Продукт микробного синтеза с противоопухолевой активностью (варианты)

Продукт микробного синтеза с противоопухолевой активностью (варианты)

Реферат

Изобретение относится к онкологии.

Известна медикаментозная композиция для лечения больных со злокачественными новообразованиями, состоящая из фетальной субстанции и фильтрата культуральной жидкости Bacillus mesentericus АБ-56. В качестве фетальной субстанции используется экстракт эмбриональной ткани человека или промышленно выпускаемый альфафетопротеин. Композиция позволяет индуцировать некроз опухолей в тех случаях, когда они не чувствительны к химиопрепаратам (Ru2112547).

Культуральная жидкость представляет собой смесь различных продуктов микробного синтеза, из которых не все обладают противоопухолевым эффектом, что не дает возможность стандартизировать этот продукт по противоопухолевому началу. Кроме того, в композиции используются два компонента.

Известен белок - продукт микробного синтеза, выделенный из культуральной жидкости Bacillus mesentericus АБ-56 и обладающий противоопухолевой активностью (Г.П.Потебня, Г.С.Лисовенко, С.И.Ялкут, Л.И.Русанова. Противоопухолевая вакцина повышает эффективность лечения онкологических больных/ Провизор, 2002, №5. Украина)(прототип).

Как было указано выше, в культуральной жидкости содержится смесь различных продуктов микробного синтеза, в том числе смесь различных белков, из которых не все обладают противоопухолевой активностью, что не дает возможность стандартизировать этот продукт по противоопухолевому началу. Из указанной работы Потебни Г.П. и соавторов неизвестна характеристика белка, обладающего противоопухолевой активностью.

Раскрытие изобретения

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что в качестве продуктов микробного синтеза с противоопухолевой активностью предлагается использовать полученные из культуральной жидкости Bacillus mesentericus АБ-56 белок с молекулярной массой 12-24 кД, а также липополисахарид.

Техническим результатом заявляемых изобретений является установление и выделение действующих противоопухолевых начал из культуральной жидкости Bacillus mesentericus АБ-56, что дает возможность стандартизировать противоопухолевые компоненты культуральной жидкости. Предлагаемые изобретения расширяют арсенал средств с противоопухолевой активностью.

Технология получения культуральной жидкости Bacillus mesentericus АБ-56:

культуральную жидкость 7-суточной культуры Bacillus mesentericus АБ-56, выращенной на мясопептонном бульоне по стандартной технологии при концентрации 3 млрд микробных тел в мл, отделяют от микробных тел центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин, после чего супернатант фильтруют через стерилизующую мембрану и переливают в стерильную посуду.

Технология выделения белка из культуральной жидкости

С помощью гель-электрофореза в 13%-ном полиакриламидном геле по Леммли (Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, vol. 227, p.680-685) был проведен анализ полученной культуральной жидкости Bacillus mesentericus АБ-56 на предмет присутствия в ней белка. Анализ показал, что культуральная жидкость содержит белок в концентрации 4 мг/мл.

Затем был проведен подбор концентрации сульфата аммония для выделения белка из культуральной жидкости (Скоупс Р. Методы очистки белков. 1985, М.: Мир, с.61-71). Основная масса белкового материала осаждалась при 65%-ной концентрации сульфата аммония.

Фракционирование белков культуральной жидкости осуществлялось по методике, описанной в предыдущем источнике с помощью 65%-ного сульфата аммония. 450 мл культуральной жидкости перемешивали с сульфатом аммония до 65%-ного насыщения, после чего оставляли на ночь при 4°С. Затем центрифугировали смесь культуральной жидкости с сульфатом аммония при 8000 об/мин в течение 30 мин. Полученный осадок растворяли в 5 мл буфера (10 мМ натрий-фосфат, рН 7,6; 0,05 М NaCl), наносили на колонку с сефак-рилом S-300 (1,2×90 см, V=100 мл) и промывали указанным выше буфером со скоростью потока 20 мл/час.

С помощью электрофореграммы установили, что первым выходит белок с молекулярной массой 115 кД, состоящий из 4-х субъединиц (1-я фракция). Вторым выходит белок с молекулярной массой 67 кД (2-я фракция). Далее выходит пик белков с молекулярными массами от 12 до 24 кД (3-я фракция). Собранные фракции переосаждали 65%-ным сульфатом аммония, осадки растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия и трижды диализовали против 100 объемов изотонического раствора хлорида натрия.

Концентрацию белка каждой фракции, диализованной против изотонического раствора хлорида натрия, определяли по Бредфорду (Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, vol.72, p.248-254). Концентрация белка во фракциях составила от 0,3 до 6 мг/мл.

Определение противоопухолевой активности белковых фракций культуральной жидкости (КЖ) Bacillus mesentericus АБ-56

Определение противоопухолевой активности проводили на солидном варианте линейно-неспецифической опухоли Кребс-2. Использовали мышей-самок линии GR. Прививку опухолей осуществляли в мышцы бедра по 2×10⁶ клеток опухоли Кребс-2 в 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Возникшую опухоль периодически измеряли по трем взаимно перпендикулярным направлениям и высчитывали объем опухоли.

Предварительно был проведен эксперимент по определению оптимальной концентрации белка. Испытывали следующие концентрации: 0,3; 1; 3; 6 мг/мл. Оптимальной оказалась концентрация 3 мг/мл, которая оказывала наиболее выраженное тормозящее действие на рост опухоли при одновременном отсутствии выраженного общетоксического действия.

Опухоль Кребс-2. После прививки опухоли мыши были разделены на 5 групп (4 подопытных и одна контрольная) по 8 особей в подопытных и 10 в контрольной группах. На следующий день подопытным мышам трех групп вводили под кожу дорзальной области 1 раз в день в течение 3-х дней по 0,25 мл каждой из белковой фракций в концентрации 3 мг/мл: первой группе животных вводили белок 1-й фракции, второй группе вводили белок 2-й фракции, третьей группе - белок 3-й фракции. Четвертой группе подопытных животных вводили 0,25 мл КЖ. Контрольным мышам аналогичным образом вводили 0,25 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Начиная с 7-х суток от прививки опухоли, проводили в динамике измерение объема опухолей. КЖ и белковые фракции 1 и 2 не оказывали тормозящего влияния на рост опухолей: на 8-е сутки объем опухолей составил в данных группах 1,1±0,2 см³, 1,3±0,2 см³ и 1,2±0,2 см³ соответственно (в контроле - 0,9±0,1 см³); на 11-е сутки объем опухолей составил 2,2±0,2 см³, 1,7±0,2 см³ и 1,9±0,3 см³ соответственно (в контроле - 2,1±0,1 см³), на 14-е сутки - 3,2±0,3 см³, 3,0±0,2 см³ и 3,4±0,3 см³ соответственно (в контроле - 3,1±0,3 см³), на 16-е сутки - 4,4±0,3 см³, 4,2±0,4 см³ и 4,4±0,3 см³ соответственно (в контроле - 3,9±0,4 см³).

Достоверно тормозящее влияние на рост опухоли Кребс-2, начиная с 13-14-х суток от начала ее введения, оказывала белковая фракции 3 (мол. масса 12-24 кД): объем опухоли в этой группе на указанный срок составил 1,9±0,2 см³ (в контроле - 3,1±0,3 см³), на 16-е сутки объем опухоли составил 1,6±0,1 см³ (в контроле - 3,9±0,4 см³), р<0,01 и р<0,001 соответственно.

Продукт микробного синтеза с противоопухолевой активностью, полученный из культуральной жидкости Bacillus mesentericus АБ-56, отличающийся тем, что представляет собой белок с молекулярной массой 12-24 кД, полученный путем фракционирования белков культуральной жидкости путем насыщения сульфатом аммония до 65%, центрифугирования, растворения осадка в буфере, представляющем собой 10 мМ натрий-фосфат, рН 7,6; 0,05 М NaCl с последующим нанесением на колонку с сефакрилом S-300, промывания указанным выше буфером со скоростью потока 20 мл/ч, при этом третья фракция содержит белок указанной выше молекулярной массы и обладающий выраженной противоопухолевой активностью.