфоциты.

2) Получение супернатанта культивированных BCGF: получали суспензию лимфоцитов (концентрация: 2×10⁶ клеток/мл) в среде RPMI-1640 (компании Gibco), содержащей 1% FCS (компании Gibco), в суспензию добавляли РНА до конечной концентрации 2 пкг/мл, помещали суспензию в культуральный флакон, инкубировали флакон в инкубаторе при влажности насыщения и 5% СО₂ при 37°С в течение 3-4 дней, собирали культуру в центрифужную пробирку, центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин при 4°С, собирали супернатант и хранили его при -20°С. Супернатант представлял собой необработанные BCGF.

3) Получали суспензию лимфоцитов (концентрация 1×10⁶ клеток/мл) в среде RPMI-1640 (компании GIBCO), содержащей 10% FCS, в суспензию добавляли фрагмент античеловеческого IgM F(ab)₂ (компании Sigma) до конечной концентрации 20 мкг/мл, в суспензию добавляли необработанные BCGF до конечной концентрации 10% и в суспензию добавляли бактериальный липополисахарид (LPS) (SIGMA) до конечной концентрации 2-25 мкг/мл.

4) В каждую лунку 24-луночного планшета добавляли по 1 мл клеточной суспензии. Клетки инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37°С. Половину объема культуральной среды обновляли каждые 3-4 дня, т.е. из лунок удаляли по 0,5 мл суспензии и затем добавляли новую культуральную среду, содержащую фрагмент античеловеческого IgM F(ab)₂ (компании Sigma) (20 мкг/мл), необработанные BCGF (10%) и бактериальный липополисахарид (LPS) (SIGMA) (конечная концентрация 2-25 мкг/мл). Спустя 3-5 недель, когда клоны становились больше, клетки переносили в культуральные флаконы и продолжали культивировать. Затем создавали линию В-клеток с известными HLA-антигенами.

5) Таким образом, были созданы клеточные линии, которые могут экспрессировать различные комбинации HLA-антигенов. Было создано множество клеточных линий, содержащих практически все человеческие HLA-антигены.

4. Клеточные линии, содержащие человеческий HLA-антиген и mH-антиген, также могут быть получены при помощи следующего способа: в качестве субъектов были выбраны люди, у которых не было одинаковых HLA-антигенов или у которых совпадало с другими лишь незначительное количество типов HLA-антигенов. У этих людей отбирали периферическую кровь; из нее создавали линии В-клеток согласно способу 1; эти клеточные линии использовали в качестве векторов, и для экспрессии тех HLA-антигенов и mH-антигенов, которые не могли быть экспрессированы этими клеточными линиями, использовали способы генной инженерии (как описано в способе 2). По существу, можно использовать меньшее количество клеточных линий для экспрессии большего количества антигенов, тем самым экспрессируя все человеческие HLA-антигены и mH-антигены при помощи минимального количества клеточных линий. Согласно этой стратегии необходимо было создать только несколько клеточных линий, чтобы экспрессировать все 18 DR-антигенов, обнаруженных на клеточной поверхности до настоящего времени, если в качестве векторов антигенов использовать клеточную линию Raji (коммерчески доступную от компании АТСС) или клеточную линию Daudi (коммерчески доступную от компании АТСС), которые могут экспрессировать больше HLA-II-антигенов.

5. Культиваровали и размножали клетки или клеточные линии (экспрессирующие все человеческие HLA-антигены), полученные при помощи описанных выше способов или при помощи других способов, таких как получение клеток или клеточных линий непосредственно из селезенки/периферической крови человека или животных. Затем клетки смешивали и разрушали, используя стерилизованную дистиллированную воду и инкубируя при 37°С в течение 0,5-2 часов. Когда клетки были разрушены полностью, для преципитации клеточных мембран в течение 20 минут использовали высокоскоростную центрифугу (3000-20000 g) с охлаждением. Супернатант удаляли, а преципитат (клеточные мембраны) лиофилизировали и хранили для дальнейшего использования. При использовании преципитат разбавляли средой для клеточных культур до разной концентрации в зависимости от задачи для получения единичного HLA-антигена или смеси конкретных HLA-антигенов. Фактически конкретный HLA-антиген переносится на липидном тельце.

6. HLA-антигены, используемые в настоящем изобретении, также могут быть растворимыми антигенами. Растворимые антигены могут быть получены следующим способом: вектор, сконструированный по способу 2, может экспрессировать HLA-антигены в человеческих клетках, прокариотических клетках или других эукариотических клетках (таких как дрожжи). Полученные таким образом HLA-антигены, не важно, каким способом, могут быть использованы непосредственно как антигены после фиксации в 10% формальдегиде и промывки. В качестве альтернативы, HLA-антигены могут быть получены при помощи обычной аффинной хроматографии (например, аффинная колонка, приготовленная с анти-В2-микроглобулиновыми антителами (Forth Military Medical University) или анти-HLA-антителами типа I или типа II (Forth Military Medical University)) или другими способами очистки белка. Очищенный HLA-антиген, полученный таким образом, может быть использован в дальнейших исследованиях.

7. Приготовление специфического антигена патогенного микроорганизма: приготовление различных патогенов, таких как вирус кори, вирус ветряной оспы и Mycobacterium tuberculosis, можно найти в публикациях «Principles and Techniques of Culture in vitro»(Xue Qingshan, Science Publishing House, 2001, edition 1); «Diagnosis and Experimental Virology» (Zhengzhou University Publishing House, 2002, edition 1, edited by Yang Zhanqiu, Liu Jianjun, Xiao hong. Ding Xiaohua); «Experimental Virology in Medical Use» (Du Ping. Chinese PLA Medical Publishing House, 1985, edition 1); «Modern Phthisiology» (Chinese PLA Medical Publishing House, 2000, edition 1, edited by Zhang Dunrong) и т.п. Патогенные микроорганизмы культивировали in vivo или in vitro согласно их росту и репродуктивным характеристикам и очищали, используя соответствующий способ. Очищенные или практически очищенные патогены могут быть использованы как антигены после дополнительной обработки облучением ⁶⁰Со и инактивации 0,4-40 г/л формальдегидом, глутаральдегидом, неионным детергентом или липидным растворителем (таким как диэтиловый эфир, хлороформ). Специфические антигены патогенных микроорганизмов также могут быть специфическими антигенами микроорганизмов, экспрессированными с использованием способов генной инженерии. Эти антигены могут быть экспрессированы в клетках человека или животных, прокариотических клетках или эукариотических клетках. Эти клетки могут быть использованы непосредственно как антигены. В качестве альтернативы, эти клетки могут быть использованы как антигены после очистки путем обычной аффинной хроматографии или при помощи других технологий очистки белков.

8. Антигены, используемые в настоящем изобретении, также могут быть гетероантигенами в случае гетерогенной трансплантации, такими как антиген свиньи-донора (включая все виды трансгенных свиней и инбредные линии) или антиген мыши, антиген крысы, антиген морской свинки и т.п. Для экспрессии вышеупомянутых антигенов, которые могут быть использованы в качестве предназначенных для тестирования антигенов во время гетерогенной трансплантации, могут быть созданы различные клеточные линии

9. Антигены согласно изобретению могут быть созданы в лаборатории или могут быть приобретены на коммерческой основе у компаний. Коммерчески доступными являются, например, антигены вируса кори, вируса эпидемического энцефалита В, вирусов полимиелита, дифтерийной палочки.

В настоящем изобретении может быть использован широкий спектр антигенов, включая все "чужеродные" субстанции, которые могут специфически активировать лимфоциты организма. По существу, антигены могут быть использованы для детектирования наличия специфических лимфоцитов, активированных такими антигенами.

Для детектирования наличия специфических лимфоцитов, активированных антигенами, могут быть использованы все антигены, полученные вышеупомянутыми или другими способами (включая использование единичных или смешанных антигенов, нерастворимых антигенов или растворимых антигенов, аллогеных антигенов или гетероантигенов, человеческого HLA-антигена или антигенов мыши, крысы, свиньи и т.п., антигенов патогенных микроорганизмов, таких как бактерии и вирусы, а также всех видов антигенов вакцин для человека), при условии, что они могут специфически активировать лимфоциты в организме.

Полученные антигены, которые могут быть экспрессированы в клетках человека или животных, клеточных стенках бактерий или оболочках/капсидах вирусов, необходимо инактивировать обработкой митомицином или 0,1-10% формальдегидом или неионным детергентом, а также липидным растворителем (таким как ацетон, диметилбензол, хлороформ и т.п.) перед возможным использованием в качестве образца тестируемого антигена. При некоторых обстоятельствах антигены могут быть непосредственно использованы в качестве образца тестируемого антигена без дополнительной обработки. Белковые антигены (растворимые антигены), очищенные аффинной хроматографией или другими способами очистки белков, и целевые антигены, абсорбированные на липосоме, могут быть непосредственно использованы в качестве тестируемых антигенов.

Антигены, полученные в стерильных условиях, могут быть использованы по отдельности или в различных комбинациях (согласно различным целям). Антигены инкубировали с мононуклеарными клетками периферической крови субъектов, полученными способами с использованием обычной среды для отделения лимфоцитов для приготовления мононуклеарных клеток. Среда, используемая для разбавления мононуклеарных клеток, дополнительно к телячьей сыворотке или фетальной телячьей сыворотке, необходимой для обычного культивирования клеток (также может быть использована коммерчески доступная среда без сыворотки), содержала антитела, нейтрализующие активность цитокинов и/или цитокины-ингибиторы клеточной пролиферации, и иммуносупрессивный агент и/или противораковые лекарственные препараты. Иммуносупрессивные агенты и/или противораковые лекарственные препараты включают програф (FK506), циклоспорины, например, циклоспорин А, циклоспорин С, циклофосфамид, азатиоприн, рапамицин, RS-61443 (микофенолят мофетил, ММ, молекулярная формула: C₂₄H₁₁NCLO₇) (который представляет собой производное эфира микофенольной кислоты, МРА, молекулярная формула C₁₇H₁₁O₆), BQR (6-фтор-2-3-метил-1-4-хинолиновая кислота), дезоксиспергуалин, иммуносупресант, секретируемый человеческой клеточной линией JM острой Т-лимфоцитарной лейкемии, гормон коры надпочечников (например, медрат, преднизон, гидрокортизон, дексаметазон и др.), ингибитор топоизомеразы (например, камптотецин (САМ), этопозид (VP-16), алкилирующий агент (например, цисплатин, кариолизин, алкеран, хлорамбуцил, кармустин и т.п.)), антиметаболит (метотрексат, цитозин-арабинозид, ингибитор тимидилатсинтетазы, ди-N-тетрагидрофолиевая кислота и т.п.), производные ретиноевых кислот - витамина А (например, полностью транс-ретиноевая кислота, пальмитат ксантопсин, аммониевая соль 4-N-гидроксибензол-ретиноевой кислоты) и другие лекарственные препараты, которые потенциально способны индуцировать иммуносупрессивную функцию или индуцировать апоптоз опухолевых клеток. Функцией вышеупомянутых антигенов является подавление активации специфических активированных лимфоцитов, нацеленных на антигены, или индуцирование активного апоптоза специфических активированных лимфоцитов, нацеленных на антигены; функцией антитела, нейтрализующего активность цитокинов, и/или цитокинов-ингибиторов клеточной пролиферации является индукция пассивного апоптоза активированных лимфоцитов; функция вышеупомянутых иммуносупрессивных лекарственных препаратов заключается в том, чтобы сделать результаты теста более стабильными, точными, чувствительными и легко сравнимые с контролем.

Дозирование или концентрации иммуносупрессивных агентов и противораковых лекарственных препаратов в культуральной среде могут быть различными. Концентрации или дозирование могут быть подобраны по желанию. В общем случае концентрация примерно в 1000 раз больше наименьшей концентрации лекарственного препарата (минимальное значение) в крови, приведенной в руководстве по применению (предел дозирования составляет приблизительно 0,001 нг - 100 мкг/мл), например, пределы дозирования FK506 составляют 0,001 нг - 10 мкг/мл (предпочтительно 0,001 нг - 100 мкг/мл); циклоспорина А составляют 0,001 нг - 10 мкг/мл (предпочтительно 0,001 нг -1 мкг/мл). Оптимальная концентрация представляет собой самую низкую концентрацию лекарственного препарата, при которой можно достичь наилучшей повторяемости результата тестирования. Иммуносупрессивные агенты и противораковые лекарственные препараты могут применяться по отдельности или в сочетании в зависимости от цели.

Нейтрализующие антитела против цитокинов, стимулирующих клеточную пролиферацию, включают в себя антитела против интерлейкинов 1, 2, 4, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 и 23, интерферонов (-α, β, ω, γ), колониестимулирующего фактора гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF), колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), фактора стволовых клеток (SCF), тромбопоэтина (ТРО), фактора роста нервов (NGF) и все другие нейтрализующие антитела против цитокинов, вызывающих активацию или пролиферацию мононуклеарных клеток; цитокины, которые могут индуцировать апоптоз или ингибировать активацию или пролиферацию мононуклеарных клеток (например, лимфоцитов или моноцитов), включают в себя IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, трансформирующий фактор роста β (TGF-β), интерферон-γ, фактор некроза опухоли (TNF), CTLA4 и другие цитокины или слитые белки-цитокины, например, CTLA4.Ig (слитый белок антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-клетками (CTLA4), и Fc-фрагмент человеческого иммуноглобулина G (IG)) и т.п.

Нейтрализующее антитело в настоящем описании относится к антителам, обладающим эффектом ингибирования биологической активности цитокинов. Нейтрализующие антитела могут ингибировать биологическую активность цитокинов, которые в противном случае могут активировать или стимулировать клеточную пролиферацию, тем самым ингибируя биологические функции цитокинов.

Функцией нейтрализующих антител и цитокинов-ингибиторов является облегчение эффекта специфического ингибирования специфического антигена на специфических активированных лимфоцитах, т.е. комбинированного эффекта специфического антигена, нейтрализующих антител и цитокинов-ингибиторов, может ингибировать активность антиген-специфических активированных лимфоцитов и мононуклеарных клеток. Поскольку другой цитокин функционирует по-другому, а единицы активности или титр цитокинов или нейтрализующих антител против цитокинов, производимых различными компаниями, могут различаться, то концентрации нейтрализующих антител в культуральной среде могут сильно различаться, в пределах 1 мкг - 10 мг/мл. Подходящая концентрация должна представлять собой такую концентрацию, при которой можно получить воспроизводимые результаты тестирования с высокой чувствительностью. Концентрации цитокинов-ингибиторов вычисляют в виде их единиц активности с конечной концентрацией в пределах 0,01-1000 ед.активности/мл (обычно 0,1-50 ед.активности/мл). Оптимальной концентрацией должна быть концентрация, при которой можно получить наилучшую чувствительность и точность результатов тестирования.

Существует много видов иммуносупруссивных агентов, антител, нейтрализующих активность цитокинов, и цитокинов, которые могут ингибировать активность лимфоцитов или моноцитов. Механизмы их функционирования сложны. Один или несколько факторов могут быть выбраны и использованы по отдельности или в сочетании при тестировании для достижения чувствительного, точно