Способ получения клеточной культуры для лечения сосудистых и демиелинизирующих заболеваний нервной системы и клеточная культура, полученная этим способом (варианты)

Способ получения клеточной культуры для лечения сосудистых и демиелинизирующих заболеваний нервной системы и клеточная культура, полученная этим способом (варианты)

Реферат

Изобретение относится к области медицины и может использоваться в способах получения препаратов для терапии больных с неврологической патологией различного генеза, таких как рассеянным склерозом и цереброваскулярными заболеваниями, сопровождающимися ишемией головного мозга (инфаркт головного мозга, внутримозговое кровоизлияние, хроническая ишемия головного мозга, дисциркуляторная энцефалопатия), а также заболеваний, связанных с дегенерацией тканей и аутоиммунными реакциями (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, миастения, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, мозжечковая дегенерация, последствия медленных нейроинфекций и др.),

В связи со сложностью структурно-функциональной организации нервной системы, ограниченностью сведений о причинах и особенно о механизмах развития патологических состояний, трудностями воздействия на соответствующие звенья патогенеза, сложностями биохимических высокоэнергозатратных церебральных нейро-глиальных перестроек архитектоники, лечение многих неврологических заболеваний всегда считалось одной из наиболее трудных задач клинической медицины,

Именно в силу сложной многоуровневой организации адекватного функционирования человеческий мозг и все структуры нервной системы являются плохо защищенными даже от минимальных экстра- или интрацеребральных воздействий; болезней, травм, воспалений, повреждений.

Повреждения структур центральной нервной системы наиболее плохо поддаются медикаментозной или хирургической коррекции, в силу чего на протяжении всей истории клинической медицины наиболее скромные успехи были достигнуты именно в разработке методов лечения тяжелых заболеваний нервной системы.

В то же время быстрое техногенное развитие человечества ведет к увеличению социально значимых болезней, к которым относятся и многие виды патологии нервной системы, прежде всего сосудистые заболевания головного и спинного мозга, травмы нервной системы, тяжелые эндотоксикозы с диффузными нейрональными повреждениями, демиелинизирующие и инфекционные заболевания. Высокая заболеваемость этими инвалидизирующими формами неврологической патологии делают проблему поиска рациональных средств и методов терапии уже не только медицинской, но и социальной.

Сложность функционально-морфологической организации эффективного функционирования центральной нервной системы, ее крайне низкая резистентность к таким повреждающим факторам, как ишемия и гипоксия, проводит к тому, что самые современные методы терапии сосудистых заболеваний нервной системы позволяют вернуться к «доинсультному» уровню жизни не более чем 25% пациентов. Остальные пациенты остаются инвалидами. Около 45% больных, перенесших инсульт, остаются тяжелыми инвалидами, нуждающимися в посторонней помощи, длительных и крайне дорогостоящих курсах реабилитации. Нерешенным остается в настоящее время и вопрос, касающийся больных с хронической ишемией головного мозга, заболевание которых имеет неуклонно прогрессирующий характер течения и приводящее к тяжелой деменции и инвалидизации.

К тяжело инвалидизирующим заболеваниям нервной системы относится и рассеянный склероз - хроническое прогрессирующее мультифакториальное заболевание нервной системы, развивающееся в результате аутоиммунного процесса, повреждающего миелин, являющийся главным «изолятором», обеспечивающим аксональную синаптическую передачу.

Формирующиеся в процессе возникновения и прогрессирования рассеянного склероза патоморфологические изменения структур центральной нервной системы проявляются очагами демиелинизации, т.н. бляшками. Очаги демиелинизации связаны с разрушением миелиновой оболочки проводящих путей центральной нервной системы, что и обуславливает быстрое развитие и стойкий характер очаговых неврологических расстройств, характерных для прогредиентного течения рассеянного склероза. Одновременно с процессом демиелинизации по краям бляшки в ряде случаев могут идти процессы ремиелинизации, обуславливающие ремиттирующее течение заболевания, однако, чаще всего они незначительно выражены и восстановление миелиновой оболочки по интенсивности и скорости несопоставимо с ее распадом. Запущенные патоиммунохимические дизрегуляции, вызванные особенностями системного и нейронального метаболизма при прогредиентном течении рассеянного склероза, крайне редко самостоятельно поддаются обратному развитию, приводя к стойкой инвалидизации больных молодого возраста, что, учитывая высокую заболеваемость, становится в настоящее время значительной медицинской и социальной проблемой.

Значимость этой проблемы усугубляется недостаточной эффективностью всех известных на сегодняшний день методов терапии. Самыми широко применяющимися способами лечения рассеянного склероза являются: иммунносупрессивная терапия большими дозами кортикостероидов, применение цитостатиков, селективных иммуносупрессоров, интерферонов-бета, применение интерферонов-альфа.

Однако все эти методы терапии отличаются очень высокой стоимостью, необходимостью длительного (практически постоянного) применения, большим количеством побочных действий и эффективны далеко не у всех больных с рассеянным склерозом, что обуславливает необходимость поиска новых более эффективных методов терапии.

Именно в связи с огромным числом нерешенных до настоящего момента проблем лечения больных с ишемией головного мозга, рассеянным склерозом и другими неврологическими заболеваниями революционным шагом для клинической неврологии и в то же время патогенетически направленным методов терапии стала разработка методов терапевтического применения клеток-предшественников (стволовых прогениторных клеток) у данной категории больных.

Основные принципы лечения путем трансплантации клеточных препаратов клетками заключаются в доставке к месту поломки дифференцированных клеток новых плюрипотентных клеток, которые под воздействием окружающих тканей дифференцируются в зрелые, способные выполнять специализированную функцию клетки, или в стимуляции пролиферации и дифференцировки собственных стволовых клеток биологически активными веществами, секретируемыми трансплантированными клетками.

В больных органах и тканях процессы самообновления клеток нарушены. Дисбаланс самообновления стволовых клонов паренхимы/мезенхимы лежит в основе так называемых дегенеративных заболеваний, таких как атеросклероз, цирроз печени, «возрастные» изменения в легких и почках, глиоз и возрастная дегенерация головного и спинного мозга. Этим же в значительной степени объясняется невозможность восстановления пораженных участков мозга при инсульте, рассеянном склерозе, при повреждении мозга в результате травмы, гипоксии и т.д.

В середине 1970-х годов А.Я.Фриденштейн с сотрудниками показали, что строма гематогенной ткани взрослых мышей и человека содержит плюрипотентные клетки, которые можно клонировать в различные линии. В постмитотическом состоянии эти клетки дифференцировались в остеобласты, адипоциты, хондроциты, миоциты. Эти плюрипотентные клетки были названы мезенхимальными стволовыми клетками. Таким образом, было показано, что стволовые регионарные клетки не только эмбриона, но и взрослого организма наделены пластичной плюрипотентностью, т.е. способностью активно развиваться, размножаться, продуцировать различные линии дифференцировки и кардинально менять метаболизм окружающих их тканей.

Началом пути к современной клеточной терапии у пациентов с патологией нервной системы стали пришедшиеся на 80-е годы попытки пересадки эмбриональных нервных тканей.

Первым шагом в данном направлении было начатое в 1998 года исследование эффективности пересадки эмбриональной ткани (нейротрансплантация эмбриональной нервной ткани). В организме человека из-за особенностей метаболизма существует несколько иммунологически привелигированных мест, где пересадка не вызывает отторжения. К ним относится в том числе центральная нервная система, нервные стволы, ряд других органов.

Известен способ приготовления клеточного трансплантанта из фетальных тканей абортивного плода 17-21 недели внутриутробного развития для лечения широкого круга заболеваний, в том числе для лечения рассеянного склероза, при этом трансплантант должен содержать преимущественно клетки промежуточной области мозга, которые в наибольшей степени подвержены миграции (патент RU №2160112, опубл. 10.04.2000 г.).

Однако многочисленные этические и деонтологические проблемы применения эмбриональных тканей значительно ограничивают возможности данного метода применения стволовых клеток, в том числе у больных с нейродегенеративными заболеваниями и рассеянным склерозом.

Известен «Биотрансплантант, способ его получения (варианты) и способ лечения ишемической болезни сердца (патент RU 2268061, опубл. 20.01.2006 г.) Биотрансплантант содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из фетального (печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель гестации для последующей аллотрансплантации) или донорского (костный мозг, подкожная жировая ткань, тимус у детей 6 лет для последующей аутотрансплантации) материала или из ткани скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности для лечения ишемической болезни сердца. Трансплантант вводят в нативную и/или стенозированную коронарную артерию и/или аортокоронарный шунт соответственно. МСК выращивают в виде прикрепленных колоний на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл гепарина. Из указанного патента также известен препарат для лечения мезенхимальными стволовыми клетками больных с ишемической болезнью сердца.

Так же в 2006 году был изобретен «Биотрансплантант и способ лечения хронической ишемии нижних конечностей» (патент RU 2286159, опубл. 27.10.2006 г.), в котором биотрансплантант получен из МСК фетального (печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель гестации для последующей аллотрансплантации) или донорского (костный мозг, подкожная жировая ткань, тимус у детей 6 лет для последующей аутотрансплантации) материала, из миобластов фетальных скелетных мышц плодов человека 1-2 триместра беременности или из мышечной ткани взрослого человека (полученных при биопсии), а также из фибробластов кожи фетусов человека 1-2 триместра беременности, кожи взрослого человека (полученной в результате пластических операций или биопсии), липоаспиратов для лечения хронической ишемии нижних конечностей и ее осложнений. Клеточная терапия хронической ишемии нижних конечностей складывается из введения культивированного биотрансплантанта в общую бедренную терапию (100-500 млн МСК) при операции бедренно-тибиально-подколенного или бедренно-тибиального аутовенозного шунтирования, по другому варианту - инъекции МСК той же дозировки в мышцы голени, а при развитии атрофии мышц в пораженные мышцы вводят суспензию культуры миобластов, при язвенно-некротических осложнениях ишемии нижних конечностей дефект обкладывают суспензией, содержащей МСК и фибробласты.

Однако применение эмбриональных клеток в России запрещено законом о «клонировании» и не используется по этическим мотивам. Кроме того, на моделях животных женских особей доказано, что слишком большие дозировки стволовых клеток могут привести к негативным результатам. Нерешенность ряда морально-этических и юридических проблем трансплантологии эмбриональных тканей исключает практическое применение части исследований, что серьезно тормозит развитие названного направления терапии.

Известен способ нейрохирургической стереотоксической терапии инсульта составом человеческих нейральных клеток, клеточный препарат, а также источник и способ его получения для терапии инсульта (заявка US 2003/ 0211085, опубл. 13.11.2003 г.). На основании данного способа проведены многочисленные рандомизированные исследования.

Однако необходимость нейрохирургического вмешательства значительно ограничивает возможности известного способа применения стволовых клеток, несмотря на его потенциально высокую целесообразность и явную саногенетическую направленность. Методы нейротрансплантации непосредственно в пораженные участки мозга чрезвычайно сложны и являются крайне дорогостоящими, при этом они не всегда безопасны для пациента. Клинические же эффекты этих операций оказались в ряде случаев кратковременными, а иногда сомнительными.

Современным шагом в направлении клеточной терапии являются исследования крови и тканей пуповины, плаценты человека, которые рассматриваются в настоящее время в качестве одного из оптимальных источников стволовых клеток, обладающих высоким прогенераторным потенциалом.

Пуповинная кровь и ткани пуповины являются достойным альтернативным источником стволовых клеток для трансплантации при многих тяжелых заболеваниях крови, наследственных нарушениях метаболизма, патологии центральной нервной системы и могут использоваться для аллогенной и аутологичной трансплантации.

Стволовые клетки, в больших количествах присутствующие в пуповинной крови и тканях пуповины, обладают высокой пролиферативной активностью, а также характеризуются наличием высокого титра маркера плюрипотентности и функциональной активности стволовых клеток т.н.- CD34+.

В пуповинной крови, помимо высокого содержания стволовых клеток, также содержится большое число Т-лимфоцитов, которые ответственны за ингибирование реакций "трансплантант против хозяина" и оказывают противоопухолевое действие.

Известен также способ выделения мезенхимальных стволовых клеток (заявка на выдачу патента RU 2004110701/13, опубл. 09.04.2004 г.), который раскрывает формулу выделения МСК из жировой ткани, децидуальной или амниотической оболочки, хориальной стромы плаценты человека, включая обработку тканей раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбенко.

До настоящего времени продолжаются широкие эксперименты in vivo, подтверждающие высокую плюрипотентность, способность к дифференцировке и высокий уровень метаболизма стволовых клеток, полученных из плаценты, пуповинной крови и тканей пуповины.

Наиболее близким является способ получения препарата из костного мозга, пуповинной крови и периферической крови для терапии заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) (заявка ЕР 1658853, опубл. 27.01.2005 г., «Remedy for internal administration against cranial nerve disease containing mesenchimal cell as the active ingredient»). Из указанного источника информации известен также препарат для терапии инфаркта головного мозга для внутривенного введения пациенту, обладающий нейропротективным, регенераторным действием, что было подтверждено экспериментальными исследованиями.

Рядом экспериментальных исследований к настоящему времени показано, что выделяемые введенными стволовыми клетками нейрогуморальные факторы оказывают воздействие на нервную ткань реципиента, в том числе стимулируя аксоно-, миело- и ангиогенез.

Таким образом, на сегодняшний день не вызывает сомнения тот факт, что в ряде случаев введенные различными способами, в том числе внутривенно, донорские стволовые клетки не только жизнеспособны в организме реципиента, но и могут развиваться там, превращаясь в определенные специализированные клеточные формы и выделяя биологически активные вещества, воздействующие на окружающие ткани мозга, что способствует процессам репарации, неоангиогенезу и усилению нейропластичности.

Кроме того, сами прогениторные мезенхимальные стволовые клетки обладают выраженной иммунодепрессивной активностью, а клетки пуповинной крови и плаценты не обладают иммуногенностью, в связи с чем могут быть эффективными при лечении заболеваний, связанных с дегенерацией тканей и аутоиммунными реакциями (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, болезнь Хантингтона, мозжечковая дегенерация, последствия медленных нейроинфекций и др.), а также для лечения сосудистых и демиелинизирующих заболеваний.

В то же время ограничением известных способов получения препаратов для лечения неврологических заболеваний, в том числе сосудистых и демиелинизирующих заболеваний нервной системы, являются их значительная трудоемкость, а получаемые препараты обладают еще недостаточно высоким терапевтическим эффектом и не могут достаточно долго храниться до момента проведения клеточной терапии.

Решаемая изобретением задача - улучшение качества получаемого препарата и усиление терапевтического эффекта при лечении заболеваний центральной нервной системы (ЦНС).

Технический результат, который может быть получен при осуществлении заявленного способа, - улучшение качественных показателей получаемых препаратов, таких как стойкость клинического позитивного эффекта при клеточной терапии неврологических заболеваний, в том числе демиелинизирующих заболеваний и заболеваний, сопровождающихся ишемией головного мозга.

Технический результат, который может быть получен при изготовлении препарата, - повышение его пролиферативного потенциала и уменьшение экспрессии антигенов гистосовместимости, увеличение регенерации поврежденных нервных тканей, что клинически сопровождается более значимым регрессом неврологической симптоматики, снижением инвалидизации и улучшением качества жизни пациентов и безопасности использования препарата.

Дополнительный технический результат, который может быть достигнут, - увеличение срока хранения препарата до проведения сеанса клеточной терапии, расширение функциональных возможностей при введении его в организм пациента.

Для решения поставленной задачи с достижением указанного технического результата по первому варианту осуществления изобретения в известном способе получения препарата при лечении заболеваний нервной системы, включающем выделение из пуповины новорожденного после нормальных родов культуры стволовых клеток, согласно изобретению осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении аллогенных мезенхимальных стволовых клеток пуповину освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина 100 ед./мл, 100 ед./мл амфотерицина в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1% раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок клеток, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл. пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспензированный осадок клеток в ростовой среде DMEM переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду DMEM 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3, а перед проведением клеточной терапии монослой переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2, затем суспензию осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспензируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки пуповины в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл.

Для решения поставленной задачи с достижением указанного технического результата по второму варианту осуществления изобретения в известном способе получения препарата при лечении заболеваний нервной системы, в том числе сосудистых и демиелинизирующих заболеваний, включающем выделение из плаценты новорожденного после нормальных родов культуры стволовых клеток, согласно изобретнию осуществляют выделение культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток для парентерального введения их пациенту с неврологической патологией, при выделении культуры аллогенных мезенхимальных стволовых плаценту освобождают от остатков крови и промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина 100 ед./мл, 100 ед./мл амфотерицина в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере, затем нарезают ткань плаценты на куски размером 1 см³ и обрабатывают их 0,1% раствором трипсина, приготовленным на среде DMEM, свободной от сыворотки, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани плаценты, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл. пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, ресуспензированный осадок в среде переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3, а перед проведением клеточной терапии монослой клеток переводят в суспензию путем обработки смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 1:1 в течение 20 мин при 37°С, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2, затем клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе, получая аллогенные мезенхимальные стволовые клетки плаценты в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл.

Возможны дополнительные варианты осуществления способа по первому и второму вариантам, в которых целесообразно, чтобы:

- выделение аллогенных мезенхимальных клеток производили из пуповины новорожденного после нормальных родов на 38-40 недели гестации.

Препарат для клеточной терапии при лечении заболеваний нервной системы включает полученную из пуповины новорожденного культуру стволовых клеток для парентерального введения их пациенту, при этом он получен с возможностью выделения культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в соответствии со способом по первому варианту, а количество аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в стерильном физиологическом растворе - в диапазоне от 1 до 5 млн клеток в 5 мл раствора.

Препарат для клеточной терапии при лечении заболеваний нервной системы включает полученную из плаценты новорожденного культуру стволовых клеток для парентерального введения их пациенту, при этом он получен с возможностью выделения культуры аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в соответствии со способом по второму варианту, а количество аллогенных мезенхимальных стволовых клеток в стерильном физиологическом растворе препарате - в диапазоне от 1 до 5 млн клеток в 5 мл раствора.

Для клеточной терапии неврологических заболеваний возникла необходимость получения мезенхимальных клеток из плаценты и/или пуповины новорожденного человека (с согласия роженицы) и их криоконсервации и хранения с возможностью дальнейшего использования.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА ПО ПЕРВОМУ ВАРИАНТУ (клеточный материал из пуповины человека: получение, культивирование, хранение и транспортировка).

1. Тестирование донора.

Перед забором биологического материала проводится тестирование донора.

Требования к забору крови для тестирования:

1. Забор крови должен осуществляться с соблюдением всех правил асептики и антисептики.

2. Материал забирается в 2 пробирки по 5 миллилитров каждая.

3. Хранение и транспортировка забранной крови должны осуществляться в специальных герметичных пробирках (вакутейнерах).

4. Материал должен быть доставлен в культуральную лабораторию не позднее чем через 24 часа от момента забора.

5. При краткосрочном хранении до транспортировки и при транспортировке обязательно соблюдение температурного режима от +2°С до +8°С.

Образцы крови доноров исследуются на наличие маркеров следующих инфекционных агентов:

- вирусов гепатита В и С;

- вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типов;

- вируса герпеса простого 1, 2 и 6 типов;

- вируса Эпштейна-Барр;

- цитомегаловируса;

- Toxoplasma Gondi;

- сифилиса.

При заборе пуповины дополнительно, к вышеперечисленным анализам образцов крови, донорам (матерям) проводится исследование соскоба из цервикального канала на наличие маркеров уреоплазмы, хламидии и микоплазмы.

Выявление таких инфекций, как ВИЧ, сифилис, а также острых форм гепатитов В и С, является абсолютным противопоказанием для культивирования биологического материала и введения полученных клеток реципиенту.

В случае выявления других инфекционных агентов у донора либо при наличии антител к ним решение о культивировании биологического материала и возможности введения клеточного препарата реципиенту принимает врач.

В нашем исследовании выявление любых инфекционных агентов или антител к ним являлось абсолютным противопоказанием для культивирования биологического материала.

2. Забор биологического материала.

Образцы пуповины человека собирют после нормальных родов на 38-40 недели гестации. После перевязки и перерезания пуповину помещают в стерильный контейнер, содержащий раствор Хенкса с добавлением пенициллина 100 мг/мл, стрептомицина 100 мг/мл и амфотерицина 100 мг/мл.

Образец помещается в стерильную изопропиленовую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл, заполненную средой для транспортировки биоматериала (например, среда Хенкса или физ. р-р с 10% аутосыворотки с добавлением антибиотика и антимикотика). Пробирка с биоматериалом помещается в термос со льдом или в сумку-холодильник, где поддерживается температура +2 - +8°С. Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 24 часов.

Биоматериал принимается только при наличии минимум 10 мл цельной крови для тестирования на инфекционные возбудители. Кровь транспортируется в тех же условиях, что и образцы биоматериала, т.е. стерильно и в холоде (+2 - +8°С).

В среднем на получение достаточного количества клеток для тестирования на инфекционные возбудители и на заморозку для криохранения уходит от 30-ти до 60-ти дней.

3. Получение и культивирование клеточных культур.

Пуповину освобождают от остатков крови и тщательно промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина 100 ед./мл, 100 ед./мл амфотерицина) в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере, вены канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1% раствором коллагеназы 1 типа, приготовленным на среде DMEM, свободной от сыворотки, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок, который ресуспензируют в ростовой среде:

DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл. пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия. Ресуспензированный осадок в среде переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду 2 раза в неделю. При достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3

Для приготовления клеточного материала перед введением монослой клеток обрабатывают смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина (1:1) в течение 20 мин при 37°С, получая клеточную суспензию, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2. Затем клетки осаждают центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в стерильной среде для транспортировки в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл, получая готовый препарат. Непосредственно перед введением клеточный материал необходимо перевести в стерильный физиологический раствор.

4. Типирование полученных культур клеток.

Типирование клеточных культур, т.е. исследование того, к каким цитофенотипам относятся культивируемые клетки, осуществляют с помощью микроскопии неокрашенных препаратов и путем детекции специфических белков-маркеров цитофенотипов методами иммуноцитохимии и проточной цитофлуорометрии.

Все клетки экспрессировали виментин-белок цитоплазматического скелета клеток, что является характерным для клеток мезенхимального ряда.

Полученные культуры были также исследованы на эспрессию маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD44 (НСАМ), CD49b (α₂β₁ integrin), CD54 (ICAM), CD90 (Thy-1), CD105 (endoglin), CD117 (c-kit). Иммуноцитохимическое окрашивание клеток пуповины не выявило различий в уровне экспрессии маркеров CD49b, CD90, CD117. Значительное количество клеток полученных культур экспрессировали маркер CD117 на уровне, близком к фоновому.

Уровень экспрессии CD49b был низким. Уровень экспрессии CD90 также был низким.

В комплекс белков CD44 входит белок pgpl, являющийся одним из белков-транспортеров, обеспечивающих мультилекарственную устойчивость клеток. Известно, что значительное количество таких молекул, позволяющих поддерживать внутриклеточный гомеостаз и высокий уровень пролиферации даже в неблагоприятных условиях, выявляется на стволовых и прогениторных клетках. Высокий уровень экспрессии CD44 обнаруживался в культурах клеток пуповины, что является свидетельством значительного количества стволовых и прогениторных клеток в этих культурах.

Значительная часть популяции клеток пуповины экспрессировала нестин - маркер незрелых и прогениторных клеток.

Значительная часть популяции клеток пуповины экспрессировала также коллагены I и II типов. В культурах клеток пуповины 20% экспрессировали маркер эндотелиоцитов - фактор фон Виллибранда.

Было обнаружено, что, помимо вышеперечисленных маркеров, мезенхимальные клетки пуповины выделяли широкий спектр ангиогенных факторов.

Уровень экспрессии белков главного комплекса гистосовместимости (МНС I класса) в культурах клеток - важный показатель, который необходимо учитывать при оценке пригодности клеток для трансплантации. Культура клеток пуповины была неоднородна. В ней встречались мелкие клетки со средним уровнем экспрессии МНС I класса, а также крупные распластанные клетки, экспрессирующие эти белки на фоновом уровне. Полученные результаты позволяют обосновать применение клеток пуповины для аллогенных трасплантаций в связи с низким уровнем иммунного ответа организма на введение этих клеток.

5. Потенциал дифференцировки клеток пуповины.

Мезенхимальные клетки пуповины являются мультипотентными, что подтвердилось дифференцировкой полученных культур в различные ткани, в том числе в нервную, жировую, хрящевую, костную.

Дифференцировку клеток плаценты в нервную ткань проводили в среде, содержащей глюкозу, трансферин, прогестрон, путресцин, хлорид селена, глутамин, бикарбонат натрия, HEPES, гепарин, EGF. По окончании времени дифференцировки клетки окрашивали антителами к Tuj I, GFAP, Nestin, MAP-2, (ЗШ-тубулину. Часть клеток экспрессировала эти маркеры.

Дифференцировку полученных культур в жировую ткань проводили в среде, содержащей гидрокортизон, изобутилметилксантин, индометацин. Клетки пуповины накапливали жировые вакуоли, окрашенные в красный цвет жировым красным.

Дифференцировку полученных культур в костную ткань проводили в среде без сыворотки, содержащей аскорбиновую кислоту, глицерофосфат кальция, дексаметазон, в течение 3 недель. В клетках пуповины увеличивалась экспрессия маркерных белков остеобластов (остеонектина, остеопонтина и костного сиалопротеина), однако они не образовывали локусов окостенения.

Дифференцировку полученных культур в хрящевую ткань проводили в среде без сыворотки, содержащей дексаметазон, пролин, пируват, TGF-bl, TGF-ЬЗ, в течение 3 недель. Через 3 недели в культуре появлялись клетки, которые давали положительную окраску на сафранин О.

6. Тестирование полученных культур клеток.

Полученные культуры клеток проходили следующие испытания.

1. Вирусологические исследования согласно протоколу на наличие маркеров вирусов гепатитов В и С, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типов, вируса герпеса простого 1, 2 и 6 типов, вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса, Toxoplasma Gondi.

2. Бактериологическое исследование согласно протоколу на наличие аэробной и анаэробной микрофлоры, а также микроскопических грибов.

На каждый клеточный препарат выдается паспорт соответствия с указанием результатов обследования культуры, объема, концентрации клеток, срока годности.

7. Криохранение клеточного материала.

Клеточный материал переводится в среду для заморозки (ДМСО с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка) и помещается на длительное хранение в жидкий азот. Минимальное количество клеток, замораживаемых и помещаемых на хранение, 3 млн. Максимальный предел не установлен.

8. Приготовление суспензии клеток перед введением.

Мезенхимальные клетки пуповины переводят в суспензию путем трипсинизации, трижды промывают физиологическим раствором (рН 7,2) и суспендируют в забуференном физиологическом растворе в концентрации 1-5 млн клеток в 5 мл физиологического раствора. Все операции проводят в стерильных условиях культурального бокса.

9. Кратковременное хранение и транспортировка клеточной суспензии.

Кратковременное хранение и транспортировка клеточного материала проводились в стерильном вакутейнере (пробирка для забора крови) на холоду (+2 - +8°С). Для соблюдения температурного режима при транспортировке необходимо использовать термос или сумку-холодильник с охлаждающим агентом внутри. При соблюдении этих правил клеточный материал сохраняет свою жизнеспособность не менее 80% в течение 36-ти часов.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА ПО ВТОРОМУ ВАРИАНТУ (клеточный материал из плаценты человека: получение, культивирование, хранение и транспортировка).

Тестирование донора и забор биологического материала осуществляют так же, как в примере осуществления способа по первому варианту по пунктам 1 и 2, при этом в качестве биологического материала используют плаценту.

3. Получение и культивирование клеточных культур.

Плаценту максимально возможно освобождают от остатков крови и тщательно промывают в растворе Версена с добавлением антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина 100 ед./мл, 100 ед./мл амфотерицина) в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере, затем нарезают ткань плаценты на куски размером 1 см³ и обрабатывают их 0,1% раствором трипсина, приготовленным на среде DMEM, свободной от сыворотки, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое воздействие на ткани плаценты, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса. Полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, получая осадок, который ресуспензируют в ростовой среде: DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия. Ресуспензированный осадок в среде переносят в культуральные чашки и культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду 2 раза в неделю. При достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3.

Для приготовления клеточного материала перед введением монослой клеток обрабатывают смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина (1:1) в течение 20 мин при 37°С, получая клеточную суспензию, которую затем трижды промывают физиологическим раствором с рН 7,2. Затем клетки осаждают центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в стерильной среде для транспортировки в количестве от 1-5 млн клеток в 5 мл (д