Удаление плазмин(оген)а из белковых растворов

Удаление плазмин(оген)а из белковых растворов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники

Данное изобретение относится к использованию смолы и созданию способа для специфического удаления плазмин(оген)а и его производных из белковых растворов, причем полученный белковый раствор можно использовать для внутривенного введения и для местных применений, то есть в виде матриксного носителя для пролонгированного высвобождения и заживления ран, или в виде индивидуального активного компонента, или в сочетании с другими фармацевтическими соответствующими лекарственными средствами. Удаление плазмин(оген)а позволяет сохранять целостность и функцию белкового раствора во время более длительных периодов инкубации. Данное изобретение также относится к получению высокоочищенного плазмин(оген)а для терапевтического применения.

Смежная область

Плазмин(оген) или его активная молекула плазмин (в дальнейшем плазмин(оген)) очень часто загрязняет белковые растворы, особенно растворы, экстрагированные из жидкостей или органов животных. С признанием плазмин(оген)а в качестве стабильного фармацевтического продукта присутствие плазмин(оген)а в белковом растворе представляет многократную опасность, обусловленную известной протеолитической активностью молекулы в отношении различных белков и пептидов по пептидным связям аргинила и лизила (Weinstein M.J., Doolittle RF. Differential specificities of the thrombin, plasmin and trypsin with regard to synthetic and natural substrates and inhibitors RF Biochim Biophys Acta. 1972. 258: 577-90 и Ling CM, Summaria L, Robbins KC. Mechanism of formation of bovine plasmin(ogen) activator from human plasmin. J. Biol. Chem. 1965. 240: 4212-B) и основных аминокислот, его стимулирующей активностью в отношении различных тканей, особенно ткани центральной нервной системы, и его ролью в связывании (Chen ZL, Strickland S. Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmincatalyzed degradation of liminin. Cell. 1997. 91: 917-25) и, вероятно, поддержании прионов в крови млекопитающих (Fischer MB, Roeckl C, Parizek P, Schwarz HP. Aguzzi A Binding of disease associated prion protein to plasmin(ogen). Nature. 2000. 408: 479-83).

Разработано несколько хроматографических способов очистки плазмин(оген)а из белковых растворов и, следовательно, удаления плазмин(оген)а из белкового раствора.

Упомянутые способы по существу базируются на двух принципах. Первая группа способов основана на нескольких последовательных стадиях очистки, в которых используют различную растворимость, изоэлектрическую точку или распределение по размеру молекул (Alkjaerisig N. The purification and properties of human plasmin(ogen). Biochem. J. 1963, 93: 171-182). Так как их основной целью было очистить плазмин(оген), упомянутые способы полностью изменяли состав белкового раствора. Вторая группа способов основана на одностадийной аффинной очистке. Очистка базируется на связывании плазмин(оген)а с различными синтетическими лигандами ω-аминокарбоновых кислот, которые могут связываться по лизинсвязывающим участкам на тяжелой цепи плазмин(оген)а. Названные участки, состоящие из 5 дисульфидных мостиков тройной петли с гомологией внутренних последовательностей, известных как крингл-домены плазмин(оген)а, локализованных на NH₂-конце тяжелой цепи плазмин(оген)а и на большом расстоянии от каталитического центра, расположенного на СООН-конце легкой цепи, связывают фибрин(оген). Другой возможной перспективой для аффинной хроматографии является связывание плазмин(оген)а через каталитический центр, потенциально менее специфическое связывание, так как он может связывать многие белки, такие как сериновые протеазы, имеющие подобное или более низкое сродство к пептидным связям аргинила или лизила и основным аминокислотам. Кратко можно заключить, что, по существу, плазмин(оген)-аффинную хроматографию проводят с помощью определенного лиганда, который химически и по ионогенности напоминает ω-аминокарбоновую кислоту или субстрат каталитического центра плазмина. Лиганд связывается со смолой через соответствующий связывающий мостик или линкер. Однако идеальная аффинная смола для удаления плазмин(оген)а по существу не является той смолой, которую создавали как идеальную для очистки плазмин(оген)а. Такие смолы должны содержать лиганд, который связывает плазмин(оген) с высоким сродством и имеет очень низкое сродство к другим белкам, таким как другие сериновые протеазы, и особенно очень низкое сродство к фибриногену, который является главным белком во фракции I Кона (Cohn) плазмы или в криопреципитатах. Также важно, что удаление плазмин(оген)а с использованием данной аффинной хроматографии может быть проведено с помощью различных буферов и не ограничено определенным буфером, который может нарушать стабильность и целостность тех белков в растворе, которые, в отличие от плазмино(оген)а, и представляют интерес.

Антифибринолитическая активность (способность ингибировать высокоаффинное связывание плазмин(оген)а с фибриногеном) ω-аминокарбоновых кислот зависит от присутствия свободной амино- и карбоксильной группы и от расстояния между СООН-группой и атомами углерода, к которым присоединяется NH₂-группа (Markwardt 1978), такая как группа ε-аминокапроновой кислоты (ЕАСА) и пара-аминобензамидина (PAMBA). Сравнение антифибринолитических активностей ЕАСА и PAMBA показало, что последний является приблизительно в три раза более активным. Shimura et al. (1984) предложили смолу, в которой пара-аминобензамидин связан с микрочастицами гидрофильного винилполимера через связующий (линкерный) фрагмент. С использованием описанной смолы Shimura et al. удалось разделить плазмин и плазмин(оген) методом аффинной хроматографии высокого разрешения. Факты, что плазмин(оген) невозможно элюировать с помощью одной только 6-аминогексаноевой кислоты и что 3 М мочевина должна быть введена в элюционный буфер, указывают на двухцентровое взаимодействие плазмина с названным иммобилизованным лигандом, то есть с лизинсвязывающими участками на тяжелой цепи и с каталитическим участком на легкой цепи. Это может объяснить данные, полученные другими исследователями, что пара-аминобензамидин удаляет также некоторые другие белки. Другую смолу, лизин-смолу, производят и применяют для аффинной очистки плазмин(оген)а. Однако антифибринолитическая активность лизина очень низка, а следовательно, также и его сродство связывания. Он также связывается с другими белками и его специфичность зависит от буфера.

Moroz LA. Gilmore NJ в Fibrinolysis in normal plasma and blood: evidence for significant mechanisms independent of the plasminogen-plasmin system, Blood, 1976, 48, 531-45, описывают получение плазмы, не содержащей плазмин(оген), методом аффинной хроматографии. На основании использованных методов авторами сделано сообщение относительно данных, указывающих, что процессы, которые в высшей степени способствуют образованию фибринолитического фермента плазмина, играют в лучшем случае минорную роль в спонтанной или базальной фибринолитической активности, измеряемой в нормальной плазме человека. Транексамовую кислоту используют вместе с другими ингибиторами протеаз в качестве ингибиторов плазмина для измерения фибринолитической активности. Для получения плазмы, не содержащей плазмин(оген), используют способ Deutsch and Meltz, Science 170: 1095-1096, 1997.

Iwamoto в Thrombos. Diathes. Heamorrh. (Stuttg.), 1975, 33, 573 описывает специфическое связывание транексамовой кислоты с плазмином. Хотя транексамовая кислота идентифицирована как эффективный лиганд плазмина, показано, что антифибринолитическое действие транексамовой кислоты является результатом не только связывания плазмин(оген)а, а также увеличения кооперации природных антиплазминов. Поэтому следует заключить, что связывание транексамовой кислоты с твердым носителем будет удалять из плазмы не только плазмин(оген), но также и природные антиплазмины. Также следует предположить, что транексамовые кислоты могут вызывать образование агрегатов (конгломератов) с ингибиторами плазмина. Это понимание базируется на различиях, которые могут быть установлены при сравнении антифибринолитических активностей ε-аминокапроновой кислоты и транексамовой кислоты, приводящих к 98% и 91% ингибированию плазмы, стимулированной урокиназой, по сравнению с плазмой, которая получена из перорально гепаринизированной крови (65 и 39% для ε-аминокапроновой кислоты и транексамовой кислоты соответственно - ср. таблицы 2 и 7 в статье Moroz et al.). Следует предположить, что вследствие их высокого коэффициента связывания транексамовая кислота и ε-аминокапроновая кислота являются хорошими кандидатами на высокоаффинные лиганды. Однако также следует предположить, что названные лиганды будут блокировать аффинную колонку в результате связывания плазмина и комплексов плазмин-ингибитор.

Наконец, в качестве ближайшего аналога заявленного в настоящем изобретении способа удаления плазминогена из смеси, содержащей фибриноген и плазминоген, можно указать авторское свидетельство SU 1727839 A1 (Чупов В.В., Николайчик В.В., Бычко Г.Н. и соавт., от 23.04.1992). В соответствии с указанным документом плазминоген из плазмы крови удаляли путем пропускания последней через колонку с равновесно набухшим сополимером акриламида, N,N'-метиленбисакриламида и метакрилоил-L-лизина. В результате использования такого сорбента с ковалентно иммобилизованным L-лизином получали 100% очистку плазмы от плазминогена, а потери лизина составляли менее 0,3%. По сравнению с этими результатами предлагаемый в настоящем изобретении способ удаления плазминогена позволяет расширить технические возможности очистки жидких смесей природного происхождения, содержащих плазминоген и фибриноген, от плазминогена с сохранением при этом исходного количества фибриногена в смеси.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На чертеже представлен градиентный электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) (5-12% полиакриламид) 7 мкг белков, элюированных двумя способами (описаны в разделе Материалы и методы), с трех различных смол - ТЕА-сефарозы, Lys-Ceramic Hyper DF и Lys-сефарозы 4В. Дорожки: 1 - Glu-плазминоген; 2 - фибриноген; 3 - альбумин; 4 - иммуноглобулин G; 5 - стандарт молекулярных масс; элюционные пики: 6 - способа с использованием ТЕА; 7 - способа 2 с использованием ТЕА; 8 - способа 1 с использованием лизин-Ceramic Hyper D; 9 - способа 1 с использованием лизин-сефарозы; 10 - способа 1 с лизин-Ceramic Hyper D; 11 - способа 1 с использованием лизин-сефарозы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение базируется на данных, что неподвижная аминокислота, как было установлено, способна специфически связывать плазмин(оген). В контексте описания изобретения выражение «специфически связывать» означает, что из смеси, содержащей белки, такие как плазмин(оген) и фибриноген, в основном удаляется плазмин(оген), тогда как фибриноген удерживается в смеси почти без изменений. Предпочтительно удаляют, по меньшей мере, от 85 до 99% плазмин(оген)а и, по меньшей мере, 85% фибриногена остается в смеси. Более предпочтительно удаляют, по меньшей мере, от 98,0% до 99,9% плазминогена или сохраняют 95%-99% фибриногена.

Аминогруппа аминокислоты и карбоксильная группа аминокислоты находятся на расстоянии около 6-8 Ангстрем, предпочтительно около 7 Ангстрем, неподвижная аминокислота ковалентно связана с носителем через аминогруппу аминокислоты. Особенно предпочтительными являются транексамовая кислота в ее трансконфигурации и 4-аминометилбицикло-[2.2.2.]-октан-1-карбоновая кислота (EMBOCA).

Неожиданно было установлено, что, во-первых, ε-аминокапроновая кислота не работает так, как транексамовая кислота, и что как только транексамовая кислота связывается с твердой поверхностью, она проявляет всю свою повышенную плазмин(оген)-связывающую способность (так называемая кооперативность), а смола удаляет из плазмы или из продуктов плазмы только плазмин(оген). Если ε-аминокапроновую кислоту присоединяют к колонке, ее повышенная активность в отношении плазмин(оген)а еще остается прежней, но тем не менее она связывает фибриноген и другие белки из плазмы, тогда как согласно изобретению полностью исключается повышенная активность транексамовой кислоты в отношении плазмин(оген)а. Однако сродство смолы с транексамовой кислотой к плазмин(оген)у не изменяется.

Ригидную аминокислоту присоединяют к соответствующему связывающему мостику, в частности, более длинному, чем 3 углеродных атома, а носитель и аффинный материал могут удалять плазмин(оген) из смеси, содержащей белки, без дальнейшего изменения состава белкового раствора. Удаление можно проводить в присутствии различных буферов. Способ изобретения также подходит для получения чистых фракций плазмин(оген)а после элюции с аффинного носителя.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к созданию способа специфического удаления или выделения плазмин(оген)а в присутствии фибриногена из смеси, содержащей плазмин(оген), в результате контакта смеси с неподвижной аминокислотой, в которой аминогруппа аминокислоты и карбоксильная группа аминокислоты находятся на расстоянии около 6-8 Ангстрем, предпочтительно около 7 Ангстрем, а неподвижная аминокислота ковалентно связана с носителем через аминогруппу аминокислоты.

Предпочтительно в способе согласно изобретению смесь выбирают из группы, состоящей из жидкостей организма, таких как кровь; из фракций крови, криопреципитата, клеточных культур, экстрактов тканей животных, таких как легкие быка, бычий кишечник, или экстракты костей животных; желатина, бычьего сывороточного альбумина, а также несмешивающихся с водой жиров животного происхождения, таких как ланолин (РС-фосфатидилхолин).

Способ согласно изобретению можно использовать для получения высокоочищенного плазмин(оген)а из соответствующих смесей. После контакта смеси, например, с хроматографирующим веществом, связанным с ригидной аминокислотой, плазмин(оген) можно элюировать с твердого аффинного вещества. Как таковые в данном случае также можно применять известные принципы твердофазной экстракции. Плазмин(оген) можно элюировать раствором, содержащим лиганд, который конкурирует со связывающими участками ригидной аминокислоты, например транексамовой кислоты, за плазмин(оген)овый белок. Такими лигандами обычно являются ε-аминокислоты, предпочтительно лизин. Например, лизин можно применять в концентрациях от 0,85 до 0,99% мас. Также возможно использование других концентраций, особенно когда ионная сила элюционной среды уравновешена другими ингредиентами, например электролитами.

Плазмин(оген), элюирующийся с твердой фазы, может быть освобожден от элюционного буфера по способу, при котором буферные компоненты экстрагируют, например, диализом. Полученный согласно способу данного изобретения плазмин(оген) характеризуется очень высокой степенью чистоты. Исключительное свойство становится очевидным из следующих данных:

Суммарная таблица 1Сравнение удельной активности, степени очистки и выхода плазмин(оген)а из криоистощенной FFP-плазмы в предпочтительных условиях нанесения и элюции для каждой из смол
Использованнаясмола	Способ	Удельная активность(мг плазмин(оген)а/мг белка)	Степеньочистки	Выход(%)
ТЕА-сефароза 4В	2	0,794	567	91,6
Лизин-Ceramic Hyper DF	2	0,444	444	10,9
Лизин-сефароза 4В	1	0,121	101	11,6
Суммарная таблица 2: Сравнение удаления плазмин(оген)а из криоистощенной FFP-плазмы в предпочтительных условиях нанесения для каждой смолы
Использованная смола	Способ	Удаление (%)
ТЕА-сефароза 4В	1 и 2*	99,5
Лизин-Ceramic Hyper DF	1	54,6
Лизин-сефароза 4В	1	58,0
*Оба способа являются идентичными вплоть до сбора несвязанного пика, включая и саму эту стадию.

Как можно видеть из суммарной таблицы, когда коммерчески поставляемые смолы с иммобилизованными лизиновыми лигандами и ТЕА-смолу использовали при оптимизированных условиях хроматографии, выход и удельная активность плазмин(оген)а были выше в случае ТЕА-смолы (суммарная таблица 1). Также достойно внимания то, что смола ТЕА оказалась значительно более эффективной при удалении плазмин(оген)а (как показали при исследовании Glu-плазмин(оген)а) из криоистощенной плазмы, чем лизин-смола (суммарная таблица 2).

Чистоту элюатов оценивали с помощью SDS-гель-электрофореза. Элюаты с трех разных смол (ТЕА-сефарозы, Lys-Ceramic Hyper DF и Lys-сефарозы 4В) подвергали SDS-PAGE с использованием 5-12% градиента акриламида и при нанесении 7 мкг белка на дорожку. Полученный гель, окрашенный кумасси голубым, изображен на чертеже.

На чертеже представлен градиентный гелевый SDS-PAGE (5-12% полиакриламид) белков по 7 мкг, элюированных двумя способами (описано в разделе Материалы и методы) с трех разных смол - ТЕА-сефарозы, Lys-Ceramic Hyper DF и Lys-сефарозы 4В. Дорожки: 1 - Glu-плазмин(оген); 2 - фибриноген; 3 - альбумин; 4 - иммуноглобулин G; 5 -стандарт молекулярных масс; Элюционные пики: 6 - способа с использованием ТЕА; 7 - способа 2 с использованием ТЕА; 8 - способа 1 с использованием лизин-Ceramic Hyper D; 9 - способа 1 с использованием лизин-сефарозы; 10 - способа 1 с лизин-Ceramic Hyper D; 11 - способа 1 с использованием лизин-сефарозы.

Полученные белковые зоны и чистота продукта хорошо коррелировали с удельной активностью полазмин(оген)а, которая указана в суммарной таблице 1. Данные показывают, что применение ТЕА-сефарозы дает высокоочищенный плазмин(оген) лишь с минорным загрязнением альбумином. Очевидно, что по клиническим критериям никакой дальнейшей очистки не требуется для применения этого продукта.

Поэтому содержащая плазмин(оген) композиция также является предметом изучения данного изобретения.

Предметом рассмотрения данного изобретения также является носитель, ковалентно связанный с ригидной аминокислотой, причем аминогруппа аминокислоты и карбоксильная группа аминокислоты находятся на расстоянии приблизительно 6-8 Ангстрем, предпочтительно приблизительно 7 Ангстрем.

Предпочтительным для осуществления способа данного изобретения носителем является хроматографическое вещество, которое способно связывать ригидную аминокислоту, в которой аминогруппа аминокислоты и карбоксильная группа аминокислоты находятся на расстоянии около 6-8 Ангстрем, предпочтительно около 7 Ангстрем. Расстояние между аминогруппой и карбоксильной группой, по существу, поддерживается постоянным жесткой структурой аминокислоты. Жесткость аминокислоты может быть получена с помощью алициклических колец, предпочтительно циклогексанового кольца, причем амино- и карбоксильная группы расположены в 1,4-положении алициклического кольца. Также к области, охватываемой данным изобретением, относятся ароматические системы, например, замещенные бензойные кислоты или анилин-замещенная уксусная кислота.

Согласно изобретению носитель предпочтительно связывают с аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из транексамовой кислоты и ЕМВОСА.

Хроматографическим веществом, которое применяют согласно способу данного изобретения, является, например, гидрофильное вещество, такое как агароза, целлюлоза, стекло с регулируемой пористостью, силикагели, декстраны или органический синтетический полимер, такой как полимер на основе полиакриламидов, полистиролов. Обычные вещества поставляются коммерчески под торговыми названиями сефакрил® (Pharmacia, Sweden), ультрагель® (Biosepara, France), TSK-гель Toyopearl® (Toso Corp., Japan), HEMA (Alltech Ass. (Deer-field, Il, USA), Eupergit® (Rohm Pharma, Darmstadt, Germany). Также можно использовать материалы, созданные на основе азлактонов (3M, St. Paul, Minn, USA). Особо предпочтительной является агароза® или сефароза®. Названные материалы поставляются коммерчески, например, фирмой Sigma, St. Louis.

В предпочтительном аспекте способ согласно изобретению осуществляют при использовании корпускулярного хроматографического материала из макрочастиц или монолитного блок-вещества. Корпускулярное вещество можно суспендировать в соответствующей среде, и полученную суспензию можно использовать, например, в хроматографической колонке. Однако способ согласно изобретению можно осуществлять порциями. Кроме того, полимеры могут быть использованы в виде корпускулярного вещества или также в форме мембран.

Транексамовую кислоту связывают с носителем предпочтительно через линкер, в частности бифункциональный линкер между носителем и транексамовой кислотой. Если применяют бифункциональный линкер, его можно выбрать из группы, состоящей из N-гидроксисукцинимида, DAPA, CNBr, эпокси, диаминодипропиламина (DADPA), 1,6-диаминогексана, янтарной кислоты, 1,3-диамино-2-пропанола, этилендиамина (EDA), TNB, пиридилсульфида, иодацетамида, активированного малеимидом носителя или их комбинаций.

Для осуществления способа согласно изобретению носитель предпочтительно модифицируют по фрагменту, который взаимодействует с первичными или вторичными аминогруппами.

В соответствии со способом согласно изобретению смесь инкубируют с носителем в течение достаточного периода времени, и после контакта смеси с носителем, связанным с транексамовой кислотой, элюируют нейтральным водным раствором, содержащим соли натрия, соли кальция, буферные соли. Впоследствии плазмин или плазмин(оген) можно элюировать водным раствором, содержащим достаточное количество лизина или эквивалента, который конкурирует с ковалентно связанной транексамовой кислотой.

Предметом изобретения является полученная из природных источников смесь, которая по существу свободна от плазмин(оген)а и плазмина.

В частности, смесью согласно изобретению является кровь, производное крови или фракция крови, криопреципитат.

Производным крови согласно изобретению является, в частности, фактор свертывания крови, полученный из плазмы, или смесь факторов свертывания крови, таких как FVIII, FIX, фибриноген, фибронектин, α₁-антитрипсин, антитромбин III, фактор фон Виллебранда, альбумин, иммуноглобулин.

Кроме того, носитель, содержащий ковалентно связанную транексамовую кислоту, также является предметом данного изобретения. Носитель согласно изобретению предпочтительно является хроматографическим веществом, более предпочтительно - гидрофильным хроматографическим веществом, таким как декстраны или органический синтетический полимер, такой как упомянутые выше. Наиболее предпочтительным носителем является агароза® или сефароза®, с которой связывается транексамовая кислота.

Хроматографический материал, который образует носитель, может быть корпускулярным веществом или монолитным блок-веществом. Последний описан в цитируемой работе Hermanson et al., (Hermanson GT, Mallia AK and Smith PK 1992 "Immobilization Affinity Ligand Techniques" pp. 454 Academic Press, Inc. San Diego, USA).

В другом предпочтительном аспекте согласно изобретению транексамовая кислота связывается с носителем через линкер между носителем и транексамовой кислотой. Благоприятно, когда носитель не имеет функциональных групп, способных ковалентно связывать транексамовую кислоту. В таком случае носитель сначала активируют, а затем вводят в реакцию с линкером, который способен связывать транексамовую кислоту. Спейсерные группы, или привязи, являются низкомолекулярными молекулами, которые применяют как промежуточные линкеры между носителем или матриксом и аффинным лигандом, который в соответствии с изобретением представляет собой аминокислоту, имеющую жесткую структуру и аминогруппу на расстоянии около 6-7 Ангстрем от карбоксильной группы. Предпочтительно спейсерные группы содержат две функциональные группы на обоих концах для легкого взаимодействия с лигандом и носителем. Обычно спейсерная группа представляет собой углеводородное соединение, имеющее на концах две функциональные группы. Один из двух концов ковалентно присоединяется к матриксу с помощью общепринятых или известных реакций. Второй конец ковалентно связывается с лигандом с помощью другого способа присоединения.

Предпочтительно линкером является бифункциональный линкер, такой как N-гидроксисукцинимид, DAPA, CNBr, эпокси, диаминодипропиламин (DADPA), 1,6-диаминогексан, янтарная кислота, 1,3-диамино-2-пропанол, этилендиамин (EDA), TNB, пиридилсульфид, иодацетамид, активированный малеимидом носитель или их комбинации.

Так как большинство активированных носителей поставляется коммерчески, может оказаться полезным начинать с носителя, модифицированного по фрагменту, который взаимодействует с первичными или вторичными аминогруппами.

Кроме того, способ согласно изобретению более подробно описан с использованием в качестве примера получения криопреципитата, по существу свободного от плазмин(оген)а, который может быть исходным материалом для многочисленных продуктов, полученных из крови.

Криопреципитат подвергают аффинной хроматографии с иммобилизованным лигандом, чтобы получить адсорбированную фракцию и неадсорбированную фракцию. Вещество, которое может быть элюировано из адсорбированной фракции, представляет собой плазмин(оген).

Иммобилизованный лиганд может быть любым аналогом, который может взаимодействовать с лизинсвязывающими участками плазмин(оген)а. Способ получения иммобилизованных лигандов, которые используют согласно изобретению, описан ниже. Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его.

ПРИМЕР 1: Иммобилизация различных лигандов ε-аминокарбоновых кислот.

Несколько лигандов ε-аминокарбоновых кислот в комбинации с различными спейсерами в нескольких смолах либо получали, либо покупали (если они коммерчески доступны), чтобы оценить удаление плазмин(оген)а из растворов, полученных из плазмы. В следующей таблице суммированы все изученные комбинации (номера смол внизу относятся к разделу, в котором описан ниже синтез для каждой комбинации):

Таблица 1
ЛигандЛинкер	Пара-бензамидин	Аргинин	Транексамовая кислота	ε-аминогексаноевая кислота	Лизин
N-гидроксиянтарная				Сефароза 4В(1)
DADPA	Агароза4% (2)	Агароза4% (3)	Агароза4% (4)
CNBr		Сефароза4В (5)	Сефароза4В (6)
Эпокси	Сефароза6В (10)	Сефароза6В (7)	Сефароза6В (8)		CeramicHyper DF(9)

1) Сложный N-гидроксисукцинимидный эфир ε-аминогексаноевой кислоты-сефароза 4В был произведен на фирме Sigma.

2) Изготовление пара-аминобензамидин-4% агарозы.

Следующий способ использовали для иммобилизации диаминодипропиламина (DADPA) на 4% агарозе (Pierce), реакция происходила на аминоконцевом связующем геле, который затем модифицировали ангидридом.

25 мл DADPA-агарозного геля промывали очищенной водой, а затем гель суспендировали в равном объеме очищенной воды. Суспензионную смесь медленно перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, добавляя к нему 2,5 г янтарного ангидрида. В конце перемешивания сукцинилированный гель последовательно промывали очищенной водой, 1 М NaCl и снова очищенной водой, чтобы удалить избыток непрореагировавшей янтарной кислоты.

Негативный тест с TNBS (Sigma) показал, что все амины DADPA были успешно блокированы янтарной кислотой.

Иммобилизованный сукцинилированный DADPA промывали 250 мл очищенной воды, затем избыток воды отсасывали, чтобы высушить до влажного осадка, и переносили в 500-мл химический стакан. Гель повторно суспендировали в 25 мл 0,1 М MES-буфера, рН 4,7 и медленно перемешивали, добавляя 0,25 г пара-аминобензамидина (Sigma) и 0,75 г EDC (Pierce). РН реакционной смеси поддерживали при 4,7 в течение 1 часа, непрерывно добавляя 0,5 М NaOH. Затем реакционную смесь оставляли на ночь при комнатной температуре при постоянном медленном перемешивании.

Гель последовательно промывали 0,5 л каждого из следующих компонентов: очищенной водой, 0,1 М ацетатом натрия, рН 4,7, 0,5 М бикарбонатом натрия и очищенной водой.

Иммобилизованный пара-аминобензамидин хранили до использования в 0,02% азиде натрия при 4°С.

3) Аргинин-4% агароза

Синтез аргинин-4% агарозы проводили в соответствии с вышеописанным способом для пара-аминобензамидин-4% агарозы (см. 2).

4) Транексамовая кислота (ТЕА)-4% агароза

Синтез транексамовой кислоты (ТЕА)-4% агарозы предпочтительно проводили в соответствии с вышеописанной процедурой для пара-аминобензамидин-4% агарозы (см. 2).

5) Аргинин-сефароза 4В

Следующий способ использовали, чтобы иммобилизовать аргинин или транексамовую кислоту на CNBr-сефарозе 4В (Pharmacia) в качестве связующего геля. Синтезы двух лигандов при двух различных концентрациях (10 ммоль или 0,01 ммоль/мл сухого геля) были одинаковыми, как указано в этом и следующем разделах (5-6).

2,5 г CNBr-активированной сефарозы 4В суспендировали в 50 мл 1 мМ HCl. Гель оставляли для набухания в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим 15-минутным промыванием 500 мл 1 мМ HCl на агломерированном стеклянном фильтре.

Аргинин растворяли в 12,5 мл связывающего буфера, 0,1 М NaHCO₃, pH 8,3, содержащего 0,5 М NaCl. Связывающий раствор, содержащий лиганд, смешивали с гелем в пластиковой пробирке с последующим вращением в течение ночи при 4°С.

В конце инкубации полученную смесь отмывали от избытка лиганда 10 гелевыми объемами связывающего буфера через агломерированный стеклянный фильтр. Белковый раствор промывали 3 циклами по 50 мл буфера при изменении значений рН (0,1 М ацетатный буфер, рН 4, содержащий 0,5 М NaCl, с последующим промыванием 0,1 М трис-HCl-буфером, рН 8, содержащим 0,5 М NaCl). Иммобилизованную аргинин-сефарозу 4В хранили до использования в 0,02% азиде натрия при 4°С.

6) Транексамовая кислота (ТЕА)-сефароза 4В

Этот синтез проводили в соответствии с описанным выше способом для аргинин-сефарозы 4В (см. раздел 5).

7) Аргинин-сефароза 6В

Аргинин в двух различных концентрациях (2 ммоль или 0,2 ммоль/мл сухого геля) присоединяли к коммерческой иммобилизованной эпокси-сефарозе 6В (Pharmacia) следующим образом:

2,5 г эпокси-активированной сефарозы 6В суспендировали в 200 мл очищенной воды. Гель оставляли для набухания приблизительно в течение 5 минут при комнатной температуре, затем промывали в течение 1 часа 500 мл очищенной воды, добавляемой в аликвотах, через агломерированный стеклянный фильтр.

20 мл связывающего буфера (0,1 М NaHCO₃, рН 9,3 и 0,5 М NaCl) и набухший гель вливали в две пробирки, содержащие аргинин. Смеси перемешивали в пластиковой пробирке в течение ночи при RT (комнатной температуре).

В конце инкубации полученную смесь отмывали от избытка лиганда 5 гелевыми объемами связывающего буфера через агломерированный стеклянный фильтр. Продукт промывали 3 циклами с изменением рН (0,1 М ацетатный буфер, рН 4,0 и 0,5 М NaCl, с последующим промыванием 0,1 М трис-HCl-буфером, рН 8 и 0,5 М NaCl). Иммобилизованную аргинин-сефарозу 6В хранили до использования в 0,02% азиде натрия при 4°С.

8) Транексамовая кислота (ТЕА)-сефароза 6В

Этот синтез проводили в соответствии с описанным выше способом для аргинин-сефарозы 6В (см. раздел 7).

9) L-Лизин эпоксиактивированный Ceramic Hyper DF-гидрогель приобретали на фирме Sigma.

10) пара-Аминобензамидин, ковалентно присоединенный к сефарозе 6В, приобретали на фирме Pharmacia.

ПРИМЕР 2: Тестирование различных аффинных хроматографических смол для удаления плазмин(оген)а. Объединенный криопреципитат плазмы человека, содержащий 1 МЕ/мл плазмин(оген)а и 50 мг/мл фибриногена, использовали для следующего исследования.

Аликвоты замороженного криопреципитата подвергали оттаиванию при 37°С и диализовали против буфера BN1 (0,12 М NaCl, 10 мМ Tri Na-цитрат, 1 мМ CaCl₂ при рН 7,0). Полученный белковый раствор фильтровали через глубокий фильтр 5 мкм, чтобы получить прозрачный раствор. В цилиндр 5-мл шприца с диаметром 8,36 мм вносили 1,5 мл (влажный объем) следующих аффинных смол, описанных в примере 1: иммобилизованная ε-аминогексаноевая кислота (Сефароза 4В, использовали CNBr в качестве спейсера), иммобилизованные пара-аминобензамидин/аргинин/ТЕА (4% Агароза, с использованием DADPA в качестве спейсера), иммобилизованные аргинин/ТЕА (Сефароза 4В с использованием CNBr в качестве спейсера), иммобилизованные аргинин/ТЕА (Сефароза 6В с использованием эпокси в качестве спейсера) и иммобилизованный L-лизин (Ceramic Hyper DF-гидрогель с использованием эпокси в качестве спейсера). Оптимизированный способ упаковки геля заключался в следующем: упакованный гель промывали 4 объемами: i) очищенной воды, ii) 1 М NaCl, iii) очищенной воды, iv) буфера TLN 0,1 (0,05 М Трис, 0,02 М лизин, 0,1 М NaCl, рН 9,0), v) буфера TLN 1 (0,05 М Трис, 0,02 М лизин, 1 М NaCl, рН 9,0) и vi) очищенной воды. Все образцы буфера для нанесения и промывания вносили в цилиндр шприца после центрифугирования при 1000 оборотов в минуту в течение 1 минуты при 25°С. Уравновешивание проводили 4 объемами BN1, и предварительно профильтрованный, концентрированный криопреципитат наносили на смолу (2:1, об./об., соответственно), затем полученную смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Аликвоты несвязанных «спин»-промывок собирали в пластиковые пробирки после каждого центрифугирования. Смолу промывали по меньшей мере 13 колоночными объемами BN1-буфера до тех пор, пока O.D₂₈₀ (оптическая плотность) не достигала 0,02. Элюцию плазмин(оген)а проводили буфером TLN 1 с последующим промыванием четырьмя объемами слоя 3 М NaCl. Мини-колонки плотно закрывали и хранили при 4°С.

Смолы, которые разрушались во время процесса или удаляли менее 50% плазмин(оген)а, исключали еще в начале исследования. Результаты суммированы в таблице 2.

Таблица 2Удаление плазмин(оген)а Рв несвязанном материале с использованием различных иммобилизованных лигандов с буфером BN1
Иммобилизованные лиганды	Удаление плазмин(оген)а (%)
ε-Аминогексаноевая кислота, использовали CNBr в качестве спейсера	13,36
пара-Аминобензамидин, использовали DADPA в качестве спейсера	Нет(колонка упакована)
пара-Аминобензамидин, использовали эпокси в качестве спейсера	19,78
Аргинин, использовали DADPA в качестве спейсера	6,04*
ТЕА (высокая концентрация), использовали CNBr в качестве спейсера	0
ТЕА (низкая концентрация), использовали CNBr в качестве спейсера	0
Аргинин (низкая концентрация), использовали CNBr в качестве спейсера	23,25
Аргинин (низкая концентрация), использовали эпокси в качестве спейсера	0
Аргинин (высокая концентрация), использовали эпокси в качестве спейсера	5,61
*Приведенные данные являются средней величиной из трех опытов.

В вышеприведенной таблице показано, что лучшие лиганды для удаления плазмин(оген)а из криопреципитата содержали аффинные гели, которые были достаточно сильными, чтобы выдержать последствия нанесения, промывания и элюции без сжатия, или гели, которые удерживают более 50% нанесенного фибриногена.

В таблица 3 продемонстрирована как эффективность различных типов гелей при удалении плазмин(оген)а, так и их способность удерживать фибриноген в концентрированном криопреципитате.

Присутствующий в криопреципитате остаточный плазмин(оген) адсорбировался смолами, тогда как фибриноген не адсорбировался, что делает полученный супернатант по существу свободным от плазмин(оген)а.

Содержание фибриногена определяли по времени свертывания, тогда как содержание плазмин(оген)а определяли при исследовании с хромогенным субстратом.

Рассчитанный выход плазмин(оген)а и фибриногена с лизин-гелей служил в качестве золотого стандарта для всех других использованных гелевых лигандов. Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что только ТЕА-лиганды с эпокси-спейсером обеспечивали хорошее удаление плазмин(оген)а и высокий выход фибриногена (см. таблицу 3). Высокая концентрация иммобилизованной ТЕА обеспечивала лучшее удаление плазмин(оген)а и сравнимый выход фибриногена по сравнению со связанным с лизином лигандом: выход 89% против 92% в случае фибриногена и 89% против 56% в случае удаления плазмин(оген)а соответственно. Все другие смолы оказались значительно менее эффективными либо при удалении плазмин(оген)а, либо в отношении выхода фибриногена.

Таблица 3Сводка данных по выходу фибриногена и удалению плазмин(оген)а в несвязанный материал, полученных при использовании различных иммобилизованных лигандов с буфером BN1
Иммобилизованные лиганды	Удаление плазмин(оген)а (%)	Выход фибриногена (%)
Лизин, при использованииэпокси в качестве спейсера	56*	92*
ТЕА, при использовании DADP в каче