Растительные клетки и организмы растений с модифицированным клеточным ростом, развитием и дифференцировкой

Растительные клетки и организмы растений с модифицированным клеточным ростом, развитием и дифференцировкой

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам регуляции клеточного роста и/или регуляции развития и дифференцировки у растений и к применимым для этого молекулам. Кроме того, настоящее изобретение относится к продуцируемым и/или созданным растениям с генетически контролируемыми генами, вовлеченными в рост их клеток и/или развитие и дифференцировку, и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Растения обладают особыми эмбриологическими свойствами, отличными от свойств других эукариот. Так как растительные клетки не мигрируют, считается, что клеточное деление, растяжение и запрограммированная гибель клеток определяют морфогенез. Клетки пролиферируют в меристемных тканях, существующих на обоих полюсах, верхушке побега и кончике корня. Пролиферирующие клетки дифференцируются и накапливаются, развиваясь в растение. Размер растения определяется количеством и размером входящих в его состав клеток, формирующих растение. Растения контролируют клеточный рост (пролиферацию клеток) посредством регуляции клеточного цикла, так что размеры растений адаптированы к изменяемым условиям окружающей среды. Регуляция клеточного цикла имеет важное значение для дифференцировки растений. Например, перициклические клетки корней пребывают в особом периоде (фазе G2) клеточного цикла, и дифференцировка боковых корней определяется тем, начали ли клетки делиться или нет. Количество клеток гипокотиля регулируется у растений, но клеточный цикл изменяется в темноте и размер клеток изменяется при эндоредупликации.

Предполагается, что способ регуляции деления клеток растений, в частности способ регуляции клеточного цикла, имеет большое значение в качестве нового способа селекции растений, при котором одновременно воздействуют на такие параметры, как рост, форма и реакция на стресс.

Клетка делится на две дочерние клетки в результате целого ряда процессов, называемых клеточным циклом, который состоит из четырех фаз, а именно: промежуточная фаза 1 (фаза G1), фаза синтеза ДНК (S-фаза), промежуточная фаза 2 (фаза G2) и фаза митоза (фаза M). Были указаны и исследованы механизмы, связанные с регуляцией фаз S и M клеточного цикла. Среди этих двух фаз фаза M, называемая фазой митотического деления, является фазой для равномерного распределения хромосом, удвоенных в фазе S, между дочерними клетками. Для вступления в фазу M циклины (одним из типичных представителей является циклин B) связываются с циклин-зависимой киназой (CDK) с образованием активированного комплекса для усиления агрегации хромосом и разрушения ядерных мембран. Фаза M заканчивается после процесса, называемого цитокинезом (деление цитоплазмы) для разделения цитоплазмы после распределения хромосом на две части. В растительных клетках образуется фрагмопласт, который является структурой, специфичной для растений, и протекает деление цитоплазмы. Образование фрагмопласта регулируется кинезин-подобными белками NACK1 и NACK2.

Циклин B, NACK1 и NACK2, выполняющие важные функции в процессе - от вступления в фазу M до окончания фазы M в растительных клетках, показывают картины экспрессии генов, специфичные для фаз G2/M. Сообщается, что специфичная регуляторная последовательность, называемая M-специфичным активатором (MSA), существующая в области промотора, контролирует специфичную для фаз экспрессию указанных генов (непатентный документ 1). Кроме специфичных для растений CDK, CDKB и генов, имеющих высокое сходство с циклин-специфичными ферментами E2 среди ферментов E2, связанных с протеолизом, сообщалось о ряде функционально неизвестных генов, имеющих картины экспрессии, специфичные для фазы M. При анализе показано, что многие из указанных генов содержат последовательности MSA в промоторных областях. Поэтому считается, что механизмы регуляции специфичной для фаз G2/M экспрессии генов последовательностями MSA консервативны у всех растений.

NtmybA1, NtmybA2 и NtmybB (в дальнейшем называемые «Ntmyb») идентифицированы в табаке в качестве MSA-связывающих факторов. Аминокислотные последовательности белков Ntmyb обычно имеют высокое сходство с областью связывания ДНК myb, имеющей последовательность, состоящую из неполных трех повторов, существующих в c-myb у животных и других организмов (такие белки, содержащие указанную ДНК-связывающую область, в дальнейшем называют «3Rmyb»). Многие растения имеют гены, несущие myb-подобные ДНК-связывающие области, но большинство из них состоит из двух повторяющихся областей myb или областей myb неповторяющегося типа. Например, Arabidopsis thaliana, секвенирование генома которого завершено, имеет более ста генов, содержащих myb-подобные ДНК-связывающие области, но только пять генов содержат указанную выше myb-подобную ДНК-связывающую область, состоящую из трех неполных повторов myb (3Rmyb). Таким образом, такие гены известны как конкретные представители суперсемейств, составляющих группу myb-подобных белков растений (непатентный документ 2).

Эксперименты по регуляции транскрипции с репортерными генами проводили для исследований функций Ntmyb, используя системы временной экспрессии в растительных клетках. Сообщалось, что NtmybA1 и NtmybA2 активировали транскрипцию с промотора циклина B мадагаскарского барвинка (Catharanthus roseus) (CYM) и промотора NACK 1, и наоборот, NtmybB супрессировал указанную транскрипцию, таким образом показывая, что Ntmyb способны связываться с MSA и действовать в качестве регулирующих транскрипцию факторов для генов, имеющих специфичную для фаз G2/M экспрессию (непатентный документ 3). Однако указанные сообщения основаны только на результатах транскрипции репортерных генов, активированных Ntmyb, временно экспрессированными в одной точке клеточного цикла, регулируемого циклической экспрессией многочисленных генов. Таким образом, еще не было сообщений, раскрывающих функции Ntmyb в клеточном цикле и делении клеток.

Сообщались примеры, описывающие, что рост и развитие растений модифицировали трансформацией специфично экспрессирующимися в фазах G2/M генами. Например, удлинение корней усиливается в трансформированных растениях, которые эктопически экспрессировали циклин B (непатентный документ 4); и цитоплазматическое деление было неполным, уменьшая высоту растений, имеющих супрессированную экспрессию NACK1, важного для окончания фазы M, или в трансформированных растениях, имеющих доминантные негативные по NACK1 конструкции (непатентный документ 5). Однако указанные примеры представляют собой способы регулирования клеточного роста с использованием отдельных генов, связанным с прохождением фазы M. Таким образом, не было сообщений, описывающих трансформированные растения, в которых экспрессия специфичных для фаз G2/M генов, включая функционально неизвестные гены, регулируемых последовательностями MSA, регулировалась совместно.

Ntmyb содержит ДНК-связывающую область myb, имеющую гомологию с c-myb. Считается, что транскрипционная функция c-myb неактивна, когда мотив EVES, существующий в указанном белке, связывается с ДНК-связывающим доменом myb, и активируется, когда фосфорилирование мотива EVES протеинкиназой приводит к изменению конформации белка, тем самым обеспечивая возможность для связывания коактиватора P100 с ДНК-связывающей областью myb (непатентный документ 6). Так как обнаружено, что другие области, отличные от ДНК-связывающих областей myb, не имеют сходства при сравнении Ntmyb и c-myb, и регуляторные последовательности, такие как мотивы EVES, не являются консервативными, то предполагают, что механизм регуляции способности Ntmyb активировать транскрипцию отличается от механизма в случае белка c-myb. Не было сообщений, описывающих наличие области для регулирования активирующей транскрипцию способности Ntmyb.

Сообщалось только о ДНК, кодирующих полноразмерный 3Rmyb, в табаке и Arabidopsis thaliana, которые являются двудольными растениями, но не было сообщений о полноразмерном 3Rmyb из однодольных растений. Это значит, что нет сообщений, показывающих, являются ли механизмы регуляции специфичной для фаз G2/M экспрессии генов, опосредованной последовательностью MSA и 3Rmyb, консервативными или неконсервативными у однодольных растений и двудольных растений.

Большинство животных являются диплоидными, но у растений известны различные уровни плоидности. Triticum является гексаплоидным, а Asterales является декаплоидным. Большое количество указанных полиплоидных растений обычно имеют качества или свойства, полезные в сельском хозяйстве, и создание растений разной плоидности применяют в качестве средства для селекции. Обработку колхицином широко используют в качестве методики для создания полиплоидов. А именно, обработку колхицином осуществляют на семенах растений, зародышах растений или клетках органов в культуре ткани и затем проводят отбор растений из регенерированных растений. Колхицин ингибирует образование веретена деления плоидных клеток после удвоения ДНК, и плоидные клетки образуются в результате «перескакивания» фазы митоза. Однако необходимы исследования органов, которые необходимо обрабатывать колхицином, и времени для обработки лекарственным средством; таким образом, это нелегко осуществить у всех растений.

[Непатентный документ 1] Ito et al., Plant Cell, 10: 331 (1998)

[Непатентный документ 2] Stracke et al., Curr. Opin. Plant Biol. 4: 447 (2001)

[Непатентный документ 3] Ito et al., Plant Cell, 13: 1891 (2001)

[Непатентный документ 4] Doerner et al., Nature, 380: 520 (1996)

[Непатентный документ 5] Nishihama et al., Cell, 109: 87 (2002)

[Непатентный документ 6] Dash et al., Genes Dev., 10: 1858 (1996)

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как указано выше, так как регуляция клеточного цикла имеет важное значение для селекции растений, целью настоящего изобретения является новый способ модифицирования роста или пролиферации растительных клеток. А именно, целью настоящего изобретения является способ модифицирования развития/дифференцировки растений в комбинации с модифицированием роста или пролиферации растительных клеток и применимые в данном способе гены растений.

Другой целью настоящего изобретения являются способы существенной модификации функции генов растений 3Rmyb и новые варианты молекул белка 3Rmyb, функция которых модифицирована.

Авторы изобретения провели всестороннее исследование, обнаружив, что ген растений 3Rmyb является фактором, необходимым для роста (или пролиферации) растительных клеток, и осуществили способ модифицирования роста растительных клеток целенаправленным воздействием на ген 3Rmyb и способ модифицирования развития/дифференцировки растений. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что указанные способы могут быть применимы для множества растений.

А именно, созданы растительные клетки и растения, проявляющие модифицированные активности растительного белка 3Rmyb. В указанных растительных клетках и растениях клеточный рост (или пролиферация клеток) и/или развитие/дифференцировка клеток несомненно могут быть модифицированы.

Кроме того, впервые при использовании растительных клеток и растений, у которых наблюдаются модифицированные активности растительного белка 3Rmyb, обнаружено, что представитель 3Rmyb растений, содержащий специфичную аминокислотную последовательность, является положительно регулирующим фактором в отношении клеточного цикла и деления клеток (одним из типичных представителей растительного 3Rmyb является «NtmybA2») и что другой представитель 3Rmyb растений, содержащий аминокислотную последовательность, отличную от вышеуказанной последовательности, является отрицательно регулирующим фактором в отношении клеточного цикла и деления клеток (одним из типичных примеров растительного 3Rmyb является «NtmybB»).

Авторы изобретения также успешно создали варианты транскрипционных факторов, растительных белков 3Rmyb и обнаружили, что их функции модифицированы. Авторы изобретения успешно обнаружили, что указанные варианты можно использовать для того, чтобы модифицировать активности, присущие растительным белкам 3Rmyb в растительных клетках или в растениях. А именно, авторы изобретения обнаружили регуляторные области для регуляции активностей транскрибирующихся ниже генов среди аминокислотных последовательностей растительных белков 3Rmyb и успешно создали молекулы, обладающие модифицированной способностью активировать транскрипцию генов. Авторы изобретения успешно создали варианты растительных белков 3Rmyb, обладающие существенно повышенной способностью активировать транскрипцию (обладающие существенно повышенными свойствами активации транскрипции), и молекулы, действующие доминантно-негативно на транскрипты генов растений 3Rmyb.

Авторы изобретения также успешно выделили новый ген растений 3Rmyb, полученный из однодольного растения риса, т.е. ДНК, кодирующую белок Os3RmybA1; и обнаружили, что белок Os3RmybA1 является функциональным эквивалентом белка табака 3Rmyb, белка NtmybA2.

На основании указанных выше полученных данных авторы осуществили настоящее изобретение.

Настоящее изобретение относится к способу регуляции роста клеток растений и/или регуляции развития и дифференцировки организма растения, при этом ген-мишень выбран из генов 3Rmyb растений, гена Os3RmybA1, вовлеченного в деление клеток растений, а также их генных аналогов, и белков, кодируемых указанными генами.

В используемом в данном описании смысле счет, «счет при выравнивании», свидетельствующий о сходстве между определенной аминокислотой или аминокислотной последовательностью и конкретной представляющей интерес аминокислотой или аминокислотной последовательностью, относится к проценту идентичных или сходных аминокислот, который получен в результате анализа множественного выравнивания аминокислотных последовательностей с использованием программы ClustalW (http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-j.html). Кроме того, указанное выше сравнение аминокислотных последовательностей проводят при оптимальном выравнивании аминокислотных последовательностей, являющихся мишенями. Две аминокислотные последовательности являются оптимальными в данном описании, если конкретно не описано иное. Программа работает при следующих условиях: параметры устанавливают по умолчанию (def), OUTPUT=clustal, OUTORDER=aliged, MATRIX=blosum, GAPDIST=8, MAXDIV=40, ENDGAPS=OFF, NOPGAPS=OFF и NOHGAPS=OFF.

В более конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается следующее:

(1) Растительная клетка, имеющая (генетически) модифицированную активность растительного белка 3Rmyb по сравнению с соответствующей растительной клеткой дикого типа.

(2) Растительная клетка по п.(1), в которой указанная растительная клетка несет или была трансформирована ДНК, выбранной из следующих ДНК (a)-(f), или конструкцией рекомбинантной ДНК или вектором, которые указаны в следующем п.(g):

(a) ДНК, кодирующая любую аминокислотную последовательность растительных белков 3Rmyb,

(b) ДНК, не только гибридизующаяся с ДНК, кодирующей любую аминокислотную последовательность растительных белков 3Rmyb, в жестких условиях, но также кодирующая функционально эквивалентный белок любому из растительных белков 3Rmyb;

(c) ДНК, кодирующая рибозимную каталитическую РНК, которая специфично расщепляет транскрипт ДНК, кодирующей любой из растительных белков 3Rmyb;

(d) ДНК, не только кодирующая РНК, которая супрессирует экспрессию ДНК, кодирующей любой из растительных белков 3Rmyb, посредством механизмов косупрессии при экспрессии в растительной клетке, но также являющаяся по меньшей мере на 90% гомологичной ДНК 3Rmyb;

(e) ДНК, кодирующая РНК, которая супрессирует экспрессию ДНК, кодирующей любой из растительных белков 3Rmyb, посредством механизмов интерференции РНК при экспрессии в растительной клетке;

(f) ДНК, кодирующая антисмысловую РНК, которая комплементарна транскрипту ДНК, кодирующей любой из растительных белков 3Rmyb;

(g) рекомбинантная конструкция ДНК или вектор, содержащий по меньшей мере один представитель, выбранный из группы, состоящей из следующих представителей (i)-(iii):

(i) промотор, способный к транскрипции в растительной клетке,

(ii) ДНК, в которой ДНК по любому из указанных выше пп.(a)-(f) связана с указанной последовательностью промотора в смысловом или антисмысловом направлении, и

(iii) сигнал терминации транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.

(3) Растительная клетка по п.(1) или (2), в которой растительный белок 3Rmyb является транскрипционным фактором для активации специфичной для фаз G2/M транскрипции, опосредованной последовательностью MSA.

(4) Растительная клетка по п.(1) или (2), в которой растительный белок 3Rmyb, который является транскрипционным фактором для активации специфичной для фаз G2/M транскрипции, опосредованной последовательностью MSA, представляет собой белок, содержащий по меньшей мере аминокислотную последовательность

SILX₁KRXRXLX₃X₄PX₂XX₅X₁RXX₅KK (SEQ ID NO: 94),

где X означает любую аминокислоту, X₁ означает K или R, X₂ означает L, I или V, X₃ означает L или V, X₄ означает S или T и X₅ означает D или E.

(5) Растительная клетка по любому из пп.(1)-(4), в которой растительный белок 3Rmyb представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 76.

(6) Растительная клетка по п.(1) или (2), в которой растительный белок 3Rmyb является транскрипционным фактором для супрессии или ингибирования специфичной для фаз G2/M транскрипции, опосредованной последовательностью MSA.

(7) Растительная клетка по п.(1) или (2), в которой растительный белок 3Rmyb, который является транскрипционным фактором для супрессии или ингибирования специфичной для фаз G2/M транскрипции, опосредованной последовательностью MSA, представляет собой белок, содержащий по меньшей мере аминокислотную последовательность

SCSSXSX₆ (SEQ ID NO: 95),

где X означает любую аминокислоту и X₆ означает K, R, D, E или H.

(8) Растительная клетка по п.(1), (2), (6) или (7), в которой растительный белок 3Rmyb представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78.

(9) Растительная клетка по любому из пп.(1)-(8), в которой количество экспрессированных растительных белков 3Rmyb модифицировано по сравнению с соответствующей растительной клеткой дикого типа.

(10) Растительная клетка по любому из пп.(1)-(8), в которой рост указанной клетки модифицирован по сравнению с соответствующей растительной клеткой дикого типа.

(11) Растение, содержащее или имеющее растительную клетку по любому из пп.(1)-(10).

(12) Растение, которое является потомством, потомком или клоном трансгенного растения по п.(11).

(13) Растение по п.(11) или (12), в котором клеточный рост и/или развитие/дифференцировка модифицированы по сравнению с соответствующим растением дикого типа.

(14) Растение по п.(11) или (12), которое используют для модифицирования роста его клеток и/или развития/дифференцировки.

(15) ДНК, кодирующая белок 3Rmyb с повышенной способностью активировать транскрипцию по сравнению с соответствующим белком дикого типа.

(16) ДНК по п.(15), в которой белок 3Rmyb с повышенной способностью активировать транскрипцию несет потерю функции, вызванную регуляторной областью для регуляции способности активировать транскрипцию.

(17) ДНК по п.(16), в которой указанная регуляторная область потери функции расположена в положении ближе к C-концевой стороне, чем аминокислотная последовательность TPSILKKRHR, которая показана в SEQ ID NO: 89.

(18) ДНК по п.(16), в которой указанная регуляторная область потери функции расположена в положении ближе к C-концевой стороне, чем аминокислотный остаток W в аминокислотной последовательности NXXTPXRLWX, где X означает любую аминокислоту, которая показана в SEQ ID NO: 90.

(19) ДНК по п.(16), в которой указанная регуляторная область потери функции находится в пределах от аминокислотной последовательности PPRFPSXDXPF, где X означает любую аминокислоту, которая показана в SEQ ID NO: 91, до C-конца.

(20) ДНК по любому из пп.(15)-(19), которая кодирует растительный белок 3Rmyb, в котором мутация потери функции вызвана заменой, делецией (или нарушением) и/или добавлением (или инсерцией) по меньшей мере одной или нескольких аминокислот.

(21) ДНК по любому из пп.(15)-(19), которая кодирует растительный белок 3Rmyb, в котором мутация потери функции вызвана делецией или нарушением по меньшей мере одной или нескольких аминокислот.

(22) ДНК, кодирующая доминантный негативный белок против эндогенного растительного белка 3Rmyb.

(23) ДНК по п.(22), которая кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность ДНК-связывающей области 3Rmyb растений.

(24) Рекомбинантная конструкция ДНК или вектор, содержащий представитель, выбранный из группы, состоящей из следующих представителей (i)-(iii):

(i) промотора, способного к транскрипции в растительной клетке,

(ii) ДНК, в которой ДНК по любому из пп.(15)-(23) связана с указанной последовательностью промотора в смысловом или антисмысловом направлении, и

(iii) сигнала терминации транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.

(25) Растительная клетка, которая несет или была трансформирована ДНК, рекомбинантной конструкцией ДНК или вектором по любому из пп.(15)-(24).

(26) Растительная клетка по п.(25), в которой рост клетки модифицирован по сравнению с соответствующей растительной клеткой дикого типа.

(27) Трансгенное растение, содержащее или несущее растительную клетку по п.(25).

(28) Растение, которое является потомством, потомком или клоном трансгенного растения по п.(27).

(29) Растение по п.(27) или (28), в котором клеточный рост и/или развитие/дифференцировка модифицированы по сравнению с соответствующим растением дикого типа.

(30) ДНК, выбранная из следующих ДНК (a)-(i):

(a) ДНК, кодирующая белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32,

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 31,

(c) ДНК, кодирующая белок, не только содержащий аминокислотную последовательность с аминокислотной заменой, делецией (или нарушением) или добавлением (или инсерцией) одной или множества аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32, но также являющийся функционально эквивалентным белку с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32,

(d) ДНК, не только гибридизующаяся с ДНК с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 31 в жестких условиях, но также кодирующая белок, функционально эквивалентный белку с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32,

(e) ДНК, кодирующая белок, не только содержащий аминокислотную последовательность со счетом при выравнивании 60 или более по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32, но также являющийся функционально эквивалентным белку с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32,

(f) ДНК, кодирующая антисмысловую РНК, которая комплементарна транскрипту ДНК, выбранной из указанных выше ДНК по п.(a)-(e),

(g) ДНК, кодирующая рибозимную каталитическую РНК, которая специфично расщепляет транскрипт ДНК, выбранной из указанных выше ДНК по п.(a)-(e),

(h) ДНК, не только кодирующая РНК, которая супрессирует экспрессию ДНК, выбранной из указанных выше ДНК по п.(a)-(e), на основе механизмов косупрессии при экспрессии в растительной клетке, но также являющаяся по меньшей мере на 90% гомологичной указанной ДНК, выбранной из (a)-(e), и

(i) ДНК, не только кодирующая РНК, которая супрессирует экспрессию ДНК, выбранной из указанных выше ДНК по п.(a)-(e), на основе механизмов интерференции РНК при экспрессии в растительной клетке, но также являющаяся идентичной на протяжении 20 или более следующих друг за другом нуклеотидов указанной ДНК, выбранной из (a)-(e).

В настоящем изобретении растительный белок 3Rmyb представлен группой белков, отличающихся тем, что c-Myb-подобный домен Myb содержит аминокислотную последовательность, включающую в себя 3 неполных повтора ДНК-связывающего домена. Желательными являются такие растительные белки 3Rmyb, которые содержат аминокислотную последовательность со счетом при выравнивании по меньшей мере 60 (т.е. 60 или выше) при сравнении с аминокислотной последовательностью ДНК-связывающего домена myb белка c-myb человека (т.е. с аминокислотной последовательностью с остатками аминокислот 43-192 SEQ ID NO: 88), где счет при выравнивании указывает сходство при сравнении выровненных аминокислотных последовательностей. Кроме того, требуемые типы включают белки, содержащие аминокислотную последовательность с тремя повторами консервативной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 92 c-Myb-подобного ДНК-связывающего домена Myb, т.е.,

W[S,T]XXE[D,E]XX[L,I,V],

где X означает любую аминокислоту, и [] означает одну конкретную аминокислоту, выбранную из аминокислот, перечисленных в квадратных скобках,

с дополнительными промежуточными 42 произвольными аминокислотными остатками, расположенными между указанными повторами. Более предпочтительно такие типы включают белки, содержащие последовательность из 150 аминокислот следующей формулы:

WTXEEDXXLXXXVXXUXGX₇XWKXIAXXXXXROX₅JQCLHRWQKVLXPXLJKGXWOXEEDXXJXXXJXX₇XGXXKWSXJOXXXXGRIGKQCRERWUNHLXPXIXX₇XXWTXXEX₅XXLXXXHXXXGNX₇WAEJXX₇XLXGX₇ODNOIKNXWXSOXKKX₇

где X означает любую аминокислоту, J означает одну аминокислоту, выбранную из I, V, и L, O означает одну аминокислоту, выбранную из G, S, T, C и A, X₇ означает одну аминокислоту, выбранную из K, R и H, U означает одну аминокислоту, выбранную из H, W, Y и F и X₅ означает одну аминокислоту, выбранную из D и E, как показано в SEQ ID NO: 93.

Более желательно типы растительных белков 3Rmyb включают белки, в которых указанная последовательность из 150 аминокислот является последовательностью следующей формулы:

WTXEEDXXLXX[A,V]VXX[F,Y]XG[K,R][N,S,R]WK[K,R,N]IAXXXXXR[S,T][D,E][V,L]QCLHRWQKVL[N,D,H]P[D,E,N]L[V,I]KG[P,S,A]W[S,T]XEED[D,E,N]X[I,L]X[E,D,Q][L,M][V,I]X[K,R][Y,N,L]G[P,A,C]XKWSX[I,V][A,S]XX[L,M][P,A]GRIGKQCRERW[H,Y]NHL[D,N]PXI[K,N,R][K,R][D,E,N][A,P]WTX[E,Q]E[E,D]XXL[I,M,C]X[A,S,Y]H[Q,R]X[N,Y,H]GN[K,R]WAE[I,L]X[K,R]XL[P,H]G[R,K][S,T]DN[S,A,G]IKN[H,L]W[H,N]S[S,T][L,V,M]KK[K,R]

где Х является любой аминокислотой, и [] означает одну конкретную аминокислоту, выбранную из аминокислот, перечисленных в квадратных скобках, например, в [K,R] это означает K или R.

Кроме того, более желательным растительным белком 3Rmyb является белок, представленный аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78. Еще более желательный растительный белок 3Rmyb включает белок, представленный аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 55.

Таким образом, в объем настоящего изобретения также входит следующее:

(1) Трансформированная клетка, содержащая или несущая ДНК, выбранную из следующих ДНК (a)-(f):

(a) ДНК, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 54,

(b) ДНК, кодирующая антисмысловую РНК, которая комплементарна транскрипту ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 54,

(c) ДНК, кодирующая рибозимную каталитическую РНК, которая специфично расщепляет транскрипт ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54,

(d) ДНК, не только кодирующая РНК, которая супрессирует экспрессию ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, посредством механизмов косупрессии при экспрессии в растительной клетке, но также являющаяся на 90% или более гомологичной ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54,

(e) ДНК, не только кодирующая РНК, которая супрессирует экспрессию ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52 и SEQ ID NO: 54 посредством механизмов интерференции РНК при экспрессии в растительной клетке, но также являющаяся идентичной на протяжении 20 или более следующих друг за другом нуклеотидов ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54,

(f) ДНК, кодирующая доминантный негативный белок против белка, кодируемого эндогенной ДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 54,

или рекомбинантную конструкцию ДНК или вектор, которые указаны в следующем пункте (g):

(g) рекомбинантная конструкция ДНК или вектор, выбранные из группы, состоящей из:

(i) промотора, способного к транскрипции в растительной клетке,

(ii) ДНК, в которой ДНК по любому из указанных выше по пп.(a)-(f) связана с указанной последовательностью промотора в смысловом или антисмысловом направлении, и

(iii) сигнала терминации транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.

(2) Трансформированная растительная клетка, содержащая или несущая ДНК, выбранную из ДНК по пп.(1) (a)-(f), или рекомбинантную конструкцию ДНК или вектор по п.(1)(g).

(3) Трансформированная растительная клетка по п.(2), которую используют для модифицирования ее клеточного роста.

(4) Трансформированная растительная клетка по п.(2), в которой клеточный рост модифицирован или изменен.

(5) Трансгенное растение, содержащее или несущее трансформированную растительную клетку по любому из пп.(2)-(4).

(6) Трансгенное растение, которое является потомством, потомком или клоном трансгенного растения по п.(5).

(7) Трансгенное растение по п.(5) или (6), в котором рост растительной клетки модифицирован или изменен.

(8) Трансгенное растение по п.(5) или (6), которое используют для модифицирования развития и дифференцировки особей растений.

(9) Трансгенное растение по п.(5) или (6), в котором развитие и/или дифференцировка особей растений модифицирована или изменена.

(10) Пищевая и/или кормовая композиция, которая произведена или получена из растительной клетки по любому из пп.(2)-(4) или растения по любому из пп.(5)-(8).

(11) Химический продукт, который произведен или получен из растительной клетки по п.(2)-(4) или растения по любому из пп.(5)-(8).

(12) Белок, который выделен или получен из растительной клетки по п.(2)-(4) или растения по любому из пп.(5)-(8).

(13) Нуклеиновая кислота, которая выделена или получена из растительной клетки по п.(2)-(4) или растения по любому из пп.(5)-(8).

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается следующее:

(14) ДНК, выбранная из группы, состоящей из следующих ДНК по п.(a)-(e):

(a) ДНК, кодирующая белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32,

(b) ДНК с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 31,

(c) ДНК, кодирующая белок с последовательностью, имеющей аминокислотную замену, делецию (или нарушение) или добавление (или инсерцию) одной или множества аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32, при этом указанный белок является функционально эквивалентным аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32,

(d) ДНК, не только гибридизующаяся с ДНК, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 31, в жестких условиях, но также кодирующая белок, функционально эквивалентный аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32, и

(e) ДНК, кодирующая белок, имеющий аминокислотную последовательность со счетом при выравнивании 60 или более по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32, при этом указанный белок является функционально эквивалентным белку с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32.

(15) ДНК, кодирующая антисмысловую РНК, которая комплементарна транскрипту ДНК, выбранной из ДНК по п.(14) (a)-(e).

(16) ДНК, кодирующая рибозимную каталитическую РНК, которая специфично расщепляет транскрипт ДНК, выбранной из ДНК по п.(14) (a)-(e),

(17) ДНК, не только кодирующая РНК, которая супрессирует экспрессию ДНК, выбранной из ДНК по п.(14) (a)-(e), посредством механизмов косупрессии при экспрессии в растительной клетке, но также являющаяся на 90% или более гомологичной ДНК, выбранной из ДНК по п.(14) (a)-(e).

(18) ДНК (i) кодирующая РНК, которая супрессирует экспрессию ДНК, выбранной из ДНК по п.(14) (a)-(e), посредством механизмов интерференции РНК при экспрессии в растительной клетке, и (ii) являющаяся идентичной на протяжении 20 или более следующих друг за другом нуклеотидов ДНК, выбранной из ДНК по п.(14) (a)-(e).

(19) ДНК, кодирующая доминантный негативный белок против белка, кодируемого эндогенной ДНК растительной клетки, выбранной из ДНК по п.(14) (a)-(e).

(20) ДНК по любому из пп.(14)-(19), которую используют для того, чтобы модифицировать клеточный рост и/или развитие/дифференцировку растений.

(21) Рекомбинантная конструкция ДНК или вектор, содержащий элемент, выбранный из следующих элементов (i)-(iii):

(i) промотора, способного к транскрипции в растительной клетке,

(ii) ДНК, в которой ДНК, выбранная из ДНК по п.(14)-(19), связана с указанной последовательностью промотора в смысловом или антисмысловом направлении, и

(iii) сигнала терминации транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.

(22) Трансформированная клетка, которая несет ДНК, выбранную из ДНК по пп.(14)-(19), или рекомбинантную конструкцию ДНК или вектор, который указан в (21).

(23) Пептид, кодируемый ДНК, которая указана в п.(14), или его пептид; или доминантный негативный белок, направленный к белку, кодируемому эндогенной ДНК растительной клетки, выбранной из ДНК по п.(14) (a)-(e), или его пептиду.

(24) Способ получения белка по п.(23), который включает в себя стадии

культивирования трансформированной клетки, несущей ДНК по п.(14) или вектор, несущий указанную ДНК, и

извлечения полученного в результате экспрессированного белкового продукта из указанной трансформированной клетки или надосадков культуры указанных клеток.

(25) Трансформированная растительная клетка, которая несет ДНК по любому из пп.(14)-(19) или рекомбинантную конструкцию ДНК или вектор, который указан в п.(21).

(26) Трансформированная растительная клетка по п.(25), которую используют для модифицирования роста растительных клеток.

(27) Трансформированная растительная клетка по п.(25), в которой рост растительных клеток модифицирован.

(28) Трансгенное растение, содержащее или несущее трансформированную растительную клетку по любому из пп.(25)-(27).

(29) Трансгенное растение, которое является потомством. потомком или клоном трансгенного растения по п.(28).

(30) Трансгенное растение по п.(28) или (29), в котором рост растительной клетки модифицирован.

(31) Трансгенное растение по п.(28) или (29), которое используют для модифицирования развития и/или дифференцировки особей растений.

(32) Трансгенное растение по п.(28) или (29), в котором развитие и/или дифференцировка особей растений модифицированы.

(33) Пищевая и/или кормовая композиция, которая произведена или получена из растительной клетки по любому из пп.(25)-(27) или растения по любому из пп.(28)-(32).

(34) Химический продукт, который произведен или получен из растительной клетки по п.(25)-(27) или растения по любому из пп.(28)-(32).

(35) Белок, который выделен или получен из растительной клетки по п.(25)-(27) или растения по любому из пп.(28)-(32).

(36) Нуклеиновая кислота, которая выделена или получена из растительной клетки по п.(25)-(27) или растения по любому из пп.(28)-(32).

(37) Транскрипт ДНК, выбранной из ДНК по п.(14) (a)-(e).

(38) Способ количественного анализа транскрипта по п.(37).

(39) Способ осуществления относительного сравнения множества образцов в отношении количеств транскрипта по п.(37).

(40) Способ количественного анализа белка, кодируемого ДНК по п.(14).

(41) Способ осуществления относительного сравнения множества образцов в отношении количеств белка, кодируемого ДНК по п.(14).

Автор настоящего изобретения с соавторами обнаружил, что C-концевая область белка NtmybA2 является частью, ответственной за негативную регуляцию свойств активатора транскрипции, и имеется домен активатора транскрипции, расположенный в середине белка NtmybA2. На основании указанных данных автор настоящего изобретения с соавторами успешно модифицировал функции белка NtmybA2, таким образом обеспечив возможность конструирования и получения мутантов NtmybA2, обладающих повышенной способностью активировать транскрипцию, других мутантов NtmybA2, обладающих пониженной способностью активировать транскрипцию. Таким образом, они достигли успеха в производстве мутантов NtmybA2, которые функционируют доминантно-негативно.

В настоящем изобретении также предлагается следующее:

(42) ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность, принадлежащую молекуле, имеющей потерю функции, вызванную регуляторной областью NtmybA2, для регуляции способности активировать транскрипцию, связанной с белком NtmybA2 SEQ ID NO: 53.

(43) ДНК по п.(42), которая кодирует аминокислотную последовательность молекулы с регуляторной областью потери функции, которая представляет собой часть аминокислот с остатками аминокислот в положениях 705-1042 SEQ ID NO: 53.

(44) ДНК по п.(42), которая кодирует аминокислотную последовательность молекулы с регуляторной областью потери функции, которая представляет собой часть аминокислот с остатками аминокислот в положениях 631-1042 SEQ ID NO: 53.

(45) ДНК по п.(42), которая кодирует аминокислотную последовательность молекулы с регул