Способ прогнозирования эффективности терапии лимфом

Способ прогнозирования эффективности терапии лимфом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, конкретнее к онкологии и гематологии, а также к биохимии.

Лимфомы представляют собой злокачественные новообразования, субстратом которых являются подвергшиеся опухолевой трансформации лимфоидные клетки различных фаз дифференцировки. К лимфомам относятся лимфома Ходжкина или лимфогранулематоз (ЛГМ), характерным для которого является наличие в опухолевом субстрате классических клеток Березовского-Штернберга-Рида, и неходжкинские лимфомы (НХЛ), в ткани которых данные клетки отсутствуют (Волкова М.А. Клиническая онкогематология. - М.: Медицина, 2001). Долгосрочный прогноз у больных лимфомой во многом зависит от эффективности лечения в период индукции ремиссии, т.е. ответа на первый блок полихимиотерапии. В связи с этим разработка способов прогнозирования эффективности лечения гемобластозов до его начала представляет большой практический интерес. Прогнозирование низкой эффективности терапии не означает бессмысленности лечения, а наоборот, предполагает его усовершенствование и интенсификацию, что позволяет во многих случаях спасти больного.

Известны следующие способы прогнозирования эффективности терапии лимфом:

1. Прогностический алгоритм, разработанный экспертами ВОЗ и группами по изучению гемобластозов для агрессивных и индолентных лимфом, ЛГМ. Этот способ получил наибольшее распространение в клинике и относительно прост в использовании. Для каждой группы заболеваний метод имеет определенные нюансы, но в целом опирается на совокупность клинических и лабораторных параметров.

Прогностический алгоритм для агрессивных лимфом (лимфом высокой степени злокачественности - ВСЗ) носит название «международный прогностический индекс» (МПИ). В его основу положен учет ряда неблагоприятных прогностических признаков: возраст старше 60 лет; повышение уровня лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови; общесоматический статус больного, соответствующий 2-4-й степени по шкале ECOG; III-IV стадия болезни; наличие более одного экстранодального очага поражения.

На основании наличия у пациента одновременно того или иного количества неблагоприятных факторов прогнозируют эффективность его лечения и определяют группу риска раннего прогрессирования болезни (А clinical evaluation of the International Lymphoma Study Group classification of non-Hodgkin's lymphoma. The Non-Hodgkin's Lymphoma Classification Project // Blood, 1997, 89(11), 3909-3918):

- при отсутствии неблагоприятных факторов или присутствии лишь одного из них прогнозируют низкий риск раннего прогрессирования и хороший эффект от терапии;

- при наличии 2-х факторов прогнозируют низкий/промежуточный риск раннего прогрессирования и хороший/промежуточный эффект от терапии;

- при наличии 3-х факторов прогнозируют промежуточный/высокий риск раннего прогрессирования и промежуточный/низкий эффект от терапии;

- при наличии у пациента 4-х факторов и более прогнозируют высокий риск раннего прогрессирования и отсутствие эффекта от терапии.

При определении прогноза эффективности терапии у пациентов с индолентными лимфомами, характеризующимися низкой степенью злокачественности (НСЗ), учитывается несколько иная совокупность факторов: возраст пациента, стадия заболевания, число нодальных областей поражения, сывороточный уровень ЛДГ, уровень гемоглобина (Solay-Celigny P., Roy P., Colombat P. et al. Follicular lymphoma international prognostic index // Blood, 2004, 104(5), 1258-1265).

При определении прогноза эффективности лечения у больных ЛГМ учитывается стадия заболевания в совокупности с наличием или отсутствием ряда факторов риска, к которым относятся экстранодальные поражения, расширение тени средостения более чем на 1/3 диаметра грудной клетки, массивное поражение селезенки, ускорение СОЭ, вовлечение в процесс трех или более зон лимфатических узлов. В результате анализа вышеуказанных факторов пациента относят к группе благоприятного, промежуточного или неблагоприятного прогноза (высокой, умеренной и низкой эффективности терапии) (Cosset J.M., Henry-Amar M., Meerwaldt J.H. et al. The EORTC trials for limited stage Hodgkin's disease. The EORTC Lymphoma Cooperative Group // Eur. J. Cancer, 1992, 11(50), 1847-1850).

Данный метод имеет ряд недостатков. Представляя собой совокупность клинических и лабораторных характеристик болезни, он не учитывает механизмы опухолевой прогрессии и отражает скорее тяжесть течения процесса на данном этапе. Метод не обладает универсальностью и необходимой достоверностью, поскольку имеет низкие чувствительность и специфичность (в нашей группе больных ниже 50%).

2. Определение цитогенетических нарушений в опухолевых клетках.

В основе метода лежит определение хромосомных перестроек в опухолевых клонах больных лимфомой, оценка изменений экспрессии различных генов и содержания кодируемых ими белков. Экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости (MDR1, LRP, MRP) свидетельствует о возможности развития резистентности опухоли к терапии и, следовательно, неблагоприятном прогнозе (Ставровская А.А. Резистентность больных гемобластозами к лекарственной терапии // Клиническая онкогематология. - Под ред. М.А.Волковой. - М.: Медицина, 2001).

Установлено, что у больных НХЛ уровень экспрессии BCL-2 сказывается на частоте 5-летних полных ремиссий - гиперэкспрессия ее уменьшает. Неблагоприятно повышение уровня экспрессии ракового антигена - СА125, рецепторов ИЛ-10, β₂-микроглобулина (Herbst Н., Tippelmann G., Anagnostopoulos I. et al. Immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in Hodgkin's disease and Ki-1-positive anaplastic large cell lymphoma: association between phenotype and genotype // Leuk Res, 1989, 13(2): 103-16).

Диагностически и прогностически важной является транслокация t(2;5)(p23;q35), характерная для анапластических крупноклеточных лимфом, и t(11;14), характерная для мантийно-клеточных лимфом (Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом. Морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология, 2004, т.5, №3, с.169-175).

Спектр хромосомных изменений при ЛГМ сходен с таковым при НХЛ, например del(6q), 14q+. Некоторые аномалии при ЛГМ встречаются чаще, чем при НХЛ (аберрации 3q, 7q, 12p, 13p). Однако прогностическое значение хромосомных нарушений при ЛГМ не установлено (Thomas R.K., Re D., Wolf J. et al. Molecular biology of Hodgkin's cells // The Lancet oncology, 2004, 5, 126-145).

Прогностическое значение цитогенетических характеристик злокачественных клеток, за редкими исключениями, изучено недостаточно. Для ЛГМ в настоящее время неизвестны цитогенетические факторы прогноза. Кроме того, значимость цитогенетических маркеров при оценке прогноза эффективности терапии онкогематологического заболевания со временем утрачивается. Высокодозная полихимиотерапия нивелирует цитогенетические изменения злокачественных клеток. Иными словами, если у пациента, у которого кариотип лейкемических клеток отнесен к неблагоприятному, достигнута ремиссия, и она сохраняется более года, то данный признак теряет прогностическое значение.

3. Определение иммунологических характеристик опухоли.

В основе этого метода лежит оценка иммунологического фенотипа лимфомной клетки, что позволяет определить вариант опухоли, а следовательно, и прогноз эффективности терапии на основании его принадлежности к той или иной группе в морфологической классификации. Иммунологический способ также позволяет определить пролиферативную активность лимфом по маркеру Ki-67. По количеству клеток, несущих данный мембранный маркер, устанавливается низкая, умеренная или высокая пролиферативная активность опухоли. Чем выше этот показатель, тем более агрессивно и неблагоприятно протекает злокачественный процесс (Тупицын Н.Н. Иммунодиагностика гемобластозов // Клиническая онкогематология. - Под ред. М.А.Волковой. - М.: Медицина, 2001).

Недостатки метода: высокодозная полихимиотерапия оказывает влияние на иммунологические характеристики опухоли, следовательно, после лечения прогностическая значимость метода утрачивается. Кроме того, проточная цитометрия, используемая при определении иммунологических характеристик гемобластозов, не является рутинным методом в клинике, сложна в применении.

4. Способ ультразвукового прогнозирования лечения неходжкинских лимфом (RU 2001110550/14).

Сущность способа заключается в том, что на разных этапах противоопухолевого лечения НХЛ проводят ультразвуковой мониторинг эффективности лечения. У больных бластными лимфомами с конгломератным типом поражения лимфоузлов брюшной полости, первично плохо поддающихся терапии, при выявлении интенсивного смешанного кровотока с формированием ангиоархитектоники по типу опухолевого неоангиогенеза устанавливают клинические критерии неблагоприятного прогноза, а при выявлении низкоинтенсивного смешанного и периферического кровотока устанавливают благоприятное течение заболевания, высокую индивидуальную чувствительность к химиотерапии, прекращение дальнейшего распространения болезни, высокую безрецидивную выживаемость. У больных индолентными лимфомами с поражением абдоминальных лимфоузлов после 3-го или 4-го курса химиотерапии при выявлении оставшихся уменьшенных в размерах изо- и гиперэхогенных лимфоузлов с аваскулярным или гиповаскулярным периферическим кровотоком, взаимосвязанным со степенью эхогенности, устанавливают благоприятный прогноз течения заболевания - склерозирование ткани лимфоузлов в процессе химиотерапии; а при выявлении оставшихся несколько уменьшенных в размерах гипоэхогенных лимфоузлов с визуализацией в них гиповаскулярного периферического кровотока устанавливают неполное склерозирование и неблагоприятный прогноз.

Недостатки метода: использование метода возможно только при лимфомах, сопровождающихся поражением абдоминальных лимфоузлов; метод скорее отслеживает динамику заболевания на этапах лечения, чем прогнозирует его эффективность; не может использоваться до начала лечения.

Прототипом предлагаемого способа выбран способ оценки эффективности лечения злокачественных лимфом по RU 2002111925/15. Он включает в себя биохимический анализ сыворотки крови больных злокачественными лимфомами и отличается тем, что в сыворотке крови и моче определяют концентрацию суммарных гликозаминогликанов и их фракций и при концентрации суммарных гликозаминогликанов более 50 мкмоль/л в сыворотке крови и более 30 мкмоль/л в суточном количестве мочи, а также доли гепарансульфатов менее 17% в сыворотке крови и менее 30% в моче эффективность лечения оценивают как низкую.

Данный метод имеет ряд недостатков. Методика определения концентрации гликозаминогликанов в сыворотке крови представляет собой сложный многоступенчатый процесс, не является рутинным методом и требует специальных навыков и оборудования и, таким образом, представляет значительную техническую сложность.

Концентрация гликозаминогликанов в крови и моче характеризует обмен веществ в соединительной ткани, увеличение их содержания характерно для воспалительно-деструктивных заболеваний соединительной ткани, патологии суставов и почек и отражает дегенерацию тканевых протеогликанов. Таким образом, данный способ не затрагивает основ патогенеза опухолевого роста и не учитывает механизмов опухолевой прогрессии.

Раскрытие изобретения

Сущность предлагаемого способа прогнозирования эффективности терапии лимфом заключается в следующем. В сыворотке крови пациента до начала лечения определяют активность цистеиновых протеаз лизосом катепсинов В и L. Задают уровень чувствительности или специфичности способа. По графику зависимости чувствительности и специфичности способа от активности катепсинов В и L в точках разделения, например по графикам на фиг.1 и 2, определяют точку разделения по катепсину В и точку разделения по катепсину L, соответствующие заданному уровню чувствительности или специфичности способа. Если активность катепсинов В и L у пациента выше активности соответствующего фермента в точке разделения, то прогнозируют высокую эффективность лечения данного пациента, а если активность катепсинов В и L равна или ниже активности соответствующего фермента в точке разделения, то прогнозируют низкую эффективность терапии данного пациента. Если активность одного фермента у пациента выше его активности в точке разделения, а активность другого равна или ниже его активности в точке разделения, то определяют выраженность отклонения активности каждого фермента от его активности в точке разделения путем определения величины относительного отклонения. Для этого абсолютную величину разницы между активностью фермента в точке разделения и активностью того же фермента у данного пациента делят на величину активности того же фермента в точке разделения. Если относительное отклонение больше у фермента, активность которого выше точки разделения, то прогнозируют высокую эффективность лечения данного пациента, а если относительное отклонение больше у фермента, активность которого ниже точки разделения, то прогнозируют низкую эффективность лечения данного пациента.

Точка разделения - значение активности фермента, выбранного в качестве критерия для отнесения пациента в группу с благоприятным или неблагоприятным прогнозом (Петри А., Сэбин К. Наглядная статистика в медицине. - М.: Гоэтар-Мед. - 2003).

Чувствительность диагностического теста - это доля пациентов с заболеванием, которые точно идентифицированы тестом (там же). Специфичность диагностического теста - это доля пациентов без заболевания, которые точно идентифицированы тестом (там же).

Как будет показано ниже, пациенты были обследованы как до, так и после лечения, и активность катепсинов В и L у пациентов до лечения была соотнесена с фактическим результатом лечения. Если за 100% принять количество пациентов, у которых лечение оказалось неэффективным, то чувствительность предлагаемого способа прогнозирования эффективности лечения определили как долю этих пациентов, которых предлагаемый способ также относит в группу с низкой эффективностью терапии. Если за 100% принять количество пациентов, у которых лечение оказалось высокоэффективным, то специфичность предлагаемого способа определили как долю этих пациентов, которых предлагаемый способ также относит в группу с высокой эффективностью терапии. Хотелось бы, чтобы чувствительность и специфичность способа были как можно ближе к 1 (к 100%). Однако на практике можно добиться высокой чувствительности за счет специфичности способа и наоборот (Петри А., Сэбин К. Наглядная статистика в медицине. - М.: Гоэтар-Мед. - 2003).

На фиг.1 и 2 приведены графики зависимости чувствительности и специфичности способа от активности катепсина В и катепсина L в точках разделения (на фиг.1 - для ЛГМ, на фиг.2 - для НХЛ). По оси ординат отложены проценты (чувствительность и специфичность в процентах). По оси абсцисс отложена активность катепсинов В и L в нмоль МКА/мин на литр.

Поскольку предлагаемый способ включает определение двух ферментов, то на оси абсцисс приведены ряды значений активности обоих ферментов друг под другом: ряд значений активности катепсина L, а под ним - ряд значений активности катепсина В.

Порядок совмещения рядов рассмотрим для ЛГМ (для НХЛ делают аналогичное построение). Строят 2 диаграммы на основании исследуемой выборки больных. На первой диаграмме на оси абсцисс откладывают значения активности катепсина В, а на оси ординат - количество больных. Строят диаграмму распределения количества больных соответственно активности фермента: для каждого диапазона значений активности катепсина В откладывают количество больных, у которых активность катепсина В попадает в данный диапазон значений его активности. В исследованной группе пациентов с ЛГМ, численностью 22 человека, катепсин В принимал значения от 0,4 нмоль МКА/мин на литр до 7,6 нмоль МКА/мин на литр. На ось абсцисс были нанесены деления от 0 до 8 нмоль МКА/мин на литр с шагом делений 0,1 нмоль МКА/мин на литр (80 диапазонов). Для каждого диапазона значений активности было отложено количество пациентов, активность катепсина В у которых попадала в данный диапазон, например в диапазон значений «более 1,7» - «1,8 включительно» попало значение активности катепсина В у 1 больного (активность катепсина В у него составляла 1,79 нмоль МКА/мин на литр), в диапазон значений «более 1,8» - «1,9 включительно» не попало ни одного больного, в диапазон «более 1,9» - «2,0 включительно» попали значения активности катепсина В у двух больных (у одного активность катепсина В составляла 1,97, у другого - 1,96 нмоль МКА/мин на литр) и т.д. Наибольшее количество больных имело активность катепсина В диапазоне значений 2,9-3,1 нмоль МКА/мин на литр.

На второй диаграмме аналогичным образом строят распределение для больных с ЛГМ по катепсину L. Катепсин L в исследованной группе пациентов с ЛГМ принимал значения от 4,2 до 39,4 нмоль МКА/мин на литр. На ось абсцисс был нанесен диапазон значений от 0 до 40 нмоль МКА/мин на литр с шагом делений 0,5 нмоль МКА/мин на литр (также 80 диапазонов). Для каждого диапазона значений активности катепсина L также было отложено количество пациентов, активность катепсина L у которых попадала в данный диапазон. Наибольшее количество пациентов имело активность катепсина L, попавшую в диапазон 21,5-22,5 нмоль МКА/мин на литр.

На графике зависимости чувствительности и специфичности способа от активности катепсинов В и L в точках разделения на оси абсцисс откладывают один под другим ряд значений активности катепсина В и катепсина L таким образом, чтобы совместились диапазоны, в которые попадает активность катепсина В и активность катепсина L у наибольшего количества больных. На фиг.1 на оси абсцисс ряд значений активности катепсина В с шагом 0,1 нмоль МКА/мин на литр расположен под рядом значений активности катепсина L с шагом 0,5 нмоль МКА/мин на литр таким образом, чтобы оказались один под другим диапазоны активности ферментов 2,9-3,1 нмоль МКА/мин на литр для катепсина В и 21,5-22,5 нмоль МКА/мин на литр - для катепсина L (число, указанное на фиг.1 и 2 на оси абсцисс между рисками, относится к середине интервала между рисками). Получившиеся пары значений активности катепсина В и катепсина L были взяты за точки разделения и построены таблица 1 и соответствующий ей график на фиг.1. На фиг.1 представлена средняя часть графиков, на основе которой производится выбор точек разделения.

Таблица 1
Чувствительность и специфичность предлагаемого способа при различных точках разделения у больных лимфогранулематозом
Катепсин В, нмоль МКА/мин на литр	Катепсин L, нмоль МКА/мин на литр	Чувствительность, %	Специфичность, %
1,6	15,0	33	100
1,7	15,5	33	100
1,8	16,0	33	100
1,9	16,5	33	100
2,0	17,0	33	92
2,1	17,5	44	92
2,2	18,0	44	92
2,3	18,5	44	95
2,4	19,0	56	92
2,5	19,5	56	92
2,6	20,0	67	92
2,7	20,5	67	85
2,8	21,0	78	85
2,9	21,5	78	85
3,0	22,0	89	69
3,1	22,5	89	69
3,2	23,0	89	62
3,3	23,5	100	62
3,4	24,0	100	54
3,5	24,5	100	54
3,6	25,0	100	54
3,7	25,5	100	54
3,8	26,0	100	46
3,9	26,5	100	46
4,0	27,0	100	46
4,1	27,5	100	46
4,2	28,0	100	46
4,3	28,5	100	46
4,4	29,0	100	46

Для НХЛ были выполнены построения, аналогичные вышеописанным для ЛГМ. При построении диаграмм для НХЛ активность ферментов на оси абсцисс откладывалась с тем же шагом (0,1 нмоль МКА/мин на литр для катепсина В и 0,5 нмоль МКА/мин на литр для катепсина L). Исследованная группа пациентов с НХЛ составила 80 человек. Наибольшее количество значений активности ферментов у пациентов с НХЛ попало в следующие диапазоны значений: 2,1-2,3 нмоль МКА/мин на литр для катепсина В и 14,5-15,5 нмоль МКА/мин на литр - для катепсина L.

На фиг.2 на оси абсцисс ряд значений активности катепсина В расположен под рядом значений активности катепсина L таким образом, чтобы оказались один под другим диапазоны активности ферментов, на которые приходится наибольшее количество больных (т.е. 2,1-2,3 нмоль МКА/мин на литр для катепсина В и 14,5-15,5 нмоль МКА/мин на литр - для катепсина L). Получившиеся пары значений активности катепсина В и катепсина L были взяты за точки разделения и построены таблица 2 и график (фиг.2) зависимости чувствительности и специфичности предлагаемого способа от точек разделения. На фиг.2 представлена средняя часть графиков, на основе которой производится выбор точек разделения.

Точки разделения выбирают из желательной оптимизации чуствительности и специфичности (Петри А., Сэбин К. Наглядная статистика в медицине. - М.: Гоэтар-Мед. - 2003, стр.94). Принцип оптимизации может быть разным. Например, при диагностике считается, что для состояний, которые легко излечиваются, предпочтительнее высокая специфичность способа диагностики; для состояний, которые серьезны и трудноизлечимы, лучше высокая его чувствительность.

Если выбирать для предлагаемого способа прогнозирования эффективности лечения лимфом точки разделения так, чтобы он имел высокую чувствительность при наивысшей специфичности, которая возможна для данного уровня чувствительности, то получим следующее (см. графики на фиг.1 и 2):

Таблица 2
Чувствительность и специфичность предлагаемого способа при различных точках разделения у больных неходжкинской злокачественной лимфомой
Катепсин В, нмоль МКА/мин на литр	Катепсин L, нмоль МКА/мин на литр	Чувствительность, %	Специфичность, %
1,5	11,5	26	93
1,6	12,0	26	88
1,7	12,5	34	86
1,8	13,0	37	83
1.9	13,5	40	83
2,0	14,0	40	81
2,1	14,5	47	79
2,2	15,0	61	79
2,3	15,5	63	76
2,4	16,0	68	71
2,5	16,5	68	71
2,6	17,0	79	62
2,7	17,5	79	60
2,8	18,0	79	55
2,9	18,5	82	45
3,0	19,0	84	45
3,1	19,5	92	41
3,2	20,0	92	38
3,3	20,5	92	38
3,4	21,0	92	36
3,5	21,5	92	31
3,6	22,0	92	26
3,7	22,5	97	26
3,8	23,0	97	24
3,9	23,5	97	24
4,0	24,0	97	21
4,1	24,5	97	19
4,2	25,0	97	19

- для ЛГМ: задаем чувствительность, равную 89%; при заданной чувствительности специфичность способа составит 69%, а точки разделения будут иметь следующие значения: активность катепсина В - 3,1 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L - 22,5 нмоль МКА/мин на литр;

- для НХЛ: задаем чувствительность, равную 79%; при заданной чувствительности специфичность способа составит 62%, а точки разделения будут иметь следующие значения: активность катепсина В - 2,6 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L - 17,0 нмоль МКА/мин на литр.

В тех случаях, когда специфичность не менее важна, чем чувствительность (неоправданная интенсификация лечения может нанести серьезный вред здоровью), оптимальные точки разделения могут быть выбраны на основе другого принципа - минимизации ошибки прогноза: [(100% - чувствительность) + (100% - специфичность)] = min. В этом случае чувствительность, специфичность и точки разделения будут следующими:

- для ЛГМ: чувствительность - 78%, специфичность - 85%. Ошибка прогноза при этом составляет 37% [(100%-78%)+(100%-85%)=37%] и является наименьшей (см. табл.1, фиг.1). Заданные чувствительность и специфичность способа имеют место при двух парах точек разделения: 1) активность катепсина В - 2,8 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L - 21,0 нмоль МКА/мин на литр; 2) активность катепсина В - 2,9 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L - 21,5 нмоль МКА/мин на литр;

- для НХЛ минимальная ошибка прогноза имеет место при вышеуказанных значениях чувствительности, специфичности и точек разделения: чувствительность - 79%, специфичность - 62%, активность катепсина В - 2,6 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L - 17,0 нмоль МКА/мин на литр и составляет 59% [(100%-79%)+(100%-62%)=59%] (табл.2, фиг.2).

Если исследовать другую группу пациентов или увеличить исследуемую группу пациентов с ЛГМ и НХЛ, то вполне возможно, что точки разделения, выбранные на основе указанных выше принципов, несколько изменят свое значение, сместятся. Их можно будет определить тем же способом, что приведен в данном описании.

Если взять точки разделения для НХЛ, равные 2,6 нмоль МКА/мин на литр для катепсина В и 17,0 нмоль МКА/мин на литр - для катепсина L, а точки разделения для ЛГМ, равные 3,1 нмоль МКА/мин на литр для катепсина В и 22,5 нмоль МКА/мин на литр для катепсина L, то частный случай выполнения предлагаемого способа прогнозирования эффективности терапии лимфом будет заключаться в том, что в сыворотке крови пациента до начала лечения определяют активность цистеиновых протеаз лизосом катепсинов В и L и, если у пациента с НХЛ активность катепсина В выше 2,6 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L выше 17,0 нмоль МКА/мин на литр, а у пациента с ЛГМ активность катепсина В выше 3,1 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L выше 22,5 нмоль МКА/мин на литр, то прогнозируют высокую эффективность его лечения, а если у пациента с НХЛ активность катепсина В равна или ниже 2,6 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L равна или ниже 17,0 нмоль МКА/мин на литр, а у пациента с ЛГМ активность катепсина В равна или ниже 3,1 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L равна или ниже 22,5 нмоль МКА/мин на литр, то прогнозируют низкую эффективность его лечения. Если же активность одного фермента у пациента выше точки разделения, а активность другого равна или ниже точки разделения, то определяют выраженность отклонения каждого фермента от точки разделения путем определения величины относительного отклонения. Для этого абсолютную величину разницы между активностью фермента в точке разделения и активностью того же фермента у данного пациента делят на величину активности того же фермента в точке разделения. Если относительное отклонение больше у фермента, активность которого выше точки разделения, то прогнозируют высокую эффективность лечения данного пациента, а если относительное отклонение больше у фермента, активность которого ниже точки разделения, то прогнозируют низкую эффективность лечения данного пациента.

Примеры

1) У больного НХЛ до лечения активность катепсина В составляет 3,95 нмоль МКА/мин на литр, а активность катепсина L составляет 22,18 нмоль МКА/мин на литр. Активность обоих ферментов у пациента выше их активности в точках разделения (активность катепсина В в точке разделения составляет 2,6 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L в точке разделения составляет 17,0 нмоль МКА/мин на литр), следовательно, прогнозируют высокую эффективность терапии у данного пациента.

2) У больного НХЛ активность катепсина В составляет 1,68 нмоль МКА/мин на литр, а активность катепсина L составляет 13,52 нмоль МКА/мин на литр. Активность обоих ферментов у пациента ниже их активности в точках разделения (активность катепсина В в точке разделения составляет 2,6 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L в точке разделения составляет 17,0 нмоль МКА/мин на литр), следовательно, прогнозируют низкую эффективность терапии у данного пациента.

3) У больного НХЛ активность катепсина В составляет 3,95 нмоль МКА/мин на литр, а активность катепсина L составляет 13,52 нмоль МКА/мин на литр. Активность катепсина В выше его активности в точке разделения, а активность катепсина L ниже его активности в точке разделения. Определяют относительные отклонения по каждому ферменту от точки разделения. По катепсину В относительное отклонение составляет: |2,6-3,95|:2,6=0,519. По катепсину L относительное отклонение составляет: |17,0-13,52|:17,0=0,205. Величина относительного отклонения больше у катепсина В, активность которого выше точки разделения. Следовательно, у данного пациента прогнозируют высокую эффективность терапии.

4) У больного НХЛ активность катепсина В составляет 1,70 нмоль МКА/мин на литр, а активность катепсина L составляет 20,52 нмоль МКА/мин на литр. Активность катепсина В ниже его активности в точке разделения, а активность катепсина L выше его активности в точке разделения. Определяют относительные отклонения по каждому ферменту от точки разделения. По катепсину В относительное отклонение составляет: |2,6-1,70|:2,6=0,346. По катепсину L относительное отклонение составляет: |17,0-20,52|:17,0=0,207. Величина относительного отклонения больше у катепсина В, активность которого ниже точки разделения. Следовательно, у данного пациента прогнозируют низкую эффективность терапии.

Для пациентов с ЛГМ прогноз делается аналогичным образом.

Как указывалось выше, точками разделения для ЛГМ могут быть также следующие:

- активность катепсина В - 2,8 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L - 21,0 нмоль МКА/мин на литр;

- активность катепсина В - 2,9 нмоль МКА/мин на литр, активность катепсина L - 21,5 нмоль МКА/мин на литр.

По сравнению с прототипом предлагаемый метод:

- более прост технически;

- учитывает механизмы опухолевой прогрессии (используемые в данном методе протеазы лизосом непосредственно принимают активное участие в патогенезе злокачественных новообразований).

По сравнению с МПИ предлагаемый метод характеризуется более высокой чувствительностью и специфичностью (чувствительность и специфичность МПИ на обследованной группе пациентов с лимфомами высокой степени злокачественности составляли менее 50%).

Перечень фигур иллюстративного материала:

Фиг.1 - чувствительность и специфичность предлагаемого способа при различных точках разделения у больных лимфогранулематозом. Число, указанное на оси абсцисс между рисками, относится к середине интервала между рисками. Активность катепсина В и катепсина L по оси абсцисс указана в нмоль МКА/мин на литр. По оси ординат отложены проценты (чувствительность и специфичность в процентах).

Фиг.2 - чувствительность и специфичность предлагаемого способа при различных точках разделения у больных неходжкинской злокачественной лимфомой. Число, указанное на оси абсцисс между рисками, относится к середине интервала между рисками. Активность катепсина В и катепсина L по оси абсцисс указана в нмоль МКА/мин на литр. По оси ординат отложены проценты (чувствительность и специфичность в процентах).

Обоснование способа

В основу способа легло исследование активности катепсинов В и L в сыворотке крови больных лимфомами. Была обнаружена связь между активностью указанных ферментов до лечения и фактической его эффективностью.

Клиническая характеристика больных

В группу обследуемых вошли 102 пациента Городского гематологического центра города Новосибирска. Из них у 80 больных была диагностирована НХЛ, у 22 больных - ЛГМ. Средний возраст больных НХЛ составил 53,0±1,77 лет; распределение по полу было следующим: 36 (45,0%) женщин и 44 (55,0%) мужчины. Средний возраст больных ЛГМ составил 33,9±2,78 лет; распределение по полу было следующим: 11 (50,0%) женщин и 11 (50,0%) мужчин. В подгруппе больных НХЛ у 56,3% больных наблюдалась индолентная лимфома, у 43,7% - агрессивная; у 12,5% пациентов - II стадия процесса, у 6,3% - III стадия, у 81,2% - IV стадия; у 47,5% больных установлено наличие Б-симптомов заболевания (снижение массы тела, лихорадка, потливость). В подгруппе больных ЛГМ у 31,8% пациентов был выявлен вариант нодулярного склероза, у 68,2% - смешанно-клеточный вариант; у 45,5% больных - II стадия ЛГМ, у 31,8% - III стадия, у 22,7% - IV стадия; у 63,6% больных установлено наличие Б-симптомов заболевания.

Активность обоих ферментов была определена у 97 пациентов (у 76 пациентов с НХЛ и 21 пациента с ЛГМ).

Пациенты с индолентной НХЛ получали лечение по протоколам СОР (циклофосфан, винкристин, преднизолон), CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон), с агрессивной - CHOP, CHOEP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, этопозид, преднизолон) - всего 4-6 курсов; больные ЛГМ - по протоколу ABVD (доксорубицин, блеомицин, винбластин, дакарбазин), ВЕАСОРР (блеомицин, этопозид, доксорубицин, циклофосфан, винкристин, прокарбазин, преднизолон) - всего 4-6 курсов.

Эффект полихимиотерапии оценивался по общему состоянию больного, выраженности Б-симптомов, состоянию лимфоузлов, внутренних органов, анализам периферической крови и костного мозга, биохимическому исследованию, инструментальным методам обследования.

Группу контроля составили 28 клинически здоровых доноров из отделения переливания крови Городской клинической больницы №1. Средний возраст доноров составил 34,4±1,42 лет. Распределение по полу было следующим: 10 (35,7%) женщин и 18 (64,3%) мужчин.

Методы клинического, лабораторного и инструментального исследования больных

Обязательный комплекс обследования больных включал сбор жалоб, анамнез, лабораторные методы: общий анализ крови и мочи, биохимические тесты (концентрация общего белка, холестерина, триглицеридов, активность АлТ, АсТ, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, содержание С-реактивного белка, сиаловых кислот в сыворотке крови). Всем пациентам проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости, рентгенография грудной клетки, по показаниям - эзофагогастродуоденоскопия, компьютерная томография или МРТ органов грудной клетки и брюшной полости, исследование костномозгового пунктата, трепанобиоптата. Диагноз заболевания был верифицирован на основании гистологического исследования биоптата лимфоузла и/или костного мозга с иммуногистохимической верификацией опухоли с использованием 37 моноклональных антител к кластерам дифференцировки гемопоэтических клеток.

Получение сыворотки

Кровь для исследования забирали у больных из локтевой вены до и после лечения. Кровь центрифугировали, полученную сыворотку хранили до исследования при температуре -20°С.

Определение активности катепсина В

Активность катепсина В определяли с помощью флюоресцентного метода Барретта и Киршке (Kirschke H., Wiederanders В. Lysosomal proteinases // Acta Histochem., 1987, V.82(1), P.2-4) с использованием субстрата Z-Arg-Arg-NMCA (НПО «Вектор», Кольцово). Инкубационная смесь содержала 200 мкл 12,5 мкМ раствора субстрата, 100 мкл исследуемого образца сыворотки, 200 мкл 0,2М фосфатного буфера рН 6,0, содержащего 0, 22М КН₂РО₄, 0,03М NaHPO₄, 2,5M ЭДТА и 5 мМ ДТТ. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 2 мл раствора, содержащего 0,1М раствор монохлоруксусной кислоты, 0,1М раствор NaOH и 0,1М раствор уксусной кислоты (рН 4,3). Флюоресцирующие продукты реакции измеряли на спектрофлюориметре «Perkin Elmer» 650-10S (Япония) при λ=355 нм (возбуждение) и λ=460 нм (эмиссия). Удельную активность катепсина В выражали в нмоль метилкумариламида (МКА)/на литр.

Определение активности катепсина L

Для определения активности катепсина L использовали субстрат Z-Phe-Arg-NMCA (НПО «Вектор», Кольцово) с добавлением в инкубационную смесь селективного ингибитора катепсина В СА-074 (Kirschke H., Barrett A.J. Cathepsin L - a lysosomal cysteine proteinase // Prog. Clin. Biol. Res. - 1985. - V.180. - P.61-69). Инкубационная смесь содержала 200 мкл 12,5 мкМ раствора субстрата, 100 мкл исследуемого образца сыворотки, 175 мкл 0,2М фосфатного буфера, рН 5,5 и 25 мкл 200 мкМ Са-074 [N-(L-3-транс-пропилкарбоилоксирин-2-карбонил)-L-изолейцин-L-пролин] ("Sigma", USA) (Katunuma et al., 1995). Смесь инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С, реакцию останавливали добавлением 2 мл раствора, описанного для катепсина В. Флюоресценцию измеряли при тех же условиях, что и для катепсина В. Удельную активность катепсина L выражали в нмоль метилкумариламида (МКА)/мин на литр.

Статистические методы обработки результатов

Статистическую обработку результатов проводили с вычислением среднего арифметического (М) и ошибки среднего арифметического (m). Достоверность различий (р) рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при р<0,05.

Активность катепсинов В и L до лечения в группах пациентов, где лечение в дальнейшем оказалось эффективным и неэффективным

Больные, у которых терапия была эффективной (имело место исчезновение или уменьшение лимфоузлов, признаков клинической активности, улучшение или нормализация показателей периферической крови и костного мозга), были включены в группу «+», а больные, у которых отсутствовал эффект от лечения или заболеван