Применение рам

Применение рам

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к применению PAM (ассоциированный с Myc белок). Другие аспекты изобретения относятся к способу скрининга лекарственных средств и к способам лечения боли.

Боль представляет собой сложное субъективное ощущение, отражающее реальное или возможное повреждение тканей и эмоциональный ответ на него. Острая боль представляет собой физиологический сигнал, означающий возможное или реальное повреждение. Хроническая боль может быть либо соматогенной (органической), либо психогенной. Хронической боли часто сопутствуют или за ней следуют вегетативные признаки, которые часто приводят к депрессии.

Соматогенная боль может быть ноцицептивного, воспалительного или невропатического происхождения. Полагают, что ноцицептивная боль связана с непрерывной активацией соматических или висцеральных болевых чувствительных нервных волокон. Невропатическая боль возникает вследствие дисфункции нервной системы; полагают, что ей способствуют аберрантные соматосенсорные процессы периферической нервной системы, ЦНС или их обеих. (Для обзора механизмов боли см., например, Scholz and Woolf, 2002; Julius and Basbaum, 2001, Woolf and Mannion, 1999; Wood, J.D., 2000; Woolf and Salter, 2000.)

Хроническая боль приводит к страданию человека и к огромным социально-экономическим затратам. Существующие способы лечения боли крайне неудовлетворительны как в отношении эффективности, так и в отношении безопасности.

В настоящее время для лечения боли, как правило, применяют два класса анальгетиков: неопиоидные анальгетики, главным образом ацетаминофен и НПВЛС (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства), и агонисты опиоидов (наркотики) (где "опиоид" является общим термином для природных и синтетических веществ, связывающихся со специфическими опиоидными рецепторами в ЦНС, оказывая действие в качестве агониста). К сожалению, оба класса анальгетиков, и опиоидные, и неопиоидные, обладают некоторыми нежелательными побочными эффектами. Наиболее серьезными побочными эффектами опиоидов являются возможность угнетения дыхательной системы и возникновение зависимости после длительного их приема (Schaible H.G., Vanegas H., 2000). С другой стороны, НПВЛС, большой класс не являющихся опиоидами анальгетиков, может вызывать множество осложнений желудочно-кишечного тракта, такие как язвы и кровотечение, а также оказывать отрицательное воздействие на почки (Schaible H.G., Vanegas H., 2000). Было установлено, что в США вследствие вызываемых общепринятыми НПВЛС тяжелых желудочно-кишечных осложнений ежегодно умирает приблизительно 16000 пациентов.

Ввиду серьезных недостатков методов лечения боли, известных в данной области, существует необходимость в новых классах модулирующих боль лекарственных средств. Особенно ввиду огромного разрыва между быстрым продвижением в понимании нейробиологии боли и неудовлетворенной клинической потребностью в эффективных способах лечения без побочных эффектов в данной области необходимы усилия, направленные на поиск новых объектов исследования для создания новых классов анальгетиков. Таким образом, целью настоящего изобретения является получение новых средств для разработки и получения нового класса модулирующих боль лекарственных средств.

Эта цель достигается благодаря применению PAM или его функциональных фрагментов или производных для получения модулирующих боль фармацевтических соединений.

Изобретение основано на открытиях авторов изобретения, впервые продемонстрировавших, что PAM участвует в ноцицептивных процессах и способен снижать боль. Термин функциональный в отношении PAM относится к способности PAM уменьшать внутриклеточные уровни цАМФ или взаимодействовать с AC; более предпочтительно оно относится к его способности ингибировать активность AC и даже более предпочтительно к его способности снижать боль.

Фрагмент PAM может быть любым полипептидом или полинуклеотидом, являющимся более коротким, чем соответствующая исходная молекула, например более коротким, чем PAM человека по одной из последовательностей с инвентарными номерам ACC 39928 (SEQ ID NO:1), NP_055872, NM_015057, AF075587 (SEQ ID NO:2), или короче, чем полинуклеотид с положения 24679861 до положения 24962245 последовательности с инвентарным номером NT_024524.11 (SEQ ID NO:3).

Производное PAM или фрагмент PAM может иметь любую модификацию аминокислотной или нуклеотидной последовательности с функцией PAM или модификацию любого другого типа, такую как химическая или биологическая модификация, например, приводящая к стабилизации полипептида или полинуклеотида (такую как фосфоротиоатные модификации), или обеспечивающая специфическую направленность полипептида или полинуклеотида на определенные клетки, или облегчающая ее проникновение в клетки или ее захват клеткой (такая как проходящие в клетку фосфопептиды или связывание с проходящими в клетку пептидными векторами, например, основанными на antennapedia/penetratin, TAT и последовательностях, основанных на сигнальных пептидах; или связывающиеся с частями лигандов для специфических транспортеров или импортеров).

PAM, или его фрагменты, или производные можно применять или в форме полипептида, или в форме полинуклеотида. Пригодными являются подходящие модификации или дополнения для обеспечения или облегчения ее направления к необходимому участку и ее вхождения в клетку. С другой стороны, для обеспечения ее направления к спинному мозгу возможно локальное применение, такое как интраспинальное применение с применением подходящих катетеров и тому подобное. Другие пригодные дополнения включают в себя соли, буферы или т.п. для ее стабилизации и тому подобное.

PAM, или его фрагменты, или производные, например, можно вводить в пригодный вектор, обеспечивающий внутриклеточную экспрессию и предпочтительно также направление в клетку. Клеточную типоспецифическую экспрессию можно обеспечить с применением подходящих промоторов/энхансеров, специфичных для нейронов генов, известных в данной области. Также возможно применение олигонуклеотидов PAM.

Настоящее изобретение основано на исследованиях авторов, впервые демонстрировавших, что PAM участвует в механизмах повышения чувствительности в спинном мозге и ганглиях задних корешков (DRG).

PAM (ассоциированный с Myc белок) представляет собой гигантский белок с массой 510 кДа. Белковая, геномная и кодирующая полинуклеотидные последовательности PAM известны в данной области и общедоступны, например, в базе данных NCBI (National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; www.ncbi.nhm.nih.gov) под инвентарными номерами AAC39928 (кодирующая последовательность; SEQ ID NO:1), AF075587 (белковая последовательность; SEQ ID NO:2). Человеческий PAM расположен на хромосоме 13q22; его геномная последовательность общедоступна под номером NT_024524.11 (Старт: положение 24679861; Стоп: положение 24962245; SEQ ID NO:3). Альтернативно, белковая и кодирующая последовательности общедоступны под инвентарными номерами для белка KIAA0916 NP_055872 (белковая последовательность) и NM_015057 (кодирующая последовательность).

Для крысиного PAM общедоступны следующие кодирующие последовательности из EST-клонов:

AW921303 (соответствует 960-1394 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:4)

AW918711 (соответствует 8188-8632 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:5)

BQ201485 (соответствует 8966-9633 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:6)

BE112881 (соответствует 10311-10830 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:7)

AW441131 (соответствует 13569-14152 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:8)

BF409872 (соответствует 13569-14807 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:9).

Исходно PAM идентифицировали по его способности специфически взаимодействовать с активирующим транскрипцию доменом на N-конце Myc (Guo Q., et al., 1998). Недавно PAM описан как мощный ингибитор активности AC (Scholich K., Pierre S., Patel T.B.: Protein associated with myc (PAM) is a potent inhibitor of adenylyl cyclase. J. Biol. Chem. 2001, Dec 14;276(50):47583-9.), но до настоящего времени доказательств его функционирования в обработке ноцицептивных сигналов и повышения ноцицептивной чувствительности не существовало.

Предпочтительнее полагают, что PAM играет роль в регуляции пресинаптического роста: известно, что мРНК PAM высоко экспрессирована в специфических анатомических областях, включающих в себя гиппокамп, зубчатую извилину и мозжечок. Экспрессия и PAM, и Myc в головном мозге взрослых крыс и мышей ограничена зрелыми клетками Пуркинье в мозжечке и зернистыми и пирамидальными клетками в гиппокампе (Ruppert C., et al., 1986; Yang H. et al., 2002). Однако ни для одного из этих типов клеток не известно, что он вовлечен в обработку болевых ощущений и повышение болевой чувствительности.

Показано, что гомологи PAM у Drosophila (highwire) и C. elegans (rpm-1) играют ключевую роль в организации пресинаптических окончаний (Zhen et al., 2000), регуляции синаптического роста (Wan et al.,2000), формировании синапсов и росте и направлении аксонов (Schaefer et al., 2000). Данные открытия привели к предположению, что highwire, rpm-1 и их гомолог у млекопитающих PAM могут действовать как негативные регуляторы синаптического роста (Chang et al., 2000; Jin Y. 2002). Таким образом, в мозжечке, гиппокампе и зубчатой извилине в течение основного периода формирования синапсов в этих структурах выявили значительное увеличение экспрессии PAM (Yang et al., 2002).

В течение развития головного мозга у грызунов экспрессия PAM запускается вскоре после рождения, повышается в течение первых двух недель, а затем экспрессия PAM остается повышенной в течение взрослого периода (Yang et al., 2002). До настоящего времени об экспрессии и регуляции PAM в спинном мозге и DRG и его функции в механизмах повышения чувствительности и регуляции боли ничего не было известно.

Ранее показано, что человеческий PAM представляет собой мощный регулятор путей передачи сигнала циклического АМФ (цАМФ) и ингибирует ферментативную активность некоторых изоформ аденилатциклазы (AC; E.C.4.6.1.1) при наномолярных концентрациях (Scholich et al. 2001).

Повсеместно присутствующая система вторичного мессенджера, циклицеского АМФ (цАМФ) представляет собой один из различных механизмов передачи сигнала, преобразующих внеклеточные стимулы во внутриклеточные сигналы и ответы. При внеклеточной стимуляции сопряженные с G-белками рецепторы (GPCR) модулируют связанные с плазматической мембраной ферменты или ионные каналы посредством связанных с ГТФ тримерных регуляторных белков (G-белков). Один из ферментов, активность которого регулируют GPCR, представляет собой аденилатциклазу (AC), образующий цАМФ фермент. Таким образом, поступающие внеклеточные стимулы воздействуют на внутриклеточную концентрацию внутриклеточного медиатора, циклического АМФ. Повышение уровней цАМФ воздействует на клетку посредством стимуляции протеинкиназы A (PKA), фосфорилирующей специфические внутриклеточные белки-мишени и, таким образом, изменяющей их активность.

Каждый тип клеток обладает характерным набором GPCR, модулируемых данными GPCR ферментов, специфических подклассов аденилатциклазы (AC) и белков-мишеней, которые, действуя совместно с более неспецифическими или часто встречающимися партнерами (такими как повсеместно присутствующий цАМФ), позволяют каждой клетке производить ее собственный характерный ответ на поступающие внеклеточные сигналы. Например, известно, что вторичный мессенджер циклический АМФ (цАМФ) играет главную роль в синаптической пластичности (Bailey et al., 1996; Xia et al., 1997; Brandon et al., 1997); с другой стороны, он вовлечен в метаболические процессы и клеточную пролиферацию. Таким образом, роль повсеместно распространенной системы мессенджера цАМФ и ее различных компонентов варьирует в зависимости от различных видов специализации различных типов тканей и клеток.

В дополнительном аспекте изобретение относится к применению PAM или его функциональных фрагментов или производных для модуляции боли. Данная модуляция предпочтительно представляет собой уменьшение или профилактику или полное подавление.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению PAM или его функциональных фрагментов или производных для идентификации модулирующих боль соединений. Модулирующие соединения предпочтительно представляют собой активирующие PAM соединения. Наиболее предпочтительно, чтобы они обладали способностью предотвращать, уменьшать или прекращать боль.

Например, соединения можно идентифицировать по их способности

a) активировать или усиливать функцию PAM (т.е. его способность уменьшать уровни внутриклеточного цАМФ взаимодействовать с другими факторами, подобными AC, и особенно с AC, ингибировать AC или его способности уменьшать восприятие боли) или

b) активировать PAM на уровне РНК (т.е. посредством активации транскрипции PAM или стабилизации транскрипта) или

c) активировать PAM на уровне белка (т.е. посредством активации трансляции PAM или его посттрансляционного процессинга; посредством модуляции посттрансляционной модификации PAM или посредством активации его стабилизации или ингибирования его разрушения).

По данному аспекту PAM (или его фрагмент, или производные) можно применять или как полипептид, или как олиго- или полинуклеотид.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения боли, включающему в себя введение индивидууму достаточного количества PAM или его функционального фрагмента или производного.

Соответственно, введение следует проводить способом, обеспечивающим направление PAM к участку действия (DRG или спинной мозг), например, посредством системного введения производных или препаратов PAM, направляющих себя к необходимому участку, или посредством местного (например, интраспинального) применения PAM, или его фрагментов, или производных.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга фармацевтических средств, пригодных для модуляции и/или профилактики боли, включающему в себя стадии

a) получения двух образцов;

b) приведения одного образца, содержащего PAM, или его функциональный фрагмент, или производное, в контакт с соединением;

c) определения активности PAM в присутствии соединения;

d) измерения активности PAM в отсутствие соединения и

e) сравнения активности PAM из c) с активностью PAM из d).

PAM можно получать из любой доступной последовательности, подходящей для ее конкретной цели по различным аспектам настоящего изобретения. Предпочтительно PAM представляет собой человеческий PAM.

В различных аспектах настоящего изобретения также предпочтительно, если PAM представляют собой выделенные полипептиды или олиго- или полинуклеотиды. Термин «выделенные» в контексте различных аспектов настоящего изобретения означает, по меньшей мере, частично очищенные из природного источника или рекомбинантного PAM (которые, конечно, также могут являться очищенными или частично очищенными).

Анализ представляет собой аналитический способ любого типа для слежения за биологическим процессом. Для применения в скрининге лекарственных средств анализ должен являться воспроизводимым, а предпочтительно также расширяемым и надежным. Анализ предпочтительно пригоден для высокопроизводительного скрининга химических соединений на их способность модулировать (предпочтительно уменьшать) и/или предотвращать боль. Например, тип анализа зависит от типа применяемого PAM (или полипептида, или полинуклеотида) и "вывода", т.е. способа, которым определяют активность PAM (см. ниже).

Различные типы таких анализов, как правило, известны в данной области и коммерчески доступны у частных поставщиков. Пригодные виды анализа включают в себя радиоизотопный или флуоресцентный виды анализа, например виды флуоресцентного поляризационного анализа (такие как виды анализа, предоставляемые на коммерческих условиях Panvera, Perkin-Elmer life sciences (например, LANCE) или Packard BioScience (например, HTRF или ALPHAscreen™)) для измерения взаимодействия меченого партнера с немеченым партнером (например, PAM или его фрагменты могут являться мечеными, а измерять можно их взаимодействие с AC).

Более многочисленные примеры включают в себя основанные на применении клеток анализы, где клеточная линия стабильно (индуцируемо или нет; с хромосомы или эписомы) или транзиторно экспрессирует интересующий рекомбинантный белок. Данные виды анализа включают в себя, например, анализ с репортерным геном, где регуляцию определенного промотора или пути передачи сигнала участника каскада передачи сигнала измеряют по активности репортерного фермента, экспрессия которого находится под контролем указанного определенного промотора. Для данного типа анализа конструируют рекомбинантную клеточную линию, содержащую репортерный ген под контролем определенного промотора, который необходимо исследовать самого или который регулируется исследуемым сигнальным каскадом. Пригодные репортерные ферменты, как правило, известны в данной области и включают в себя люциферазу светляка, люциферазу Renilla (например, коммерчески доступная в Packard reagents), β-галактозидазу. Пригодность клеточных линий зависит от цели анализа, но они, как правило, включают в себя клеточные линии, которые легко трансфицировать и легко культивировать, например, такие как HeLA, COS, CHO, NIH-3T3 и т.д.

Анализы для измерения внутриклеточного уровня ионов включают в себя, например, анализы с применением FLIPR (планшет-ридера флуориметрического получения изображения, коммерчески доступного в Molecular Devices), где источник свечения аргонового лазера объединяют с охлажденной CCD-камерой, обеспечивая параллельное измерение в 384-луночных планшетах кратковременных сигналов ионов (таких как Ca²⁺ и т.д.) в клетках (например, в нервных клетках или других клетках (например, в клетках, рекомбинантно или естественным образом экспрессирующих определенные ионные каналы)). Например, анализы с применением FLIPR позволяют с применением определенных флуорохромов, таких как Fluo-3, Fluo-4, производить мониторинг внутриклеточного содержания кальция, или с применением наборов для анализа с применением специфичных для ф./р. BCECF или BCPCF FLIPR производить мониторинг внутриклеточного pH, или с применением, например, наборов для анализа с применением DiBAC или специфичных FLIPR проводить мониторинг изменений мембранного потенциала, или проводить мониторинг поляризации мембраны. Для мониторинга других внутриклеточных ионов, например цинка или натрия, можно применять другие известные в данной области красители. Как правило, специалистам в данной области известны другие типы анализа и другие типы вывода данных.

Для измерения уровней цАМФ пригодны, например, AlphaScreen, поляризация флуоресценции или технология HTRF.

Для определения активности ионных каналов (контролирующей, например, внутриклеточные концентрации ионов и которую, таким образом, можно применять для измерения внутриклеточной концентрации ионов) можно применять, например, чувствительные к мембранному потенциалу анализы и красители, такие как DiBAC или технологию с применением набора для анализа мембранного потенциала на FLIPR из Molecular Devices; измеряющий поляризацию митохондриальных мембран краситель JC-1 с применением технологии FLIPR; ионочувствительные красители, такие как Fluo-3, Fluo-4 или набор для анализа кальция из Molecular Devices, для измерения внутриклеточной концентрации кальция; чувствительные к натрию красители, например, из Molecular Probes, для измерения внутриклеточного натрия; основанные на способе фиксации потенциала анализы или основанное на атомно-адсорбционной спектроскопии измерение выхода иона рубидия для определения внутриклеточных концентраций калия и т.д. Специалистам в данной области известны дополнительные автоматические устройства и аналитические способы для выявления определенных изменений и состояний в клетках, и они включают в себя, например, детектор Acumen (основанное на флуоресценции лазерное сканирующее считывающее устройство, позволяющее производить трехмерную реконструкцию распределения подходящим образом меченных объектов) из ACUMEN bioscience.

Полипептид PAM предпочтительно представляет собой полипептид, содержащий соответствующую SEQ ID NO:2 последовательность или состоящий из нее или кодируемый полинуклеотидом, содержащим соответствующую SEQ ID NO:1 или 3 последовательность или состоящим из нее.

Полинуклеотид PAM предпочтительно представляет собой полинуклеотид, содержащий соответствующую SEQ ID NO:1 или 3 последовательность или состоящий из нее, или полинуклеотид, содержащий способную в строгих условиях гибридизоваться с указанными выше полинуклеотидами последовательность или состоящий из нее.

Жесткие условия являются характерными условиями реакции, влияющими на специфичность гибридизации или отжига двух одноцепочечных молекул нуклеиновой кислоты. Жесткость и, таким образом, специфичность реакции, среди прочего, зависит от температуры и буферных условий, применяемых для реакции. Например, жесткость и, таким образом, специфичность можно увеличить посредством увеличения температуры реакции и/или снижения ионной силы реакционного буфера. Например, условия с низкой жесткостью (и, таким образом, с низкой реакционной или гибридизационной специфичностью) имеют место, если гибридизацию проводят при комнатной температуре в растворе 2×SSC. Условия с высокой жесткостью включают в себя, например, реакцию гибридизации при 68°C в растворе 0,1×SSC и 0,1% SDS.

Под гибридизацией в жестких условиях в пределах различных аспектов настоящего изобретения предпочтительно подразумевают:

1) гибридизацию меченого зонда с образцом нуклеиновой кислоты для анализа при 65°C или, в случае олигонуклеотидных зондов, при температуре на 5°C ниже температуры отжига или плавления дуплекса, состоящего из олигонуклеотида и образца (температуры отжига и плавления далее подразумевают синонимами), в течение ночи в 50 мМ Tris pH 7,5, 1M NaCl, 1% SDS, 10% декстрансульфате, 0,5 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося или сельди;

2) отмывку в течение 10 минут в 2×SSC при комнатной температуре;

3) отмывку в течение 30 минут в 1×SSC/0,1% SDS при 65°C (или в случае олигонуклеотидов при температуре на 5°C ниже температуры отжига);

4) отмывку в течение 30 минут в 0,1×SSC/0,1% SDS при 65°C (или в случае олигонуклеотидов при температуре на 5°C ниже температуры отжига).

Олигонуклеотиды для применения в качестве зондов для гибридизации представляют собой полинуклеотиды, а предпочтительно фрагменты ДНК, с длиной от 15 до 30, а предпочтительно 20, нуклеотидов. Температуру отжига определяют по формуле T_m=2 × (число A+T) + 4 × (число G+C)°C.

Для получения 2×SSC или 0,1×SSC (или любой другой степени разведения SSC) раствор, например, 20×SSC разбавляют соответствующим образом. 20×SSC состоит из 3 М NaCl/0,3 М цитрата Na×2H₂O.

Перед проведением реакции гибридизации полинуклеотиды, если желательно, после проведения электрофоретического разделения (в таком случае: "саузерн"-блот (ДНК) или "нозерн"-блот (РНК)) или без проведения электрофоретического разделения (в таком случае: слот- или дот-блот) переносят на подходящую мембрану, например нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану. Гибридизацию проводят с применением подходящим образом меченного зонда. Пригодные способы мечения представляют собой, например, радиоактивное мечение или мечение с применением флуоресцентных красителей. Зонд представляет собой одноцепочечный полирибо- или полидезоксирибонуклеотид, являющийся по природе одноцепочечным или, как правило, являющийся двухцепочечным, но сделанный одноцепочечным посредством денатурации. Данный зонд связывается с образцом ДНК или РНК (который также находится в одноцепочечном состоянии) посредством спаривания оснований.

Фрагменты PAM предпочтительно представляют собой фрагменты, содержащиеся в указанных выше последовательностях с ID NO:1, 2 или 3, а производные предпочтительно получают из указанных выше последовательностей с ID NO:1, 2 или 3 или из их фрагментов.

Функциональные фрагменты или их производные предпочтительно способны ингибировать активность аденилатциклазы (AC), более предпочтительно активность AC типа I, V или VI.

В предпочтительном варианте осуществления различных аспектов настоящего изобретения его функциональные фрагменты или производные содержат или включают аминокислоты 400-1400, предпочтительно 446-1062, 499-1065 или 1028-1231, более предпочтительно 1000-1300, еще более предпочтительно 1000-1100 и наиболее предпочтительно 1028-1065 последовательности человеческого PAM, предпочтительно последовательности человеческого PAM, соответствующей SEQ ID NO:2, в том случае, если их кодируют соответствующие нуклеотидные фрагменты, особенно если они входят в состав последовательностей SEQ ID NO:2 или 3.

Если функциональные фрагменты или их производные представляют собой полинуклеотиды, предпочтительно, если они содержат кодирующие указанные выше полипептидные фрагменты полинуклеотиды или состоят из них. Более конкретно, предпочтительно, если они содержат положения с 1482 по 3332 (кодирующие аминокислоты 446-1062), или с 1641 по 3341 (кодирующие аминокислоты 498-1066), или с 3228 по 3839 (кодирующие аминокислоты 1038-1231) cds человеческого PAM или состоят из них. Даже более предпочтительно, если cds человеческого PAM, из которой получены фрагменты, обладает последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:2.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего способа идентификации модулирующих боль соединений применяют клетки, экспрессирующие PAM, предпочтительно рекомбинантный PAM.

Клетки могут представлять собой клетки любого типа, например эукариотические или прокариотические одноклеточные организмы (такие как бактерии, например E. coli или дрожжи, например S. pombe или S. cerevisiae) или клеточные линии, полученные из многоклеточных организмов (такие как HeLa, COS, NIH-3T3, CHO и т.д.), где предпочтительны клеточные линии млекопитающих.

По другому предпочтительному варианту осуществления применяют модифицированные клетки с уменьшенной по сравнению с ее немодифицированным состоянием активностью PAM. Таким образом, можно тестировать способность химических соединений, тестируемых на способность модулировать (предпочтительно уменьшать) и/или предотвращать боль, увеличивать или восстанавливать сниженную или полностью нарушенную активность PAM.

Модификация может представлять собой модификацию любого типа (стабильную или транзиторную, предпочтительно стабильную), ведущую к активности PAM (т.е. его способности уменьшать уровни внеклеточного цАМФ, взаимодействовать с другими факторами, подобными AC, особенно AC, ингибировать AC или его способность снижать восприятие боли), стабильному уровню транскрипта PAM (т.е. посредством активации транскрипции PAM или стабилизации транскрипта) или стабильному уровню белка PAM (т.е. посредством активации трансляции PAM или его посттрансляционного процессинга; посредством модуляции посттрансляционной модификации PAM, или посредством активации его стабилизации, или посредством ингибирования его разрушения). Этого можно достигнуть, например, с применением доминантных негативных мутантов PAM, антисмысловых нуклеотидов, конструкций RNAi PAM, посредством образования функциональных или геномных нокаутов PAM (которые, например, можно индуцировать) или посредством других пригодных способов, известных в данной области. Для обзора указанных выше способов см., например: Current protocols in Molecular biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc.; Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press; Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function, 2000; Antisense Therapeutics, 1996; Scherr et al, 2003.

По предпочтительному варианту осуществления применяют клетки с нокаутом PAM. Пригодные клеточные линии для получения нокаутов хорошо известны в данной области и описаны, например, в Current protocols in Molecular Biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc или Gene Targeting a practical approach. (1995) Ed. A.L. Joyner, IRL Press.

Активность PAM можно определять или непосредственно, например по его способности (или способности его фрагментов или производных) взаимодействовать с AC или инактивировать AC, или ее можно определять косвенно, например по его способности (или способности его фрагментов или производных) уменьшать уровни внутриклеточного цАМФ, модулировать концентрации ионов в нейронах или его способность модулировать, особенно уменьшать, восприятие боли. Пригодные способы уменьшения указанных выше параметров хорошо известны в данной области (см. также выше): например, уровни цАМФ можно измерять посредством HTRF или ALPHAscreen™, концентрации ионов, например, можно рассчитывать посредством фиксации потенциала или пригодных красителей, восприятие боли можно измерять, например, посредством формалинового теста или тестов механической или термической гипералгезии или посредством теста горячей пластинки и т.д.

В другом аспекте изобретение относится к способу идентификации модулирующего боль соединения, включающему в себя

a) выбор соединения, модулирующего активность PAM, в качестве тестируемого соединения; и

b) введение указанного тестируемого соединения субъекту для определения того, модулирует ли оно боль.

Субъект может представлять собой любого субъекта, способного ощущать боль, предпочтительно млекопитающего, или не являющегося человеком млекопитающего или человека (т.е. при изучении на пациентах).

Далее изобретение проиллюстрировано более подробно посредством примеров и фигур. Однако примеры не являются средством ограничения объема изобретения.

Примеры: исследование профиля экспрессии и функции PAM

1. Получение животных срезов:

Крыс Sprague Dawley дикого типа приобретали в Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld, Германия). Животным до экспериментов предоставляли свободный доступ к пище и воде. Их содержали в помещениях с контролируемым климатом и светом (24±0,5°C). Каждое животное использовали только для одного эксперимента. Во всех экспериментах соблюдались этические рекомендации для исследователей в отношении находящихся в сознании животных, а процедуры одобрялись местным этическим комитетом. После умерщвления взрослых крыс фиксировали посредством перфузии 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,2) в течение одного часа. Ткани нарезали с применением криостата в горизонтальной плоскости с толщиной 14-16 мкм. Срезы закрепляли на Superfrost Plus Slides (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA) и до применения хранили при -80°C.

2. Получение рибонуклеотидных зондов:

Рибонуклеотидные зонды получали, как описано ранее (Yang et al., 2002). Антисмысловые и смысловые рибонуклеотидные зонды PAM крыс получали с применением полимераз T7 и T3, после линеаризации плазмиды Hind III (антисмысловой) и BamHI (смысловой) соответственно (см. Yang et al., 2002). В присутствии [³⁵S] УТФ-αS (ICN, Irvine CA), линеаризованной кДНК PAM, NTP при 37°C в течение 1 часа проводили транскрипцию in vitro по рекомендациям производителя (Promega, Madison, WI). Транскрипты РНК очищали с применением набора RNA Probe Purification (Pequlab, Erlangen, Германия).

3. Гибридизация in situ:

Гибридизацию in situ проводили, как описано ранее (Yang et al. 2002): срезы фиксировали в 4% параформальдегиде в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (pH,7,2), предварительно обрабатывали 0,25% уксусным ангидридом и 0,1 M триэтаноламином, промывали 0,2×SSC и денатурировали последовательно увеличивающимися концентрациями этилового спирта. Срезы в течение 2 часов при комнатной температуре предгибридизовали в растворе для предгибридизации (50% деионизированный формамид, 0,6 М хлорид натрия, 10 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 50 мМ ЭДТА, 0,025% пирофосфат натрия, 0,02% фиколл, 0,02% БСА, 0,02% поливинилпирролидон, 10 мМ DTT и денатурированные нагреванием, гетерологичные нуклеиновые кислоты (0,005% дрожжевая тРНК, типа X, 0,05% тотальная дрожжевая РНК, типа I, 0,05% ДНК семенников лосося, типа III)); гибридизовали с рибонуклеотидными зондами в растворе для гибридизации (2,5×10⁶ имп./мин./срез), 50% деионизированном формамиде и 50% буфере для гибридизации, содержащем 0,6 М хлорид натрия, 10 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 50 мМ ЭДТА, 0,025% пирофосфат натрия, 0,02% фиколл, 0,02% БСА, 0,02% поливинилпирролидон, денатурированные нагреванием гетерологичные нуклеиновые кислоты (0,005% дрожжевая тРНК, типа X, 0,005% тотальная дрожжевая РНК, типа I, 0,05% ДНК семенников лосося, типа III), 100 мМ DTT, 0,0005% полиадениловая кислота, 10% декстрансульфат) при 50°C в течение ночи. Срезы промывали 2×, 1×, 0,5×SSC при RT (комнатная температура). После расщепления в 20 мкг/мл РНКазы A (Sigma, St. Louis, MO), срезы отмывали в 1× буфере РНКазы, 2×, 1×, 0,5×SSC при комнатной температуре и в 0,1×SSC в течение ночи при 45°C. Срезы обезвоживали последовательно увеличивающимися концентрациями этилового спирта, экспонируя на пленку Kodak Biomax MR (Kodak, Rochester, NY) в течение 3-7 суток при -80°C.

4. Получение антител и иммунофлуоресцентное окрашивание:

Антисыворотку коммерческим способом индуцировали у кроликов с применением пептидов, состоящих из аминокислотных остатков 135-153 и 4601-4614 человеческого PAM в соответствии с SEQ ID NO:1 соответственно (BioTrend, Cologne, Германия). Антисыворотку коммерческим способом получали в BioTrend, Cologne, Германия, по стандартным процедурам. Для слежения за распределением PAM в срезах спинного мозга и DRG срезы пропитывали 0,1% Triton X-100 в течение 5 минут. Срезы в течение 1 часа блокировали в 3% БСА в PBS, а затем инкубировали в течение 1 часа с антисывороткой к PAM (разведение 1:50). После этого в PBS, содержащем 3% БСА, проводили инкубацию с меченными FITC антителами козы к антителам кролика. Затем срезы отмывали PBS и размещали с применением fluoromount™.

5. ОТ-ПЦР:

Полноразмерную РНК из спинного мозга и DRG крыс выделяли с применением экстракции с гуанидинизотиоцианатом/фенолом/хлороформом (Chomczynski and Sacchi 1987). 2 мкг тотальной РНК отжигали с 0,6 мМ каждого олиго-(dT)-праймера и в течение 30 минут при 37°C проводили обратную транскрипцию с применением обратной транскриптазы (Promega, Madison, WI). Затем кДНК сразу же применяли для амплификации. Олигонуклеотидные праймеры, применяемые для амплификации крысиного GADPH, представляли собой 5'-GAAGGGTGGGGCCAAAAG-3' (смысловой; SEQ ID NO:10) и 5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3' (антисмысловой; SEQ ID NO:11; Trajkovic et al. 2000). Праймеры для амплификации изоформ AC выбирали как опубликовано у Bek et al. (Bek et al. 2001). Праймеры для крысиного PAM представляли собой 5'-GGTGGTGAAGCTCGCTGTGATGCT-3' (смысловой; SEQ ID NO:12) и 5'-CGTGTGAGCATTTCTGCACACTCC-3' (антисмысловой; SEQ ID NO:13). Продукт ПЦР соответствует нуклеотидам 13692-14064 кДНК человеческого PAM. Соответствующие крысиные последовательности получали из EST-клона AW441131 (SEQ ID NO:8). Для полуколичественной ПЦР применяли ДНК-полимеразу SAWDAY (Peqlab, Erlangen, Германия). После начальной стадии денатурации при 95°C в течение 5 минут проводили 30 циклов по 1 минуте при 95°C, 30 секунд при 55°C и 10 секунд при 72°C с последующей конечной стадией удлинения при 72°C в течение 10 минут. Количественную ПЦР проводили с применением системы и реагентов TaqMan™ (Applied Biosystems, Weiterstadt, Германия) по инструкциям производителя.

6. Очистка полноразмерного PAM:

Очистку PAM проводили, как описано ранее (Scholich et al. 2001) с некоторыми модификациями. В кратком изложении, клетки HeLa растили в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Конфлюэнтные клетки из сорока 150-мм чашек собирали в 1×PBS, 1 мМ ЭДТА и в течение 5 минут осаждали при 400×g. Клетки ресуспендировали в буфере TED (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT), содержащем 125 мМ NaCl, 20 мкг/мл апротинина, 20 мкг/мл лейпептина, 1 мМ бензамидина, 5 мкг/мл соевого ингибитора трипсина, и лизировали 2×5 секунд ультразвуком. Гомогенат центрифугировали при 27000×g в течение 30 мин при 4°C, а супернатант помещали в колонку XK16 с Q-Sepharose (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ) и элюировали в TED в градиенте NaCl 150-350 мМ по инструкциям производителя. Фракции анализировали посредством "вестерн"-блоттинга по стандартным процедурам; положительные фракции объединяли, а концентрацию NaCl доводили до 1 М. Затем белок помещали в колонку XK16 с Phenyl-Sepharose (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ) и отмывали в 300 мМ NaCl в TED по инструкциям производителя. Проточные и отмытые фракции содержали PAM. Их объединяли и буфер заменяли на указанный выше буфер TED, содержащий 100 мМ NaCl, с применением Centricon 50 (Amicon, Beverly, MA) по инструкциям производителя. Затем белок помещали на колонку для FPLC Mono S 5/5 (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ) и отмывали буфером для нанесения (100 мМ NaCl в TED) по инструкциям производителя. Проходящую фракцию собирали и наносили на колонку для FPLC Mono Q 5/5 (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ). Белок элюировали в градиенте NaCl от 150 до 400 мМ в TED. Положительные фракции объединяли и заменяли буфер на 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ DTT с применением Centricon 50 (Amicon, Beverly, MA) и хранили при -80°C. Хранящийся PAM использовали в течение 3 недель.

7. Экспрессия и очистка рекомбинантного Gsα:

Помеченный гексагистидиновой меткой, конститутивно активный мутант Gsα (Gsα*) Q213L экспрессировали и очищали, как описано у Graziano et al., 1991. Для обеспечения максималь