Способ получения из растительного сырья галактуронанов, обладающих противовоспалительным действием

Способ получения из растительного сырья галактуронанов, обладающих противовоспалительным действием

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения галактуронанов из растений, содержащих пектины.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения из растительного сырья суммы полисахаридов (RU патенты 2176515, МКИ А61, К35/78, 31/715, С08В 37/100). Способ заключается в предварительной обработке сырья водным раствором формалина, затем подкисленной водой при рН 3.8-4.2 и 45-52°С для удаления кальциевых и магниевых мостиков с последующей экстракцией пектиновых полисахаридов водным раствором оксалата аммония при 68-70°С в течение 6-8 час. Полученный экстракт отделяют от растительной массы фильтрованием и концентрируют с одновременным диализом на ультрафильтрационной установке с мембранными фильтрами, имеющими поры размером 100 кДа. Сконцентрированный раствор лиофилизуют.

Данный способ не позволяет выделить галактуронаны непосредственно из растительного материала. Его недостатком является необходимость сначала выделить пектин, а затем из пектина с помощью гидролиза получить галактуронан, что усложняет способ получения галактуронана, увеличивает время его получения.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка нового способа получения непосредственно из растительного сырья галактуронанов высокого качества, обладающих противовоспалительным действием.

Технический результат достигается тем, что после обработки сырья водным раствором формалина, выдерживании его в подкисленной воде, экстракции водным раствором оксалата аммония полученный экстракт центрифугируют, добавлением HCl доводят рН до 0.8-1.0 и выдерживают при 45-50°С в течение 3-5 час, далее водным раствором аммиака доводят рН до 4.0-4.1, после чего экстракт концентрируют с одновременным диализом на ультрафильтрационной установке с мембранными фильтрами с размерами пор 100 кДа и лиофильно высушивают. В качестве сырья используют предварительно измельченную свежую надземную часть высших растений, содержащих пектиновые полисахариды, например борщевика сибирского, сабельника болотного.

Способ осуществляется следующим образом. Надземную часть высшего растения, содержащего пектиновые полисахариды, предварительно измельчают. Затем сырье обрабатывают 0.5-1.0%-ным водным раствором формалина в соотношении сырье : раствор 1:8-10 в течение 12-14 час для фиксации пигмента при комнатной температуре. Перед экстракцией сырье выдерживают в подкисленной соляной кислотой воде (рН 3.8-4.2) при соотношении сырье : раствор (1:7-10) при 45-52°С в течение 3-4 час для перевода пектиновых веществ в растворимое состояние. Экстракцию пектиновых полисахаридов проводят водным 0.7%-ным раствором оксалата аммония в соотношении 1:10-12 при 65-68°С 5-6 час. Экстракт центрифугируют на проточной центрифуге, после чего 1М раствором соляной кислоты рН экстракта доводят до 0.8-1.0 и выдерживают при 45-50°С в течение 3-5 час, затем водным раствором аммиака рН экстракта доводят до 4.0-4.1 и подвергают ультрафильтрации на установке с мембранами, размеры пор которых составляют 100 кДа, добавляя дистиллированную воду при перемешивании. В результате происходит одновременно концентрация и диализ экстракта: отношение экстракта к дистиллированной воде по объему 1:3. Очищенный галактуронан лиофильно высушивают.

Пример 1. 2 кг свежесобранной надземной части борщевика сибирского измельченной до 15-20 мм, заливают 1%-ным водным раствором формалина (20 л) и оставляют при комнатной температуре в течение 12-14 часов. Потемневший раствор сливают, сырье промывают водой до бесцветной окраски и заливают водой, подкисленной соляной кислотой (рН 4.0, 20 л). Смесь выдерживают при температуре 50°С в течение 3 час. Далее раствор сливают и сырье промывают водой. Экстракцию пектина проводят 0.7%-ным оксалатом аммония (20 л) при 65-68°С в течение 5-6 часов при регулярном перемешивании. Экстракт центрифугируют на проточной центрифуге, доводят рН супернатанта 1М соляной кислотой до 0.8 (0.7 л) и выдерживают 3 час при 50°С, после чего нейтрализуют концентрированным водным аммиаком (100-150 мл) до рН 4. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации на ультрафильтрационной установке с мембранными фильтрами (поры 100 кДа). Очищенный галактуронан лиофильно высушивают, выход продукта составляет 5.9% на воздушно-сухое сырье.

Пример 2. 2 кг свежесобранной надземной части борщевика сибирского заливают 20 л 1%-ного раствора формалина. Далее обработку осуществляют, как описано в примере 1: сырье заливают подкисленной водой (рН 4, 20 л) экстракцию проводят при тех же условиях 0.7%-ным оксалатом аммония, центрифугируют, супернатант отделяют. Затем 1М соляной кислотой (0.2 л) доводят рН экстракта до 1.0 и выдерживают 5 час при 45°С, после чего нейтрализуют водным раствором аммиака до рН 4.1. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации, как описано в примере 1, и лиофилизуют. Выход продукта 7.3% на воздушно-сухое сырье.

Пример 3. 2.9 кг свежесобранной надземной части сабельника болотного заливают 1%-ным раствором формалина (30 л). Далее обработку осуществляют, как описано в примере 1: сырье заливают подкисленной водой (рН 4, 30 л), проводят экстракцию, центрифугируют. Затем 1М соляной кислотой (0.5 л) доводят рН экстракта до 0.8 и выдерживают 4 час при 45°С, после чего нейтрализуют водным раствором аммиака до рН 4.1. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации, как описано в примере 1, и лиофилизуют. Выход продукта составляет 1.8% от воздушно-сухого сырья.

Пример 4. 2.9 кг свежесобранной надземной части сабельника болотного заливают 1%-ным раствора формалина (30 л). Далее обработку осуществляют, как описано в примере 1: сырье заливают подкисленной водой (рН 4, 30 л), проводят экстракцию, центрифугируют. Затем 1М соляной кислотой доводят рН экстракта до 1.0 и выдерживают 3 час при 50°С, после чего нейтрализуют водным раствором аммиака до рН 4.0. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации, как описано в примере 1, и лиофилизуют. Выход продукта составляет 2%.

Характеристика галактуронанов приведена в таблице 1.

Таблица 1.Характеристика целевых продуктов - галактуронанов.
Сырье	Выход	Общее содержание, %
Галактуроновая к-та	Молекулярный вес
Борщевик	5.9-7.0	90-93	>300 кДа
Сабельник болотный	1.8-2.0	90-92	>300 кДа

Изучение противовоспалительного действия галактуронанов из борщевика сибирского и сабельника болотного, выделение которых описано в предлагаемом способе, показало, что изучаемые вещества проявляют противовоспалительное действие при пероральном введении лабораторным мышам в дозе 50 мг/кг. Галактуронаны борщевика и сабельника уменьшают у мышей отек лапки, вызванный инъекцией 2%-ного раствора каррагинана (табл. 2).

Таблица 2.
Противовоспалительное действие полученных галактуронанов.
Исходный пектин/ Целевой продукт	Доза1, мг/кг	Отек лапки2, мкм	Клеточная адгезия3, ед. опт. плот. × 1000
Контроль	-	8,0±1,6	264±63
Сырье сабельника:
исходный пектин	50	6,4±0,5*	245±32*
галактуронан	50	5,0±0,5*	221±48*
Сырье борщевика:
исходный пектин	50	5,6±0,4*	222±25*
галактуронан	50	4,4±0,6*	141±31*
Примечания: 1 - вещества вводились перорально за сутки до индукции воспаления; 2 - отек измерен через 1 час после инъекции каррагинана; 3 - при концентрации веществ 150 мкг/мл.
Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение при n=7, * - различия достоверны при р<0,05.

Полученные галактуронаны также снижают адгезивность нейтрофилов in vitro. Выделенные целевые продукты являются практически нетоксичными соединениями с полулетальной дозой свыше 1 г/кг при однократном внутрибрюшинном введении мышам.

В табл.2 представлены результаты уменьшения воспаления и снижения адгезии нейтрофилов при действии полученных галактуронанов в сравнении с исходными пектинами.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет выделить из растений рода сабельника и борщевика галактуронаны, обладающие противовоспалительным действием, с достаточно высокой степенью очистки целевых продуктов. Способ может быть использован для любых высших растений, содержащих пектиновые полисахариды.

1. Способ получения из растительного сырья галактуронанов, включающий предварительную обработку сырья водным раствором формалина, выдерживание в подкисленной воде, экстракцию водным раствором оксалата аммония, фильтрацию и концентрирование экстракта на ультрафильтрационной колонке с одновременным диализом и лиофильную сушку целевого продукта, отличающийся тем, что дополнительно после экстракции экстракт центрифугируют, добавлением НС1 доводят рН до 0,8-1,0 и выдерживают при температуре 45-50°С в течение 3-5 ч и затем нейтрализуют водным раствором аммиака до рН 4,0-4,1.

2. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что в качестве сырья используют свежую надземную часть высших растений, например, борщевика сибирского, сабельника болотного.