Ультразвуковые контрастные вещества и способ их получения

Ультразвуковые контрастные вещества и способ их получения

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу получения сухой или лиофилизованной композиции, пригодной для получения газа, содержащего контрастное вещество, пригодное для использования в диагностической интроскопии, и к способу получения указанного газа, содержащего контрастное вещество.

Изобретение включает также сухие композиции, полученные этим способом, которые могут быть восстановлены с образованием суспензий контрастного вещества, пригодных в диагностической интроскопии. Кроме того, изобретение включает суспензии наполненных газом микропузырьков, пригодных в диагностической интроскопии, полученных с использованием сухих композиций согласно изобретению, а также контейнеров или двухкомпонентных наборов, содержащих сухие композиции изобретения.

Предпосылки изобретения

В результате быстрого развития ультразвуковых контрастных веществ в последние годы был создан ряд различных композиций, пригодных для ультразвуковой визуализации органов и тканей тела человека или животных. Эти вещества предназначены для использования прежде всего как внутривенные или внутриартериальные инъекции в связи с применением медицинского эхографического оборудования, в котором используется, например, формирование двумерных изображений (на основе пространственного распределения свойств обратного рассеяния тканей) или обработка доплеровского сигнала (на основе обработки ультразвуковых эхосигналов в режиме незатухающих волн или в импульсном доплеровском режиме) для определения параметров тока крови или жидкостей.

Класс пригодных для инъекций композиций, пригодных в качестве ультразвуковых контрастных веществ, включает суспензии пузырьков газа с диаметром несколько микрон, диспергированных в водной среде.

Применение суспензий пузырьков газа в жидкости-носителе как эффективных ультразвуковых отражателей хорошо известно в уровне техники. Развитие микропузырьковых суспензий как эхофармацевтиков для улучшения ультразвуковой визуализации последовало за ранними наблюдениями, что быстрые внутривенные инъекции водных растворов могут вызывать выход растворенных газов из раствора, образуя пузырьки. Было обнаружено, что из-за существенного различия их акустического сопротивления и сопротивления крови эти внутрисосудистые пузырьки газа являются прекрасными отражателями ультразвука. Инъекция суспензий пузырьков газа в жидкости-носителе в кровоток живого организма существенно интенсифицирует ультразвуковую эхографическую визуализацию, улучшая тем самым визуализацию внутренних органов. Поскольку получение изображений органов и глубоко находящихся тканей может быть решающим при установлении медицинского диагноза, много усилий было направлено на создание стабильных суспензий высококонцентрированных пузырьков газа, которые в то же самое время были бы просты в приготовлении и приеме, содержали бы минимум неактивных соединений и были бы способны в долгому хранению и простому распространению.

Однако простое распределение свободных пузырьков газа в водной среде имеет ограниченный практический интерес, так как эти пузырьки, как правило, недостаточно стабильны, чтобы быть пригодными в качестве ультразвуковых контрастных веществ.

Соответственно, был проявлен интерес к способам стабилизации газовых пузырьков для эхографии и других ультразвуковых исследований, например, путем использования эмульгаторов, масел, загустителей или сахаров или путем включения или инкапсулирования газа или его прекурсора в различные системы. Эти стабилизированные пузырьки газа в уровне техники обычно называют "микровезикулами", и их можно разделить на две основные категории.

Первую категорию стабилизированных пузырьков, или микровезикул, обычно в данной области называют "микропузырьками", сюда относятся водные суспензии, в которых пузырьки газа удерживаются на границе раздела газ/жидкость очень тонкой пленкой, содержащей ПАВ (т.е. амфифильный материал), расположенный на границе раздела газа и жидкости. Вторую категорию микровезикул обычно в уровне техники называют "микросферами " или "микрокапсулами", к ней относятся суспензии, в которых пузырьки газа окружены оболочкой из твердого материала, образованного из натуральных или синтетических полимеров. Примеры микросфер и их получение описаны, например, в Европейской патентной заявке EP 0458745. Другой вид ультразвукового контрастного вещества включает суспензии пористых микрочастиц из полимера или других твердых частиц, которые несут пузырьки газа захваченными в порах микрочастиц. Настоящее изобретение относится, в частности, к контрастным веществам для диагностической интроскопии, включающим водную суспензию микропузырьков газа, т.е. микровезикул, которые стабилизированы в основном слое амфифильного материала.

Микропузырьковые суспензии обычно готовят путем приведения порошкообразных амфифильных материалов, например осушенных сублимацией заранее готовых липосом или осушенных сублимацией или распылением фосфолипидных суспензий, в контакт с воздухом или другим газом и затем с водным носителем, перемешивая для создания микропузырьковой суспензии, которую затем нужно будет принимать вскоре после ее приготовления.

Примеры водных суспензий микропузырьков газа и их получение можно найти, например, в документах US 5271928, US 5445813, US 5413774, US 5556610, 5597549, US 5827504.

В патенте WO 97/29783 раскрывается альтернативный способ получения суспензий микропузырьков газа, включающий образование дисперсии микропузырьков газа в подходящей водной среде, содержащей фосфолипиды, после этого дисперсию подвергают лиофилизации для получения сухого восстанавливаемого продукта. Приготовленные таким образом сухие продукты могут быть восстановлены в водных средах при необходимости лишь минимального перемешивания. Как упомянуто в указанном документе, размер образованных таким образом микропузырьков может всегда воспроизводиться и на практике не зависит от количества энергии смешения, прикладываемой для восстановления, а определяется размером микропузырьков, образованных в исходной микропузырьковой дисперсии. Заявитель, однако, обнаружил, что количество энергии перемешивания, приложенной для создания дисперсии микропузырьков газа в водной среде, содержащей фосфолипиды, может быть излишне высоким, в частности, когда должны быть получены микропузырьки малого диаметра (например, 23000 об/мин в течение 10 минут для получения дисперсии пузырьков средним по объему диаметром примерно 3 мкм). Эта высокая энергия перемешивания может вызвать локальный перегрев в водной дисперсии микропузырьков, что может, в свою очередь, вызвать деградацию фосфолипидов, содержащихся в водной среде. Кроме того, влияние излишне высокой энергии перемешивания обычно трудно контролировать, и это может привести к неконтролируемому распределение конечных микропузырьков по размерам. Кроме того, этот процесс предусматривает постоянный поток газа в водную среду при образовании микропузырьков, что требует, таким образом, применения больших количеств газов.

В документе WO 94/01140 описан следующий способ получения суспензий микровезикул, восстанавливаемых в водной среде, который включает лиофилизацию водных эмульсий, содержащих парантерально приемлемые эмульгаторы, неполярные жидкости и жидкие структурообразователи, растворимые в липидах или не растворимые в воде. В качестве парантерально приемлемых эмульгаторов упоминались полоксамеры и фосфолипиды, а смеси двух из них применялись в рабочих примерах. Холестерин является предпочтительным водонерастворимым структурообразователем, который применяется в рабочих примерах. Затем лиофилизованный продукт восстанавливают в воде, чтобы получить водную суспензию наполненных газом микровезикул. Наполненные газом микровезикулы, полученные в результате стадии восстановления, являются, таким образом, ограниченными оболочкой из различных материалов, в том числе эмульгаторов, таких как полоксамеры, и водонерастворимых структурообразователей, таких как холестерин.

Указано, что процесс приводит к эмульсии с размером частиц менее 4 мкм, предпочтительно менее 2 мкм и до 0,5 мкм. Однако заявитель отметил, что хотя этап восстановления может в конечном счете привести к микровезикулам, имеющим среднечисленный диаметр менее 2 мкм, тем не менее соответствующее распределение популяции микровезикул по размерам является относительно широким. Кроме того, стадия превращения из микрочастиц эмульсии, полученной в вышеуказанном процессе, в газовые микропузырьки дает в итоге довольно низкий выход.

Теперь заявитель обнаружил, что может быть получено намного более узкое распределение микропузырьков по размерам, если в качестве основного эмульгатора в вышеуказанной эмульсии использовать фосфолипид и если вышеуказанный процесс проводить по существу при отсутствии вышеуказанных водонерастворимых структурообразователей. Кроме того, почти полное отсутствие указанных водонерастворимых структурообразователей позволяет существенно увеличить степень превращения микрочастиц эмульсии в газовые микропузырьки. Кроме того, заявитель обнаружил, что вышеуказанный процесс может привести к еще более узкому распределению микропузырьков по размерам и к увеличенному выходу, если фосфолипид является по существу единственным эмульгатором, присутствующим в эмульсии.

Заявитель нашел также, что прилагая достаточно низкую энергию перемешивания к водно-органической эмульсии во время процесса, какой описан выше, можно получить микропузырьки, имеющие очень маленький диаметр и более узкое распределение по размерам.

Суть изобретения

Один аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизованной матрицы, которая при контакте с водной жидкостью-носителем и газом может быть восстановлена в суспензию наполненных газом микропузырьков, стабилизированную преимущественно фосфолипидом, причем указанный способ включает стадии:

a) приготовление водно-органической эмульсии, содержащей i) водную среду, ii) органический растворитель, по существу не смешиваемый с водой; iii) эмульгирующий состав амфифильных материалов, содержащий более 50 вес.% фосфолипида, и iv) лиопротективный агент;

b) лиофилизация указанной эмульгированной смеси с получением лиофилизованной матрицы, содержащей указанный фосфолипид.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения впрыскиваемого контрастного вещества, содержащего жидкую водную суспензию наполненных газом микропузырьков, стабилизированных преимущественно фосфолипидом, который включает стадии:

a) приготовление водно-органической эмульсии, содержащей i) водную среду, ii) органический растворитель, по существу не смешиваемый с водой; iii) эмульгирующий состав амфифильных материалов, содержащий более 50 вес.% фосфолипида, и iv) лиопротективный агент;

b) лиофилизация указанной эмульсии для получения лиофилизованной матрицы, содержащей указанный фосфолипид;

c) контактирование указанной лиофилизованной матрицы с биосовместимым газом;

d) восстановление указанной лиофилизованной матрицы путем растворения ее в физиологически приемлемой водной жидкости-носителе с получением суспензии наполненных газом микропузырьков, стабилизированных преимущественно указанным фосфолипидом.

Предпочтительно стадия a) приготовления эмульсии включает:

a1) приготовление суспензии путем диспергирования эмульгирующего состава амфифильных материалов и лиопротективного агента в водной среде;

a2) смешивание полученной суспензии с органическим растворителем;

a3) регулируемое перемешивание смеси с получением эмульсии.

Предпочтительно регулируемое перемешивание согласно стадии a3) получается при применении гомогенизатора высокого давления или, более предпочтительно, роторно-статорного гомогенизатора.

Следующий аспект изобретения относится к впрыскиваемому контрастному веществу, содержащему суспензию наполненных газом микропузырьков, стабилизированных стабилизирующим слоем, преимущественно содержащим фосфолипид в водной жидкости-носителе, причем указанные микропузырьки имеют среднечисленный диаметр (D_N) менее 1,70 мкм и медианный диаметр объемного распределения (D_V50) такой, что отношение D_V50/D_N составляет примерно 2,00 или меньше.

Подробное описание изобретения

Как указано выше, один аспект настоящего изобретения относится к способу получения лиофилизованной матрицы восстанавливаемой суспензии наполненных газом микропузырьков, стабилизированных преимущественно фосфолипидом, причем указанный способ включает приготовление водно-органической эмульсии, содержащей: i) водную среду, ii) органический растворитель, по существу не смешиваемый с водой; iii) фосфолипид и iv) лиопротективный агент, и последующую лиофилизацию указанной эмульсии.

Водная среда предпочтительно является физиологически приемлемым носителем. Термин "физиологически приемлемый" включает любое соединение, материал или композицию, которые могут приниматься пациентом в выбранном количестве без негативного воздействия или без существенного изменения здоровья или нормального функционирования его организма (например, без фиксирования какого-либо статуса неприемлемой токсичности, вызывающей любой экстремальный или неконтролируемый аллергический отклик, или без установления каких-либо ненормальных патологических условий или состояния болезни).

Подходящими водными жидкими носителями являются вода, обычно стерильная, не содержащая пирогенов вода (чтобы предотвратить по возможности загрязнение промежуточного лиофилизованного продукта), водные растворы, такие как солевые растворы (которые могут быть преимущественно сбалансированы так, чтобы конечный продукт для инъекций не был гипотоническим), или водные растворы одной или более субстанций, регулирующих тонус, как соли или сахара, сахарные спирты, гликоли или другие неионные полиоловые материалы (например, глюкоза, сахароза, сорбит, маннитол, глицерин, полиэтиленгликоли, пропиленгликоли и им подобные).

Органический растворитель

Используемый здесь термин "по существу не смешиваемый с водой", относящийся к органическому растворителю, означает, что когда указанный растворитель смешан с водой, образуются две отдельные фазы. Не смешиваемые с водой растворители обычно известны в уровне техники как аполярные или неполярные растворители, в отличие от полярных растворителей (таких, как вода). Не смешиваемые с водой растворители, как правило, почти не растворимы в воде. Для целей настоящего изобретения органическими растворителями, подходящими для эмульгирования с водным растворителем, являются растворители с растворимостью в воде менее примерно 10 г/л. Предпочтительно растворимость указанного растворителя в воде составляет примерно 1,0 г/л или меньше, более предпочтительно примерно 0,2 г/л или меньше и, намного более предпочтительно, примерно 0,01 г/л или меньше. Особенно предпочтительными растворителями являются растворители с растворимостью в воде 0,001 г/л или меньше. В частности, нерастворимые органические растворители (например, перфторуглероды) могут иметь растворимость вплоть до примерно 1,0·10^-6 г/л (например, перфтороктан 1,66·10^-6 г/л).

Органический растворитель предпочтительно является лиофилизуемым, т.е. указанный растворитель имеет достаточно высокое давление пара при температурах лиофилизации, например, между -30°C и 0°C, чтобы позволить эффективное и полное испарение/сублимацию в пределах приемлемых времен, например 24-48 часов. Предпочтительно давление пара органического растворителя выше примерно 0,2 кПа при 25°C.

Органический растворитель может быть выбран из широкого круга растворителей любой химической природы, то есть не смешиваемых с водой и лиофилизуемых, как указано выше, и которые предпочтительно являются жидкими при комнатной температуре (25°C). Если используется растворитель с точкой кипения ниже, чем комнатная температура, емкость, содержащая эмульгирующую смесь, может преимущественно быть охлаждена ниже точки кипения указанного растворителя, например, до 5°C или 0°C. Поскольку указанный растворитель будет полностью удален во время стадии лиофилизации, не существует никаких особых ограничений, за исключением того, что он не должен содержать загрязняющих веществ, которые не могут быть удалены путем лиофилизации или которые неприемлемы для применения в составах для инъекций.

Подходящие органические растворители включают, без ограничений, алканы, такие как разветвленные или предпочтительно прямые (C₅-C₁₀)-алканы, например пентан, гексан, гептан, октан, нонан, декан; алкены, такие как (C₅-C₁₀)-алкены, например, 1-пентен, 2-пентен, 1-октен; циклоалканы, такие как (C₅-C₈)-циклоалканы, возможно замещенные одной или двумя метильными группами, например циклопентан, циклогексан, циклооктан, 1-метилциклогексан; ароматические углеводороды, такие как бензол и производные бензола, замещенные одной или двумя метильными или этильными группами, например бензол, толуол, этилбензол, 1,2-диметилбензол, 1,3-диметилбензол; простые алкиловые эфиры и кетоны, такие как дибутиловый эфир и диизопропилкетон; галогенированные углеводороды или простые эфиры, такие как хлороформ, четыреххлористый углерод, 2-хлор-1-(дифторметокси)-1,1,2-трифторэтан (энфлюран), 2-хлор-2-(дифторметокси)-1,1,1-трифторэтан (изофлюран), тетрахлор-1,1-дифторэтан и, в частности, перфторированные углеводороды или простые эфиры, такие как перфторпентан, перфторгексан, перфторгептан, перфторметилциклогексан, перфтороктан, перфторнонан, перфторбензол и перфтордекалин, метилперфторбутиловый эфир, метилперфторизобутиловый эфир, этилперфторбутиловый эфир, этилперфторизобутиловый эфир и их смеси.

Количество растворителя обычно составляет от примерно 1 до примерно 50 об.% от количества воды, используемой для эмульсии. Предпочтительно указанное количество равно от примерно 1% до примерно 20%, более предпочтительно от примерно 2% до примерно 15% и еще более предпочтительно от примерно 5% до примерно 10%. При желании можно использовать смесь двух или более перечисленных выше органических растворителей, причем полное количество органического растворителя в эмульгирующей смеси находится в вышеуказанном диапазоне.

Лиопротективный агент

Термин лиопротективный агент или "лиопротектор" относится к соединению, которое, будучи включено в лиофилизуемую композицию, будет защищать химические соединения от отрицательных воздействий замораживания и вакуумирования, таких как воздействия, обычно сопровождающие лиофилизацию, например повреждение, адсорбция и потери от вакуума, применяемого в лиофилизации. Кроме того, после стадии лиофилизации указанный лиопротективный агент предпочтительно дает в результате твердую матрицу ("массу"), которая держит лиофилизованный фосфолипид.

Настоящее изобретение не ограничено применением конкретного лиопротектора; примеры подходящих лиопротекторов включают, без ограничений, углеводороды, такие как сахариды, моно-, ди- или полисахариды, например глюкозу, галактозу, фруктозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, лактозу, амилозу, амилопектин, циклодекстрины, декстран, инулин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал (HES), сахарные спирты, например маннитол, сорбит и полигликоли, такие как полиэтиленгликоли. Основательный список веществ с лиопротективным действием приведен в публикации Acta Pharm. Technol. 34 (3), pp. 129-139 (1988), содержание которого введено здесь ссылкой. Указанные лиопротективные агенты могут применяться по отдельности или как смеси одного или более соединений.

Предпочтительные лиопротекторы включают маннитол и полисахариды, такие как декстраны (в частности, с молекулярным весом более 1500 дальтон), инулин, растворимый крахмал и гидроксиэтилкрахмал.

Превосходные результаты дают также смеси маннитола или полисахаридов, таких как декстраны, инулин, растворимый крахмал, гидроксиэтилкрахмал, с сахаридами, такими как глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, трегалоза и эритритол.

Также настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным количеством используемого лиопротектора. Однако оптимальная весовая концентрация лиопротективных агентов в эмульсии до лиофилизации составляет от примерно 1 до примерно 25%, предпочтительно от примерно 2 до примерно 20% и еще более предпочтительно от примерно 5 до примерно 10%.

Более высокое количество может применяться, если лиофилизованному продукту необходимо также придать желаемую "массу".

Лиопротективный агент предпочтительно добавляют в водно-органическую смесь перед ее эмульгированием, следовательно, в этом случае эмульгирование водно-органической смеси проводится в присутствии лиопротективных агентов. Альтернативно, лиопротектор может быть добавлен в водно-органическую смесь после ее эмульгирования. В первом случае лиопротектор предпочтительно добавляют в водную среду перед смешиванием ее с органическим растворителем. При желании можно также комбинировать оба способа, например, добавляя часть лиопротективного агента в водную фазу, используемую для получения эмульсии, а часть - в полученную таким образом эмульсию. При желании в эмульсию могут, кроме того, добавляться также криозащитные агенты, такие как глицерин, для защиты химических соединений от отрицательного воздействия замораживания.

Фосфолипиды

В соответствии с настоящим описанием и формулой изобретения подразумевается, что термин фосфолипид охватывает любое амфифильное фосфолипидное соединение, молекулы которого способны образовывать пленку материала (типично в виде мономолекулярного слоя) на поверхности раздела газ-вода в конечной суспензии микропузырьков. Соответственно эти материалы обозначаются в уровне техники также "пленкообразующими фосфолипидами". Аналогично, в эмульгированной смеси эти амфифильные соединения обычно расположены на границе раздела между водной средой и органическим растворителем, по существу не растворимым в воде, тем самым стабилизируя эмульгированные микрокапли растворителя. Пленка, образованная этими соединениями на границе раздела газ-вода или вода-растворитель, может быть непрерывной или дискретной. Однако в последнем случае разрывы в пленке не должны быть такими, чтобы ухудшать стабильность (например, сопротивление давлению, устойчивость к коалесценции и т.д.) суспендированных микропузырьков или эмульгированных микрокапель соответственно.

Термин "амфифильное соединение", как он используется здесь, включает соединения, имеющие молекулу с гидрофильной полярной головкой (например, полярную или ионную группу), способную взаимодействовать с водной средой, и гидрофобную органическую хвостовую часть (например, углеводородную цепь), способную взаимодействовать, например, с органическим растворителем. Следовательно, эти соединения действуют, как правило, как "поверхностно-активное вещество", т.е. как соединения, которые способны стабилизировать смеси материалов, по-иному обычно несмешивающихся, таких как смеси двух несмешивающихся жидкостей (например, вода и масло), смеси жидкостей с газами (например, микропузырьки газа в воде) или смеси жидкостей с нерастворимыми частицами (например, металлические наночастицы в воде).

Амфифильные фосфолипидные соединения обычно содержат по меньшей мере одну фосфатную группу и по меньшей мере одну, предпочтительно две липофильные длинноцепочечные углеводородные группы.

Примеры подходящих фосфолипидов включают сложные эфиры глицерина с одним или предпочтительно двумя (одинаковыми или разными) остатками жирных кислот и с фосфорной кислотой, причем остаток фосфорной кислоты, в свою очередь, присоединен к гидрофильной группе, такой как холин (фосфатидилхолины - PC), серин (фосфатидилсерины - PS), глицерин (фосфатидилглицерины - PG), этаноламин (фосфатидилэтаноламины - PE), инозитол (фосфатидилинозитол) и им подобным группам. Сложные эфиры фосфолипидов с единственным остатком жирной кислоты обычно называют в уровне техники "лизо"-формами фосфолипида. Жирнокислотные остатки, присутствующие в фосфолипидах, являются обычно длинноцепочечными алифатическими кислотами, обычно содержащими от 12 до 24 атомов углерода, предпочтительно от 14 до 22; алифатическая цепь может содержать одну или более ненасыщенность или предпочтительно является полностью насыщенной. Примерами подходящих жирных кислот, содержащихся в фосфолипидах, являются, например, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, арахидоновая кислота, бегеновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота и линоленовая кислота. Предпочтительно применяются насыщенные жирные кислоты, такие как миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и арахидоновая кислота.

Дальнейшими примерами фосфолипидов являются фосфатидные кислоты, т.е. сложные диэфиры глицерина и фосфорной кислоты с жирными кислотами; сфинголипиды, такие как сфингомиелины, т.е. такие аналоги фосфатидилхолина, в которых остаток диэфира глицерина и жирных кислот замещен церамидной цепью; кардиолипины, т.е. сложные эфиры 1,3-дифосфатидилглицерина и жирной кислоты, гликолипиды, такие как ганглиозиды GM1 (или GM2) или цереброзиды, глюколипиды, сульфатиды и гликосфинголипиды.

Используемый здесь термин фосфолипиды включает встречающиеся в природе полусинтетические либо синтетические продукты, которые могут применяться по отдельности или как смеси.

Примерами встречающихся в природе фосфолипидов являются натуральные лецитины (производные фосфатидилхолина (PC)), такие как, обычно, соевые бобы или лецитины яичного желтка.

Примерами полусинтетических фосфолипидов являются частично или полностью гидрогенизированные производные природного лецитина. Предпочтительными фосфолипидами являются сложные диэфиры жирных кислот и фосфатидилхолина, этилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина, фосфатидной кислоты, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина или сфингомиелина.

Примерами предпочтительных фосфолипидов являются, например, дилауроилфосфатидилхолин (DLPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диарахидоилфосфатидилхолин (DAPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (Этил-DSPC), дипентадеканоилфосфатидилхолин (DPDPC), 1-миристоил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (MPPC), 1-пальмитоил-2-миристоилфосфатидилхолин (PMPC), 1-пальмитоил-2-стеароилфосфатидилхолин (PSPC), 1-стеароил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (SPPC), 1-пальмитоил-2-олеилфосфатидилхолин (POPC), 1-олеил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (OPPC), дилауроилфосфатидилглицерин (DLPG) и его соли с щелочными металлами, диарахидоилфосфатидилглицерин (DAPG) и его соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) и его соли с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG) и его соли с щелочными металлами, дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG) и его соли с щелочными металлами, диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG) и его соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидная кислота (DMPA) и ее соли с щелочными металлами, дипальмитоилфосфатидная кислота (DPPA) и ее соли с щелочными металлами, дистеароилфосфатидная кислота (DSPA), диарахидоилфосфатидная кислота (DAPA) и ее соли с щелочными металлами, димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE), диарахидоилфосфатидилэтаноламин(DAPE), дилинолеилфосфатидилэтаноламин (DLPE), димиристоилфосфатидилсерин (DMPS), диарахидоилфосфатидилсерин (DAPS), дипальмитоилфосфатидилсерин (DPPS), дистеароилфосфатидилсерин (DSPS), диолеоилфосфатидилсерин (DOPS), дипальмитоилсфингомиелин (DPSP), дистеароилсфингомиелин (DSSP).

Термин фосфолипид включает, кроме того, модифицированный фосфолипид, например фосфолипиды, где гидрофильная группа соединена, в свою очередь, с другой гидрофильной группой. Примерами модифицированных фосфолипидов являются фосфатидилэтаноламины, модифицированные полиэтиленгликолем (ПЭГ), т.е. фосфатидилэтаноламины, в которых гидрофильная этаноламиновая часть связана с молекулой ПЭГ различного молекулярного веса, например от 300 до 5000 дальтон, такие как DPPE-ПЭГ или DSPE-ПЭГ, т.е. DPPE (или DSPE), к которым присоединен полимер ПЭГ. Например, DPPE-ПЭГ2000 означает DPPE, к которому присоединен полимер ПЭГ со средним молекулярным весом примерно 2000. Как подробно поясняется далее, эти ПЭГ-модифицированные фосфолипиды предпочтительно применяются в комбинации с немодифицированными фосфолипидами.

Как нейтральные, так и заряженные фосфолипиды, а также их смеси могут удовлетворительно применяться в способе согласно настоящему изобретению. Как он используется здесь и в предшествующем уровне, термин "заряженный" в отношении "фосфолипидов" означает, что индивидуальные молекулы фосфолипида имеют суммарный ненулевой заряд, положительный или, чаще, отрицательный.

Примерами фосфолипидов, несущих суммарный отрицательный заряд, являются производные, в частности, жирнокислотных сложных диэфиров фосфатидилсерина, такие как DMPS, DPPS, DSPS; фосфатидной кислоты, такие как DMPA, DPPA, DSPA; фосфатидилглицерина, такие как DMPG, DPPG и DSPG. Также в качестве отрицательно заряженных молекул могут применяться модифицированные фосфолипиды, в частности ПЭГ-модифицированные фосфатидилэтаноламины, такие как DMPE-ПЭГ750, DMPE-ПЭГ1000, DMPE-ПЭГ2000, DMPE-ПЭГ3000, DMPE-ПЭГ4000, DMPE-ПЭГ5000, DPPE-ПЭГ750, DPPE-ПЭГ1000, DPPE-ПЭГ2000, DPPE-ПЭГ3000, DPPE-ПЭГ4000, DPPE-ПЭГ5000, DSPE-ПЭГ750, DSPE-ПЭГ1000, DSPE-ПЭГ2000, DSPE-ПЭГ3000, DSPE-ПЭГ4000, DSPE-ПЭГ5000, DAPE-ПЭГ750, DAPE-ПЭГ1000, DAPE-ПЭГ2000, DAPE-ПЭГ3000, DAPE-ПЭГ4000 или DAPE-ПЭГ5000. Также в качестве отрицательно заряженного соединения могут с успехом применяться лизоформы вышеуказанных фосфолипидов, такие как производные лизофосфатидилсерина (например, лизо-DMPS, -DPPS или -DSPS), производные лизофосфатидной кислоты (например, лизо-DMPA, -DPPA или -DSPA) и производные лизофосфатидилглицерина (например, лизо-DMPG, -DPPG или -DSPG).

Примерами фосфолипидов, несущих суммарный положительный заряд, являются производные этилфосфатидилхолина, в частности сложные эфиры этилфосфатидилхолина и жирных кислот, такие как 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (Этил-DSPC или DSEPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (Этил-DPPC или DPEPC).

Предпочтительно применяются смеси двух или более фосфолипидов, по меньшей мере одного незаряженного и по меньшей мере одного с суммарным ненулевым зарядом. Более предпочтительно применяются смеси двух или более фосфолипидов, по меньшей мере одного незаряженного и по меньшей мере одного с отрицательным суммарным зарядом. Количество заряженного фосфолипида может изменяться от примерно 95 до примерно 5 вес.% от полного количества фосфолипида, предпочтительно от 80 до 20 вес.%. Присутствие по меньшей мере небольших количеств, таких как от 5 до 20 вес.% от полного веса фосфолипида, (отрицательно) заряженного фосфолипида может помочь предотвратить агрегацию пузырьков или капель эмульсии. Однако можно использовать и один фосфолипид, нейтральный или заряженный, или смесь двух или более фосфолипидов, из которых все являются нейтральными или все имеют суммарный ненулевой заряд.

Предпочтительными фосфолипидами являются DAPC, DPPA, DSPA, DMPS, DPPS, DSPS, DPPE, DSPE, DSPG, DPPG и Этил-DSPC. Наиболее предпочтительны DSPA, DPPS или DSPS.

Предпочтительными смесями фосфолипидов являются смеси DPPS с DPPC, DSPC или DAPC (от 95/5 до 5/95 вес./вес.), смеси DSPA с DSPC или DAPC (от 95/5 до 5/95 вес./вес.), смеси или DSPG, или DPPG с DSPC, или смеси DSPC с Этил-DSPC. Наиболее предпочтительны смеси DPPS/DSPC (от 50/50 до 10/90 вес./вес.) или DSPA/DSPC (от 50/50 до 20/80 вес./вес.).

Количество фосфолипида обычно составляет от примерно 0,005 до примерно 1,0 вес.% от полного веса эмульгированной смеси. Конечно, могут применяться и более высокие количества, но принимая во внимание, что конечный продукт является впрыскиваемым контрастным веществом, предпочтительно не применять избыточное количество добавок, только если это не является строго необходимым для получения стабильного и пригодного продукта. Вообще, при использовании большего количества фосфолипида, чем указанное в качестве верхнего предела вышеуказанного диапазона, не наблюдается никакого или очень незначительное улучшение с точки зрения популяции пузырьков, распределения пузырьков по размерам и стабильности пузырьков. Обычно более высокие количества фосфолипида требуются, когда используются повышенные объемы органического растворителя. Таким образом, когда объем органического растворителя доходит до примерно 50% объема водной фазы, в эмульсию может быть с успехом добавлено примерно 1% (вес./вес.) фосфолипида. Предпочтительно количество фосфолипида составляет от 0,01 до 1,0 вес.% от общего веса эмульгированной смеси, более предпочтительно от примерно 0,05 до 0,5 вес.%.

Как указано выше, микропузырьки, полученные согласно способу изобретения, стабилизированы преимущественно фосфолипидом, как определенный выше. В частности, оболочка, окружающая наполненные газом микропузырьки, образована более чем на 50% (вес./вес.), предпочтительно по меньшей мере на 80% и намного более предпочтительно по меньшей мере на 90% из фосфолипидного материала, как определенный выше. Обычно стабилизирующая оболочка микропузырьков по существу полностью образована фосфолипидом.

Однако с фосфолипидом могут быть смешаны другие амфифильные материалы, образующие стабилизирующую оболочку наполненных газом микропузырьков, в количестве менее 50% от полного веса эмульгирующего состава.

Примеры подходящих дополнительных стабилизирующих оболочку амфифильных материалов включают, например, лизолипиды; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, арахидиновая кислота, арахидоновая кислота, бегеновая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота или линоленовая кислота и их соответствующие соли с щелочами или щелочными металлами; липиды, несущие полимеры, такие как хитин, гиалуроновая кислота, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль (ПЭГ), называемые также "пегилированными липидами"; липиды, имеющие сульфированные моно-, ди-, олиго- или полисахариды; липиды с жирными кислотами, связанными простой или сложноэфирной связью; полимеризованные липиды; диацетилфосфат; дицетилфосфат; стеариламин; церамиды; полиоксиэтилированные сложные эфиры жирной кислоты (такие, как полиоксиэтилированные стеараты жирных кислот); полиоксиэтилированные жирные спирты; полиоксиэтилированных простые эфиры жирных спиртов; полиоксиэтилированные сложные эфиры сорбита и жирной кислоты, модифицированный полиоксиэтиленом глицеринрицинолеат; этоксилированные стерины соевых бобов; этоксилированное касторовое масло; блок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО); стериновые сложные эфиры сахарных кислот, в том числе глюкурониды холестерина, глюкорониды ланостерина, 7-дегидрохолестеринглюкоронид, эргостеринглюкоронид, холестеринглюконат, ланостеринглюконат или эргостеринглюконат; сложные эфиры сахарных кислот и спиртов, в том числе лаурилглюкоронид, стеарилглюкоронид, миристоилглюкоронид, лаурилглюконат, миристоилглюконат или стеароилглюконат; сложные эфиры сахаров с алифатическими кислотами, в том числе лаурат сахарозы, лаурат фруктозы, пальмитат сахарозы, стеарат сахарозы, глюкуроновая кислота, глюконовая кислота или полиуроновая кислота; сложные эфиры глицерина с (C₁₂-C₂₄)-, предпочтительно (C₁₄-C₂₂)-дикарбоновыми жирными кислотами и их соответствующими солями с щелочью или солями с щелочными металлами, такие как 1,2-дипальмитоил-sn-3-сукцинилглицерин или 1,3-дипальмитоил-2-сукцинилглицерин; сапонины, в том числе сарсасапогенин, смилагенин, гедерагенин, олеаноловая кислота или дигитоксигенин; длинноцепочечные (C_l2-C₂₄)-спирты, в том числе н-дециловый спирт, лауриловый спирт, миристиловый спирт, цетиловый спирт или н-октадециловый спирт; 6-(5-холестен-3β-илокси)-1-тио-β-D-галактопиранозид; дигалактозилдиглицерид; 6-(5-холестен-3β-илокси)-гексил-6-амино-6-деокси-1-тио-β-D-галактопиранозид; 6-(5-холестен-3β-илокси)гексил-6-амино-6-деоксил-1-тио-β-D-маннопиранозид; 12-(((7'-диэтиламинокумарин-3-ил)карбонил)мети