Ген липоксигеназы-1 ячменя, способ отбора ячменя, материалы для солодовых алкогольных напитков и способ получения солодовых алкогольных напитков

Ген липоксигеназы-1 ячменя, способ отбора ячменя, материалы для солодовых алкогольных напитков и способ получения солодовых алкогольных напитков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к гену липоксигеназы-1 ячменя, способу отбора ячменя, материалам для солодовых алкогольных напитков и способу получения солодовых алкогольных напитков.

Уровень техники

Липоксигеназа-1 ячменя (далее "LOX-1") является ферментом, присутствующим в солоде, который окисляет образуемую солодом линолевую кислоту до 9-гидропероксиоктадекадиеновой кислоты во время затирания солода для получения солодовых алкогольных напитков (Kobayashi, N et al., J. Ferment. Bioeng., 76, 371-375, 1993). Далее, 9-гидропероксиоктадекадиеновая кислота превращается в тригидроксиоктадеценовую кислоту (THOD) пероксигеназа-подобной активностью (Kuroda, H., et al., J. Biosci. Bioeng., 93, 73-77, 2002). Известно, что THOD уменьшает пеностойкость пива, придает терпкий вкус и ухудшает однородность вкуса пива (Kobayashi, N., J. Am. Soc. Brew. Chem. 60: 37-41, 2002; и Kaneda, H. et al., J. Biosci. Bioeng., 92, 221-226, 2001), приводя к более низкому качеству солодовых алкогольных напитков. Кроме того, 9-гидропероксиоктадекадиеновая кислота превращается в транс-2-ноненаль, который является веществом, ответственным за неприятный привкус картона в выдержанных солодовых алкогольных напитках (Yasui, Journal of the Brewing Society of Japan, 96:94-99 (2001)).

В качестве стратегии ингибирования образования транс-2-ноненаля для улучшения стабильности вкуса солодовых алкогольных напитков был предложен способ получения солодовых алкогольных напитков с использованием солода с низкой активностью LOX-1 (Drost, J. Am. Soc. Brew. Chem. 48:124-131 (1990)).

Douma et al. индуцировали мутацию в ячмене мутагенной (химической) обработкой для создания индуцированной мутированной линии, обнаруживающей на 9% более низкую активность LOX-1 в сравнении с контролями, и пытались получать солодовые алкогольные напитки с использованием такого ячменя (WO 02/053721).

Однако даже при использовании такого ячменя уменьшенная концентрация транс-2-ноненаля у полученных солодовых алкогольных напитков является недостаточной, и стабильность вкуса не является достаточно улучшенной. Кроме того, абсолютно неопределенные результаты получали в отношении уменьшения THOD или улучшения пеностойкости.

Описание изобретения

Данное изобретение было выполнено в свете вышеуказанных проблем уровня техники, и его целью является обеспечение гена LOX-1 ячменя, который применим для получения солодовых алкогольных напитков, обнаруживающих улучшенную стабильность вкуса и стойкость пены, без манипуляций генами, способа отбора LOX-1-недостаточного ячменя, материалов для солодовых алкогольных напитков, получаемых из ячменя, полученного посредством этого способа отбора, и способа получения солодовых алкогольных напитков с использованием этих материалов для солодовых алкогольных напитков.

В результате очень тщательного исследования, проводимого для достижения вышеописанной цели, авторы данного изобретения завершили это изобретение обнаружением природной разновидности ячменя, которая полностью лишена активности LOX-1, и идентификацией нового мутантного гена LOX-1 из этой разновидности ячменя.

Конкретно, мутантный ген LOX-1 данного изобретения характеризуется тем, что гуанин в донорном сайте сплайсинга (5'-GT-3') 5-го интрона известного гена LOX-1 ячменя мутирован в другое основание. Предпочтительно этим другим основанием является аденин.

Способ отбора ячменя, лишенного LOX-1 ячменя, в соответствии с данным изобретением характеризуется распознаванием ячменя, лишенного LOX-1 ячменя, посредством определения, является или не является гуанин в донорном сайте сплайсинга 5-го интрона гена LOX-1 мутированным в другое основание. Предпочтительно этим другим основанием является аденин.

Способ отбора ячменя, лишенного LOX-1 ячменя, характеризуется также включением стадии экстракции геномной ДНК, в которой геномную ДНК экстрагируют из пробы ячменя; стадии амплификации ДНК-фрагмента, в которой ДНК-фрагмент, содержащий донорный сайт сплайсинга 5-го интрона гена LOX-1, амплифицируют из экстрагированной геномной ДНК; и стадии детектирования ДНК-фрагмента, в которой ДНК-фрагмент, содержащий донорный сайт сплайсинга 5-го интрона гена LOX-1, амплифицированный в стадии амплификации ДНК-фрагмента, расщепляют рестрикционным ферментом (рестриктазой), детектируют ДНК-фрагмент, имеющий предписанное количество оснований, и ячмень, лишенный LOX-1 ячменя, распознают посредством определения, является или не является гуанин в донорном сайте сплайсинга мутированным в другое основание.

Рестрикционным ферментом, используемым в стадии детектирования этого ДНК-фрагмента, является предпочтительно AfaI и/или RsaI, которые узнают нуклеотидную последовательность 5'-GTAC-3'.

Согласно данному изобретению сорт ячменя, имеющий признак недостаточности активности LOX-1, распознают на основании присутствия или отсутствия мутации гуанина в донорном сайте сплайсинга 5-го интрона гена LOX-1.

В результате, можно легко распознать разновидность ячменя, лишенную активности LOX-1, посредством анализа на генетическом уровне, без прямого измерения активности LOX-1. На активность фермента влияют индивидуальные стадии роста, среда и другие факторы, и, следовательно, ее трудно точно измерить, но данный способ позволяет распознать разновидность ячменя с отличающейся активностью LOX-1 способом, отличающимся от измерения активности фермента, и, следовательно, независимо от факторов окружающей среды и других факторов. Кроме того, в то время как активность фермента не может быть измерена, пока семена не созреют, скрининг ДНК может идентифицировать присутствие или отсутствие признака отсутствия этой активности на ранней стадии роста, так как его проводят перед цветением, и, следовательно, является эффективным для непрерывного обратного скрещивания.

Материал для солодовых алкогольных напитков данного изобретения характеризуется тем, что он является семенами, солодом, экстрактом солода, продуктом расщепления ячменя или обработанным ячменем, полученными из ячменя, имеющего мутантный ген LOX-1 в соответствии с данным изобретением.

Материал для солодовых алкогольных напитков данного изобретения характеризуется также тем, что он является семенами, солодом, экстрактом солода, продуктом расщепления ячменя или обработанным ячменем, полученными из ячменя, отобранного с использованием способа отбора лишенного LOX-1 ячменя в соответствии с данным изобретением.

Способ получения солодовых алкогольных напитков данного изобретения характеризуется использованием материала для солодовых алкогольных напитков в соответствии с данным изобретением.

Согласно данному изобретению можно получать солодовые алкогольные напитки с улучшенной стабильностью вкуса и стойкостью пены, так как LOX-1 не присутствует в этом материале, и, следовательно, не происходит легкого образования 9-гидропероксиоктадекадиеновой кислоты из линолевой кислоты, и, следовательно, не происходит также легкого образования THOD и транс-2-ноненаля в этом способе получения солодовых алкогольных напитков.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность от положения 1 до положения 1554, представленную в SEQ ID NO:10. Эта нуклеотидная последовательность представляет кодирующую область гена, кодирующего мутантный белок LOX-1, лишенный липоксигеназной активности белка LOX-1. Посредством детектирования присутствия или отсутствия этой нуклеиновой кислоты в пробе ячменя можно узнать, имеет или не имеет этот ячмень признак недостаточности активности LOX-1.

Далее, данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11. Эта нуклеотидная последовательность представляет геномную последовательность гена, кодирующего мутантный белок LOX-1, лишенный липоксигеназной активности белка LOX-1. Посредством детектирования присутствия или отсутствия этой нуклеиновой кислоты в пробе ячменя можно узнать, имеет или не имеет этот ячмень признак недостаточности активности LOX-1.

Далее, данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность из 10-60 смежных оснований, в том числе основание 3178, в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11. Основание 3178 является полиморфизмом единственного нуклеотида, которое является G в случае аутентичного LOX-1 и А в случае мутантного LOX-1. Посредством детектирования присутствия или отсутствия нуклеиновой кислоты, включающей в себя этот полиморфный сайт, в пробе ячменя можно узнать, имеет или не имеет этот ячмень признак недостаточности активности LOX-1.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ детектирования присутствия активности LOX-1 в ячмене, включающий стадию выделения геномной ДНК из пробы ячменя и стадию детектирования основания 3178 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, причем присутствие этого основания является показателем присутствия активности LOX-1 в ячмене. Согласно этому способу можно узнать, имеет или не имеет испытуемый ячмень признак недостаточности активности LOX-1.

Семена, солод, экстракт солода, продукт расщепления ячменя или обработанный ячмень, полученные из ячменя, лишенного активности LOX-1, обнаруженного посредством этого способа, могут быть использованы в качестве сырьевого материала для получения солодовых алкогольных напитков с целью получения солодовых алкогольных напитков с улучшенной стабильностью вкуса и стойкостью пены.

Краткое описание фигур

Фиг.1 является диаграммой, показывающей результаты активности LOX-1 в тесте поиска 1.

Фиг.2 является диаграммой, показывающей результаты ингибирующей LOX-1 активности в тесте верификации 1.

Фиг.3 является парой изображений электрофореза, показывающих результаты Вестерн-анализа белка LOX-1 семян ячменя в тесте верификации 2. Изображение А показывает результаты Вестерн-анализа после электрофореза в ПААГ, а В показывает результаты Вестерн-анализа после изоэлектрофокусирования (IEF).

Фиг.4 является изображением электрофореза, показывающим результаты анализа ОТ-ПЦР РНК семян ячменя в тесте верификации 3.

Фиг.5 является диаграммой, показывающей структуру донорного сайта сплайсинга 5-го интрона гена LOX-1 в тесте верификации 4.

Фиг.6 является парой изображений электрофореза, показывающих результаты анализа сплайсинга мутантного гена LOX-1 в тесте верификации 5. Изображение А является изображением электрофореза амплифицированных фрагментов, содержащих 3-й - 5-й интрон, а В является изображением электрофореза тех же самых фрагментов, что и в А, после расщепеления StuI.

Фиг.7 является изображением электрофореза, показывающим индуцированные экспрессией белки в E. coli в тесте верификации 7 и 8.

Фиг.8 является диаграммой, показывающей активность индуцированной экспрессией LOX-1 в E. coli в тесте верификации 1.

Фиг.9 является изображением электрофореза, показывающим полиморфизм ДНК во 2-ом дочернем поколении гибрида для Kendall × SBOU2 в тесте верификации 9.

Фиг.10 является таблицей, суммирующей полиморфизм ДНК в гибридном 2-м дочернем поколении и активность LOX-1 в 3-м дочернем поколении гибрида для Kendall x SBOU2 в тесте верификации 9.

Фиг.11 является изображением электрофореза, показывающим результаты анализа основного сорта/линии ячменя с использованием AfaI-способа в примере 1.

Фиг.12 является изображением электрофореза, показывающим результаты анализа LOX-1-недостаточного ячменя с использованием AfaI-способа в примере 2.

Фиг.13 является парой диаграмм, показывающих результаты активности LOX-1 LOX-1-недостаточных семян ячменя в примере 2. Диаграмма А показывает результаты при времени реакции фермента 5 минут, а диаграмма В показывает результаты при времени реакции 90 минут.

Фиг.14 является таблицей, показывающей результаты анализа солода семян из популяции LOX+F4 и LOX-F4 в примере 5.

Фиг.15 является точечной диаграммой, показывающей концентрации транс-2-ноненаля и потенциалы ноненаля для сусла в примере 5.

Наилучший способ проведения данного изобретения

Данное изобретение будет теперь объяснено более подробно.

Сначала будут даны объяснения по поводу мутантного гена LOX-1.

Мутантный ген LOX-1 данного изобретения является новым геном, обнаруженным авторами данного изобретения, и он характеризуется тем, что 60-е основание G известного гена LOX-1 ячменя (SEQ ID NO:1) заменено на А (SEQ ID NO:2). Поскольку основания 60-61 SEQ ID NO:1 составляют донорный сайт сплайсинга (5'-GT-3'), эта замена основания дает аберрацию в сплайсинге LOX-1, так что активный LOX-1 не может быть экспрессирован.

Нуклеотидная последовательность области 5-го интрона известного гена LOX-1 приведена в виде SEQ ID NO:1 в списке последовательностей, а нуклеотидная последовательность части мутантного гена LOX-1 данного изобретения, соответствующая области 5-го интрона гена LOX-1, приведена в списке последовательностей в виде SEQ ID NO:2.

Теперь будет объяснен способ отбора LOX-1-недостаточного ячменя в соответствии с данным изобретением.

Способ отбора LOX-1-недостаточного ячменя в соответствии с данным изобретением характеризуется распознаванием ячменя, лишенного LOX-1 ячменя, на основании того, является или не является гуанин в донорном сайте сплайсинга 5-го интрона гена LOX-1 мутированным в другое основание.

Способом отбора LOX-1-недостаточного ячменя, использующим вышеупомянутую мутацию основания, может быть, например, способ с использованием праймера, содержащего вышеупомянутый сайт мутации на 3'-конце последовательности праймера или внутри последовательности праймера, для амплификации ДНК, детектирования мутации основания на основании присутствия амплификации или эффективности амплификации и отбора LOX-1-недостаточного ячменя, или способ амплификации ДНК-фрагмента, содержащего вышеупомянутый сайт мутации, и отбора LOX-1-недостаточного ячменя.

Нет конкретных ограничений в отношении способа детектирования мутации нуклеотидной последовательности, пока данный способ позволяет детектировать ДНК-фрагменты, но подходящие способы, которые должны быть использованы, включают в себя электрофорез в агарозном геле и электрофорез в полиакриламидном геле. Когда подлежащая детектированию мутация ДНК основана на присутствии амплификации или эффективности амплификации, вместо электрофореза может быть использована количественная ПЦР, например способ TAQMAN.

Способ отбора LOX-1-недостаточного ячменя данного изобретения характеризуется включением предпочтительно стадии экстракции геномной ДНК, в которой геномную ДНК экстрагируют из пробы ячменя; стадии амплификации ДНК-фрагмента, в которой ДНК-фрагмент, содержащий донорный сайт сплайсинга 5-го интрона гена LOX-1, амплифицируют из экстрагированной геномной ДНК; и стадии детектирования ДНК-фрагмента, в которой ДНК-фрагмент, содержащий донорный сайт сплайсинга 5-го интрона гена LOX-1, амплифицированный в стадии амплификации ДНК-фрагмента, расщепляют рестрикционным ферментом (рестриктазой), детектируют ДНК-фрагмент, имеющий предписанное количество оснований, и лишенный LOX-1 ячменя ячмень распознают посредством определения, является или не является гуанин в донорном сайте сплайсинга мутированным в другое основание.

Сначала будет объяснена стадия экстракции геномной ДНК.

Нет особых ограничений в отношении способа экстракции геномной ДНК, и может быть использован любой широко известный способ. Конкретно, экстракцию можно проводить, например, способом CTAB (Murray et al., 1980, Nucleic Acids Res. 8:4321-4325) или способом с бромидом этидия (Varadarajan and Prakash 1991, Plant Mol. Biol. Rep. 9:6-12). Ткань, используемая для экстракции геномной ДНК не ограничивается семенами ячменя, но может быть также листьями, стеблями, корнями или т.п. Например, листья могут быть использованы для отбора из партии индивидуумов в генерациях обратного скрещивания.

Теперь будет объяснена стадия амплификации ДНК-фрагмента.

Нет особых ограничений в отношении способа амплификации ДНК-фрагмента, и, например, может быть использован способ ПЦР (полимеразной цепной реакции). Праймеры, используемые для способа ПЦР, не ограничены конкретно в их нуклеотидных последовательностях, пока они представляются областью, позволяющей амплифицировать ДНК-фрагмент, содержащий донорный сайт сплайсинга 5-го интрона гена LOX-1, и, конкретно, они являются предпочтительно 10-60 смежными основаниями и более предпочтительно 15-30 смежными основаниями гена LOX-1. Обычно нуклеотидная последовательность праймера будет предпочтительно иметь GC-содержание 40-60%. Предпочтительно также, чтобы различие в величинах Tm двух праймеров, используемых для способа ПЦР, было равно нулю или было очень малым. Эти праймеры предпочтительно не образуют вторичную структуру друг с другом.

Теперь будет объяснена стадия детектирования ДНК-фрагмента.

Мутантный ген LOX-1 в соответствии с данным изобретением имеет нуклеотидную последовательность, отличающуюся от известного LOX-1, как объяснено выше, и, следовательно, при использовании рестриктазы, которая узнает или расщепляет эту отличающуюся часть, для расщепления продукта амплификации, различие в размерах полученных ДНК-фрагментов будет очевидным. Нет особых ограничений в отношении рестриктазы, используемой для данного изобретения, пока она узнает или расщепляет отличающуюся часть, но предпочтительными являются рестриктазы AfaI и/или RsaI, которые, как уже было продемонстрировано, проявляют такую активность.

Другими словами, поскольку мутантный ген LOX-1 данного изобретения имеет гуанин в донорном сайте сплайсинга, мутированный в другое основание, он не содержит сайта расщепления для рестриктаз AfaI и RsaI (5'-GTAC-3': нуклеотидов 60-63 5-го интрона), который присутствует в известном гене LOX-1. В результате, его паттерн расщепления, при расщеплении продукта амплификации гена, содержащего этот сайт расщепления, рестриктазами AfaI и/или RsaI, будет отличаться от паттерна расщепления известного гена LOX-1, что позволяет идентифицировать мутантный ген LOX-1.

ДНК-фрагмент, имеющий предписанное количество оснований, не ограничивается в количестве оснований, пока он является ДНК-фрагментом, в котором присутствие отличающейся части приводит к различию в размере ДНК-фрагмента, получаемого расщеплением продукта амплификации рестриктазой.

Детектирование на этой стадии особо не ограничивается, пока оно является способом, делающим возможным детектирование ДНК-фрагмента, расщепляемого рестриктазой, и, конкретно, детектирование может выполняться, например, электрофорезом в агарозном геле или электрофорезом в полиакриламидном геле.

Теперь будет объяснен материал для солодовых алкогольных напитков данного изобретения.

Материал для солодовых алкогольных напитков данного изобретения характеризуется тем, что он является семенами, солодом, экстрактом солода, продуктом расщепления ячменя или обработанным ячменем, полученными из ячменя, имеющего мутантный ген LOX-1 в соответствии с данным изобретением, и тем, что он является семенами, солодом, экстрактом солода, продуктом расщепления ячменя или обработанным ячменем, полученными из ячменя, отобранного способом отбора LOX-1-недостаточного ячменя в соответствии с данным изобретением.

Солодовый экстракт является экстрактом из солода, и в качестве примеров может быть упомянут экстракт сахарных компонентов или белковых компонентов из солода. Продукт расщепления ячменя является продуктом расщепления ячменя ферментами или т.п., и он включает в себя ячменный затор и т.п. Обработанным ячменем называют дробленый ячмень, используемый в качестве добавки для солодовых алкогольных напитков.

Поскольку материал для солодовых алкогольных напитков по данному изобретению не содержит LOX-1, не происходит легкого образования 9-гидропероксиоктадекадиеновой кислоты из линолевой кислоты и, следовательно, не происходит легкого образования THOD и транс-2-ноненаля во время этого способа получения солодовых алкогольных напитков; таким образом, можно получать солодовые алкогольные напитки с улучшенной стабильностью вкуса и пеностойкостью.

Теперь будет объяснено получение солодовых алкогольных напитков.

Способ получения солодовых алкогольных напитков данного изобретения характеризуется использованием материала для солодовых алкогольных напитков в соответствии с данным изобретением.

Сначала будет объяснена стадия получения солода, характеризующаяся использованием LOX-1-недостаточного ячменя, и этот способ не является особо ограниченным и может быть любым широко известным способом. Более конкретно, например, замачивание до степени замачивания 40-45% сопровождается проращиванием при 10-20°С в течение 3-6 дней и печной сушкой для получения солода.

Теперь будет объяснена стадия затирания.

Стадия затирания в соответствии с данным изобретением является стадией получения сусла затиранием вышеупомянутого солода. Более конкретно, она состоит из четырех стадий.

Первой стадией является стадия затирания, в которой содержащий солод материал смешивают с водой, полученную смесь нагревают для затирания солода и получают сусло из осахаренного солода.

Солод, используемый для этой стадии, предпочтительно получают добавлением воды и воздуха к ячменю для проращивания с последующей сушкой для удаления зародышей. Этот солод является источником необходимых ферментов для получения сусла, а также основным источником крахмала в качестве материала для затирания. Высушенный печной сушкой пророщенный солод используют также для придания характерного вкуса и цвета солодовому алкогольному напитку. Кроме такого солода, могут быть добавлены добавки, такие как LOX-1-недостаточный ячмень по данному изобретению и/или обычный ячмень, кукурузный крахмал, кукурузная крупа, рис, сахариды или т.п.

В стадии получения сусла, описанной выше, продукт расщепления ячменя или обработанный ячмень, полученный из LOX-1-недостаточного ячменя данного изобретения и/или обычного ячменя, смешивают с заторной водой и добавляют, если необходимо, вышеупомянутые добавки для получения сусла.

Солод перемешивают после добавления заторной воды. При добавлении также добавок они могут быть также смешаны в этот момент. Сахариды могут добавляться перед кипячением, описанным ниже. Нет особых ограничений в отношении заторной воды, и может быть использована вода, которая пригодна для получаемых солодовых алкогольных напитков. Затирание проводят по существу при общепринятых условиях. После фильтрования солодового затора, полученного таким образом, добавляют материалы, которые придают аромат или горечь, такие как хмель или травы, и смесь кипятят и затем охлаждают с получением охлажденного сусла.

Второй стадией является стадия добавления дрожжей к охлажденному суслу для ферментации с целью получения промежуточных продуктов солодового алкогольного напитка.

Дрожжи, используемые в этой стадии, могут быть любыми пивными дрожжами для спиртового брожения, которые метаболизируют сахара в сусле, полученном затиранием солода, с образованием спирта и газообразного диоксида углерода, и, конкретно, могут быть упомянуты, например, Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces uvarum.

Сбраживание выполняют охлаждением сусла, полученного в стадии затирания, и добавлением к нему дрожжей. Условия сбраживания могут быть по существу такими же, что и условия для общепринятой ферментации, и, например, температура сбраживания будет обычно не выше 15^оС и предпочтительно 8-10^оС, тогда как период сбраживания составляет предпочтительно 8-10 дней.

Третьей стадией является стадия выдерживания, в которой промежуточные продукты солодового алкогольного напитка, полученного в стадии сбраживания, выдерживают.

В этой стадии сбраживаемый раствор, который завершил спиртовое брожение, переносят в герметизированный чан и выдерживают. Это вторичное сбраживание по существу является таким же, что и сбраживание при обычных условиях, и, например, температура выдерживания равна предпочтительно 0-2°С и время выдерживания равно приблизительно 20-90 дням. Выдерживание сброженного раствора делает возможными прохождение повторного брожения и созревания оставшегося экстракта.

Четвертой стадией является стадия фильтрования, в которой промежуточные продукты солодового алкогольного напитка, полученного на стадии выдерживания, фильтруют с получением солодового алкогольного напитка.

Условия фильтрования являются по существу такими же, что и общепринятые условия, и, например, используемым фильтрующим материалом могут быть диатомовая земля, поливинилпирролидон (PVPP), силикагель, порошок целлюлозы или т.п., и температура может быть 0±1°С.

Эта процедура дает солодовый алкогольный напиток. Затем отфильтрованный солодовый алкогольный напиток помещают в чан, разливают в бочки, разливают в бутылки или в консервные банки для транспортировки на рынок, либо сразу же, либо после стерильного фильтрования или тепловой обработки.

Доля солода, используемого для получения ячменного алкогольного напитка, особо не ограничивается, и алкогольный напиток может быть любым напитком, получаемым с использованием солода в качестве исходного материала. Конкретно могут быть упомянуты, например, пиво и искристый солодовый напиток. Безалкогольное пиво и безалкогольный искристый солодовый напиток также считаются солодовыми алкогольными напитками, так как используемый способ получения является сходным со способом получения таких солодовых алкогольных напитков, как пиво.

Поскольку материал по данному изобретению не содержит LOX-1, не происходит легкого образования 9-гидропероксиоктадекадиеновой кислоты из линолевой кислоты и, следовательно, ингибируется образование THOD и транс-2-ноненаля во время способа получения солодовых алкогольных напитков, и, следовательно, можно получать солодовые алкогольные напитки с улучшенной стабильностью вкуса и стойкостью пены.

Теперь будут объяснены нуклеиновая кислота и способ детектирования присутствия активности LOX-1 в ячмене в соответствии с данным изобретением.

Нуклеиновая кислота данного изобретения характеризуется тем, что она содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11. SEQ ID NO:11 представляет геномную последовательность для мутантного LOX-1 в сорте SDOU2 ячменя, лишенного активности LOX-1. То есть мутантный ген LOX-1 данного изобретения характеризуется тем, что он представлен последовательностью SEQ ID NO:11. Основание, соответствующее положению 3178, является G в аутентичном гене LOX-1, тогда как основание 3178 является мутированным в А в мутантном гене LOX-1. Это основание является также первым основанием 5-го интрона аутентичного гена LOX-1, и последовательность GT в виде последовательности оснований 3178-3179 соответствует донорному сайту сплайсинга (фиг.5). Однако в мутантном гене LOX-1 последовательность оснований 3178-3179, соответствующая донорному сайту сплайсинга, является АТ, и, следовательно, происходит аберрация сплайсинга, которая предотвращает сплайсинг. Кроме того, последовательность оснований 3176-3178 является TGA, которая является стоп-кодоном, и, следовательно, в этой точке трансляция заканчивается.

Поскольку мутантный белок LOX-1, экспрессируемый мутантным геном LOX-1 имеет только часть, соответствующую 5-му экзону, он лишен аминокислотных остатков на С-концевой стороне от 5-го экзона аутентичного белка LOX-1. Молекулярная масса аутентичного белка LOX-1 равна 95 кД, тогда как молекулярная масса мутантного белка LOX-1 равна 57 кД. Мутантный белок LOX-1 лишен липоксигеназной активности, и это коррелирует с известным фактом, что домен, соответствующий области экзона около 5-го интрона в аутентичном белке LOX-1, является активным центром LOX растений (Shibata and Axelrod (1995) J. Lipid Mediators and Cell Signaling 12:213-218).

Таким образом, если ячмень, имеющий мутантный ген LOX-1, используется в качестве сырьевого материала для получения солодовых алкогольных напитков, белок LOX-1 не будет присутствовать в этом сырьевом материале, и, следовательно, образование 9-гидропероксиоктадекадиеновой кислоты из линолевой кислоты во время этого способа получения солодовых алкогольных напитков будет уменьшено, так что в результате может быть достигнуто ингибирование образования THOD и транс-2-ноненаля с целью получения солодовых алкогольных напитков с улучшенными стабильностью вкуса и стойкостью пены. Таким образом, нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, в соответствии с данным изобретением, является в высокой степени полезной для получения солодовых алкогольных напитков с улучшенными стабильностью вкуса и стойкостью пены.

Нуклеиновая кислота данного изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность из 10-60 смежных оснований, в том числе основание 3178, в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11. Эта нуклеиновая кислота может быть использована в качестве зонда для различения между аутентичной и мутантной формами гена LOX-1 ячменя. То есть, поскольку основание 3178 аутентичного гена LOX-1 является G, полученное ошибочное спаривание может быть использовано для различения аутентичной и мутантной форм на основании различия в гибридизации. Например, посредством образования гибридов между этими нуклеиновыми кислотами и нуклеиновой кислотой гена LOX-1, постепенного увеличения температуры и измерения температуры плавления гибридов можно легко различать между аутентичным геном LOX-1 и мутантным геном LOX-1, так как их температуры плавления будут различаться. Эта нуклеиновая кислота может быть также использована для различения между формами гена LOX-1 (аутентичной/мутантной формами) с использованием способов, известных специалистам с квалификацией в данной области. С точки зрения специфичности, эта нуклеиновая кислота предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность из 20-50 смежных оснований, в том числе основание 3178, и предпочтительно она включает в себя основания 3178-3181. Эта нуклеиновая кислота может быть также мечена флуоресцентным веществом, радиоактивным изотопом или т.п.

Способ детектирования присутствия активности LOX-1 в ячмене в соответствии с данным изобретением предусматривает стадию выделения геномной ДНК из пробы ячменя и стадию детектирования основания 3178 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, причем присутствие этого основания является показателем присутствия активности LOX-1 в ячмене. Согласно этому способу можно узнать, имеет или не имеет тестируемый ячмень признак недостаточности активности LOX-1.

Проба ячменя не ограничивается семенами ячменя, и она может быть листьями, стеблями корнями ячменя или т.п. Нуклеиновая кислота может быть выделена широко известными способами и, например, может быть использован способ CTAB или способ с использованием бромида этидия.

Детектирование основания 3178 нуклеиновой последовательности, представленной SEQ ID NO:11, может выполняться посредством способа, известного специалистам с квалификацией в данной области. Например, если необходимо, нуклеиновая кислота, содержащая основание 3178 нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:11, может быть амплифицирована по способу амплификации нуклеиновых кислот, такому как ПЦР. Идентичность основания в положении 3178 выделенной нуклеиновой кислоты или амплифицированного фрагмента нуклеиновой кислоты можно различить, например, с помощью нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO:11, причем эта нуклеиновая кислота содержит последовательность из 10-60 смежных оснований, в том числе основание 3178, как описано выше.

Однако способ детектирования основания 3178 с использованием различия в основаниях 3178-3181 гена LOX-1 является более удобным и эффективным. Сайт оснований 3178-3181 является сайтом расщепления рестриктаз AfaI/RsaI в аутентичном гене LOX-1, но вследствие того, что основание 3178 является А в мутантном гене LOX-1, оно не образует сайта расщепления для рестриктаз AfaI/RsaI (фиг.5). Другими словами, при обработке выделенной нуклеиновой кислоты или амплифицированного фрагмента нуклеиновой кислоты рестриктазами AfaI/RsaI нуклеиновая кислота аутентичного LOX-1 будет расщепляться, тогда как нуклеиновая кислота мутантного LOX-1 не будет расщепляться. Электрофоретический анализ обработанной рестриктазами пробы нуклеиновой кислоты будет делать возможным различение формы гена LOX-1 (аутентичной или мутантной) на основании различия в картинах электрофореза, так что может быть различена идентичность основания в положении 3178. Кроме того, посредством использования нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность из 10-60 смежных оснований, в том числе оснований 3178-3181, в качестве зонда для гибридизации с обработанной рестриктазами нуклеиновой кислотой можно различить форму гена LOX-1 и, следовательно, сделать возможным узнавание идентичности основания 3178.

Если в результате распознавания основания 3178 таким образом обнаруживается, что это основание является G, то можно сделать вывод, что тестируемый ячмень имеет активность LOX-1 и не пригоден в качестве сырьевого материала для солодовых алкогольных напитков с улучшенными стабильностью вкуса и стойкостью пены. С другой стороны, если этим основанием является А, то можно сделать вывод, что тестируемый ячмень не имеет активности LOX-1 и, следовательно, пригоден в качестве сырьевого материала для солодовых алкогольных напитков с улучшенными стабильностью вкуса и стойкостью пены.

Нуклеиновая кислота данного изобретения характеризуется также тем, что она содержит нуклеотидную последовательность от положения 1 до положения 1554, представленную в SEQ ID NO:10. SEQ ID NO:10 представляет кДНК-последовательность мутантного LOX-1, экспрессируемого сортом ячменя SBOU2, лишенного активности LOX-1. Нуклеотидная последовательность от положения 1 до положения 1554 представляет кодирующую область. Как объяснено выше, мутантный белок LOX-1, кодируемый этой кДНК, не имеет аминокислотных остатков на С-концевой стороне от 5-го экзона аутентичного белка LOX-1, его молекулярная масса равна 57 кДа и он лишен липоксигеназной активности.

Таким образом, ячмень, экспрессирующий эту нуклеиновую кислоту, может быть использован в качестве сырьевого материала для получения солодовых алкогольных напитков с целью получения солодовых алкогольных напитков с улучшенными стабильностью вкуса и стойкостью пены, как упоминалось выше.

[Примеры]

Теперь данное изобретение будет объяснено более подробно посредством следующих примеров с пониманием того, что эти примеры никоим образом не являются ограничивающими в отношении данного изобретения.

Тест поиска 1 (поиск на LOX-1-недостаточный ячмень посредством измерения активности фермента LOX-1)

Активность фермента LOX-1 измеряли по способу, описанному ниже, а поиск на LOX-1-недостаточный ячмень проводили из ресурсов генов ячменя.

Сначала раствор неочищенного фермента экстрагировали из семян ячменя по следующему способу. Одно зрелое семя ячменя измельчали молотком и использовали 500 мкл буфера для экстракции (0,1 М натрий-ацетатный буфер (рН 5,5)) для экстракции со встряхиванием при 4°С в течение 30 минут. Полученный экстракт центрифугировали в течение 10 минут при 15000 об/мин и затем супернатант использовали в качестве раствора неочищенного фермента.

Затем 5 мкл раствора субстрата (40 мМ линолевая кислота, 1,0% (масса/объем) водный раствор Твина 20) и 85 мкл буфера для экстракции добавляли к 10 мкл раствора неочищенного фермента и смешивали вместе и затем реакцию проводили при 24°С в течение 5 минут. Реакцию останавливали добавлением и смешиванием 100 мкл стоп-раствора (80 мМ 2,6-ди-трет-бутил-п-крезол, раствор в метаноле). После стояния реакционной смеси при -20°С в течение 30 минут ее центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут и супернатант использовали в следующей реакции с развитием окраски. Часть 200 мкл образующего цвет раствора (4 мМ 2,6-ди-трет-бутил-п-крезол, 25 мМ серная кислота, 0,25 мМ гексагидрат сульфата аммония/железа(II), 100 мМ ксиленоловый оранжевый, 90% водный метанол) добавляли к 20 мкл полученного супернатанта и после стояния в течение 30 минут измеряли оптическую плотность при 550 нм. В качестве отрицательного контроля реакцию проводили таким же образом с использованием раствора неочищенного фермента, обработанного нагреванием при 100°С в течение 5 минут для инактивации LOX-1, тогда как в качестве положит