Регулирующее дифференцировку средство, содержащее ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента

Регулирующее дифференцировку средство, содержащее ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к средству, регулирующему дифференцировку, содержащему ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента, и к способу скрининга на предмет обнаружения указанного гена.

Предшествующий уровень техники

Стволовые клетки обладают мультипотентностью в плане возможности дифференцировки в клетки тканей различных органов и имеют способность к самообновлению, и они обнаружены у эмбрионов и взрослых. Стволовые клетки обеспечивают дифференцировку клетки в специфическую клетку или орган, так что внимание сфокусировано на возможности применения стволовых клеток для трансплантации органов или клеточной терапии.

Кроветворные стволовые клетки, вид стволовых клеток взрослых, представляют собой клетки, которые могут дифференцироваться в каждый из видов кровеобразующих клеток, например в эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и лимфоциты. Клетки, вовлеченные в иммунную систему, постоянно самообновляются из кроветворных стволовых клеток в костном мозге. Кроветворные стволовые клетки до сих пор использовали для лечения различных заболеваний крови, включая злокачественные опухоли, посредством трансплантации костного мозга. По последним сообщениям, кроветворные стволовые клетки могут дифференцироваться в другие типы клеток, такие как мышечные, нервные, костные, и т.д., в организме экспериментальных животных. Если кроветворные стволовые клетки можно применять в отношении человека, они могут использоваться для лечения различных заболеваний, включая диабет, болезнь Паркинсона, травму спинного мозга и т.д., поскольку они могут успешно заместить другие клетки и органы.

В частности, клетки-природные киллеры (здесь и далее обозначенные как «NK») неспецифично разрушают раковые клетки. Благодаря своей цитотоксичной способности NK-клетки в настоящее время используют для лечения солидной опухоли с использованием LAK (активируемая лимфокинами клетка-киллер) и TIL (инфильтрирующие опухоль лимфоциты) и для иммунотерапии (J Immunol., 1986, 36(10): 3910-3915; Hematologia, 1999, 84: 1110-1149), применяя вливание лимфоцитов донора, что указывает на путь к новой клеточной терапии, направленной на снижение отторжения после транплантации костного мозга или органа. Также сообщали, что дефект в дифференцировке и активации NK-клеток связан с различными заболеваниями, включая рак молочной железы (Breast Cancer Res Treat., 2003, 66(3):255-263), меланому (Melanoma Res., 2003, 13(4):349-356) и рак легких (Lung Cancer, 2002, 35(1):23-18), так что терапия NK-клетками привлекает внимание авторов изобретения в плане лечения указанных заболеваний.

Таким образом, авторы настоящего изобретения идентифицировали новый ген, регулирующий дифференцировку стволовых клеток в NK-клетки, с использованием SAGE (серийного анализа экспрессии генов), и осуществляли данное изобретение, подтверждая то, что дифференцировка NK-клеток регулируется указанным выше геном, и в дальнейшем указанный ген может оказывать большую помощь при лечении заболеваний, включая злокачественные опухоли.

Описание

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является предоставление средства, регулирующего дифференцировку NK-клеток, содержащего ген, который регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, в качестве эффективного ингредиента, и способа скрининга на предмет обнаружения указанного гена с использованием SAGE.

Техническое решение

Для достижения указанной выше цели настоящее изобретение относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры.

Настоящее изобретение также относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в ранние клетки-природные киллеры.

Настоящее изобретение также относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из ранних клеток-природных киллеров в зрелые клетки-природные киллеры.

Настоящее изобретение также относится к противораковому средству, разработанному с использованием регулирующего дифференцировку средства по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу скрининга на предмет гена, регулирующего дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, основанному на SAGE.

Согласно изобретению ген, регулирующий дифференцировку, означает каждый ген, который регулирует дифференцировку их стволовых клеток в клетки-природные киллеры, то есть, такие гены могут ускорять или ингибировать дифференцировку. Более конкретно, регулирующий дифференцировку ген согласно изобретению может ускорять дифференцировку, так что он способствует прогрессу на следующую стадию. Между тем он также может функционировать по поддержанию каждой стадии или ингибируя прогресс на следующую стадию.

Согласно изобретению «SAGE» означает «серийный анализ генной экспрессии». SAGE может выполняться общепринятым способом или по протоколу производителя (Invitrogen^ТМ life technologies) (http://www. invitrogen. com).

Отметка в квадратных скобках после названия гена означает ID GenBank, подразумевающий последовательность каждого гена, и ID GenBank может быть легко найден и применен специалистами в данной области.

Тип II фермента рестрикции, использованный согласно изобретению, представляет собой общепринятый фермент, широко распространенный в области генной инженерии. Он требует присутствия ионов магния для активации и распознавания конкретной нуклеотидной последовательности ДНК, так что он может расщеплять точно в требуемой области или соседней области от распознаваемой нуклеотидной последовательности. Фермент рестрикции типа II S, применяемый согласно изобретению, означает Nlalll (распознает и расщепляет область CATG каждые 250 пар оснований).

Здесь и далее настоящее изобретение описано подробно.

Настоящее изобретение относится к регулирующему дифференцировку средству для клеток-природных киллеров, которое характеризуется тем, что оно содержит в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF154573), пре-про-протеиназы 3 (U97073), онкогена миелобластоза (Myb) (М16449), кислого кератинового комплекса 1, гена 13 (NM_010662), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966), гамма-парвина (ВС011200), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (АК017744), белка c-myc (Х01023), рибосомного белка L10A (АК002613) , гена Oct 2b (Х53654), микролита (АК015601), дигидролипоамиддегидрогеназы (ВС003368), трикла (U81030), лизоцима (ВС002069), цепи Н ферритина (ВС012314), бревикана (Х87096), матриксной металлопротеиназы 12 (ВС019135), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524), S100 кальций-связывающего белка А9 (ВС027635), белка MPS1 (L20315), трансглутаминазы 2 (ВС016492), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639), кДНК RIKEN 5830413L19 (ВС027496), индуцируемого интерфероном белка (ВС003804), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (ВС018577), гликопротеина клеточной поверхности р91 (U83172), аргиназы 1 (ВС050005), рецептора фактора некроза опухолей 1 (М59378), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052), гомолога FLJ11000 (ВС023802), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF110803), канала ионов хлора 7 (АК009435), антигена CD36 (ВС010262), гомолога белка цинковых пальцев (ВС030186), связывающего углевод белка 35 (J03723), кальций-зависимого углевода С-типа (ВС003218), липопротеинлипазы (NM_008509), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (ВС038256), рецептор интерлейкина 7 (NM_008372), рецептора хемокина (С-С) 1 (ВС011092), нейрофиллина (MGDIMGI: 106206) (АК002673), серпина A3G (ХМ-127137), субъединицы 6 рецептора GABA-A (Х51986), LAPTm5 (U51239), регулятора сигнала G-белка (ВС049968), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366), белка Y-бокса 3 (АК019465), предшественника остеопонтина (J04806), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM_009480), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM_146714), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (М12056), ингибитора рака остеокластов (АВ013898), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872), актинсвязывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВС015245), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001) , гамма-цепи Т-клеточного рецептора (X03802), поли-А-полимеразы альфа (NM_011112), родственного ОРА белка-аналога OIP5 (АК017825) и аналога митоген-активируемой протеинкиназы 1 (ВС006708).

Настоящее изобретение также относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из стволовых клеток в ранние клетки-природные киллеры, которое характеризуется тем, что содержит один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из белка гомеобокса MIX (AF154573), пре-про-протеиназы 3 (U97073), онкогена миелобластоза (Myb) (М16449), гена 13 кислого комплекса кератина 1 (NM_010662), родственной РА-фосфатазе фосфоэстеразы (АК002966), гамма-парвина (ВС011200), родственного forkhead фактора транскрипции 1С (AF339105), гена кДНК RIKEN 5730501N20 (АК017744), белка c-myc (Х01023), рибосомного белка L10A (АК002613), гена Oct 2b (X53654), микролита (АК015601), дигидролипоамиддегидрогеназы (ВС003368) и тракла (U81030), в качестве эффективного ингредиента.

Настоящее изобретение далее относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку из ранних клеток-природных киллеров в зрелые клетки-природные киллеры, которое характеризуется тем, что содержит в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из лизоцима (ВС002069), цепи ферритина Н (ВС012314), бревикана (Х87096), матриксной металлопротеиназы 12 (BC019135), клеточного ингибитора EIA-стимулируемого гена (AF084524), S100 кальций-связывающего белка A9 (BC027635), белка MPS1 (L20315), трансглутаминазы 2 (BC016492), сывороточной и регулируемой глюкортикоидами протеинкиназы (AF139639), кДНК RIKEN 5830413L19 (BC027496), индуцируемого интерфероном белка (BC003804), глобулярного мембранного белка молочного жира фактора EGF 8 (BC018577), гликопротеина клеточной поверхности p91 (U83172), аргиназы 1 (BC050005), рецептора фактора некроза опухолей 1 (M59378), индуцируемой ретиноидами сериновой карбоксипептидазы (AF330052), гомолога FLJ11000 (BC023802), предшественника связывающего интерлейкин-18 белка d (AF110803), канала ионов хлора 7 (AK009435), антигена CD36 (BC010262), гомолога белка цинковых пальцев (BC030186), связывающего углевод белка 35 (J03723), кальций-зависимого углевода C-типа (BC003218), липопротеинлипазы (NM_008509), онкогена фибросаркомы двуглавой мышцы плеча v-maf (BC038256), рецептор интерлейкина 7 (NM_008372), рецептора хемокина (C-C) 1 (BC011092) и нейрофиллина (MGD|MGI: 106206).

Настоящее изобретение далее относится к регулирующему дифференцировку средству, которое регулирует дифференцировку зрелых клеток-природных киллеров, которое характеризуется тем, что содержит в качестве эффективного ингредиента один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из серпина A3G (XM_127137), субъединицы 6 рецептора GABA-A (X51986), LAPTm5 (U51239), регулятора сигнала G-белка (BC049968), мРНК стимулирующего приманку фактора, фиксированного на GPI (L41366), белка Y-бокса 3 (AK019465), предшественника остеопонтина (J04806), представителя семейства, связывающего белок-предшественник бета-амилоида (А4) (АК021331), аналога бета-субъединицы Т-клеточного рецептора (U63547), имеющего отношение к иммунитету нуклеотида 1 (ВС005577), фактора транскрипции 1 высокой стадии дифференцировки (NM009480), обонятельного рецептора MOR267-7 (NM_46714), специфичной для лимфоцитов протеинтирозинкиназы (М12056), ингибитора рака остеокластов (АВ013898), гомолога активного рецептора тромбоцитов (ВС024054), белка клеток-природных киллеров 2-А1 (AF106008), неидентифицированного белка MGC36662 (ВС023851), гомолога предшественника семафорина 6А (АК004390), полипептида-гомолога нейрофиламента (ВС025872), актин-связывающего белка-гомолога корнина 2А (ВС026634), белка семейства переносчиков растворимых веществ 6 (ВС015245), гомолога временного рецептора пурина P2Y10 (АК020001), гамма-цепи Т-клеточного рецептора (Х03802), поли-А-полимеразы альфа (NM_011112), родственного ОРА белка-аналога 0IP5 (АК017825) и аналога митоген-активируемой протеинкиназы 1 (ВС006708).

Ген, входящий в состав регулирующего дифференцировку средства согласно изобретению, имеет функции: 1) регуляции дифференцировки из стволовых клеток в ранние NK-клетки, 2) регуляции дифференцировки из ранних NK-клеток в зрелые NK-клетки, и 3) регуляции дифференцировки зрелых NK-клеток, и регулирующий дифференцировку ген, функционирующий на каждой стадии, может независимо применяться в качестве средства, регулирующего дифференцировку из стволовых клеток в NK-клетки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения дифференцировку из стволовых клеток в ранние NK-клетки и в зрелые NK-клетки индуцируют культивированием HSC клеток с обработкой цитокином (фиг.1a - фиг.1c). С каждой стадии выделяли цельную РНК и проводили SAGE, как показано на схематичной диаграмме фиг.2. Посредством SAGE на каждой стадии дифференцировки выделяли гены, характеризовавшиеся специфичным повышением экспрессии (фиг.3a - фиг.3f). Данные гены сравнивали с другими, находящимися в GenBank. В результате данные гены не соответствовали тем, о которых сообщалось, что они имеют функцию регуляции дифференцировки из стволовых клеток в pNK-клетки (см. таблицу 3), из pNK-клеток в mNK-клетки (см. таблицу 4) и mNK-клеток (см. таблицу 5).

Поэтому гены согласно изобретению являются новой находкой, предоставляющей новый механизм дифференцировки, и фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько таких генов, могут использоваться для регуляции дифференцировки клеток. В частности, регулирующее дифференцировку средство, вовлеченное в дифференцировку из стволовых клеток в ранние NK-клетки, могут быть получены с использованием одного или нескольких генов, перечисленных в таблице 3, и также регулирующее дифференцировку средство, вовлеченное в дифференцировку из ранних NK-клеток в зрелые NK-клетки, могут быть получены с использованием одного или нескольких генов, перечисленных в таблице 4. Регулирующее дифференцировку средство, вовлеченное в дифференцировку зрелых NK-клеток, могут быть получены с использованием одного или нескольких генов, перечисленных в таблице 5. Все гены, перечисленные в таблице 3, 4 и 5, имеют функции регуляции дифференцировки из стволовых клеток в NK-клетки, так что регулирующее дифференцировку средство, которые регулирует дифференцировку клеток-природных киллеров, может быть получено с использованием одного или нескольких указанных выше генов.

Средство, регулирующее дифференцировку клеток, согласно изобретению может также использоваться для лечения злокачественных опухолей. Регулирующее дифференцировку средство согласно изобретению, предпочтительно, может использоваться для лечения таких злокачественных опухолей, как рак молочной железы, меланома и рак легких. Дефекты дифференцировки и активации NK-клеток приводят к различным злокачественным опухолям, например, к раку молочной железы (Breast Cancer Res Treat., 2003, 66(3):255-263), меланоме (Melanoma Res., 2003, 13 (4):349-356) и раку легких (Lung Cancer, 2002, 35(1):23-18). Таким образом, указанные злокачественные опухоли можно эффективно лечить путем регуляции дифференцировки NK-клеток регулирующим дифференцировку NK-клеток средством согласно изобретению. Регулирующее клеточную дифференцировку средство согласно изобретению может вводиться орально или парентерально и применяться в основных формах фармацевтического препарата. Регулирующее клеточную дифференцировку средство согласно изобретению может быть подготовлено для орального или парентерального введения путем смешивания с обычно используемыми наполнителями, связующими средствами, увлажняющими средствами, дезинтегрирующими средствами, растворителями, такими как поверхностно-активное вещество, или с наполнителями. Твердые препараты для орального введения представляют собой таблетки, пилюли, порошки, гранулы и капсулы. Данные твердые препараты получают смешиванием с одним или несколькими подходящими наполнителями, такими как крахмал, карбонат кальция, сахароза или лактоза, желатин и т.д. Кроме простых наполнителей, могут использоваться смазки, например стеарат магния, тальк, и т.д. Жидкие препараты для орального введения представляют собой суспензии, растворы, эмульсии и сиропы, и указанные выше препараты могут содержать различные наполнители, такие как увлажняющие средства, подсластители, ароматизаторы, и консерванты в дополнение к обычно применяемым простым растворителям, таким как вода и жидкий парафин. Препараты для парентерально введения представляют собой стерилизованные водные растворы, нерастворимые в воде наполнители, суспензии, эмульсии и суппозитории. Нерастворимые в воде наполнители и суспензии могут содержать, в дополнение к активному соединению или соединениям, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растворимое масло, такое как оливковое масло, сложный эфир для инъекций, такой как этилолат, и т.д. Суппозитории могут содержать, в дополнение к активному соединению или соединениям, witepsol, macrogol, tween 61, масло какао, лауриновое масло, глицерин, желатин, и т.д.

Эффективная дозировка средства согласно изобретению составляет 0,1-0,2 мг/кг, и предпочтительно 0,15 мг/кг. Время введения средства согласно изобретению может представлять собой от одного до трех раз в сутки.

Настоящее изобретение также относится к способу скрининга на предмет гена, регулирующего дифференцировку из стволовых клеток в клетки-природные киллеры, включающего следующие стадии:

1) синтеза кДНК после выделения из клеток цельной РНК;

2) выделения метки после расщепления кДНК стадии 1;

3) связывания каждой метки, выделенной на стадии 2, и последующего анализа ее нуклеотидной последовательности; и

4) количественного анализа экспрессии гена, основанного на проанализированной выше последовательности нуклеотидов, с использованием программы анализа SAGE.

На стадии 1 клетки предпочтительно отбирают с каждой стадии дифференцировки из стволовых клеток в клетки-природные киллеры. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кроветворные стволовые клетки (HSC) применяют в качестве стволовых клеток, и ранние клетки-природные киллеры и зрелые клетки-природные киллеры применяли в качестве клеток-природных киллеров.

Может использоваться любой общепринятый способ, если только с его помощью можно выделить цельную РНК из образца с высоким выходом и с предотвращением контаминации РНКазами (Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning). В общем, для выделения РНК с использованием средства выделения РНК проще всего следовать протоколу производителя. Для синтеза кДНК с цельной РНК к цельной РНК присоединяют олиго-dT-праймер, но это не единственный способ синтеза кДНК, и может использоваться любой другой способ синтеза кДНК. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения олиго-dT-праймер присоединяют к цельной РНК для синтеза кДНК, и в то же время олиго-dT-праймер должен встроить поли-A-последовательность для синтеза мРНК. Предпочтительно, чтобы в олиго-dT-праймере повторялись последовательности из 20-30 T. И также допустимо, что к одному из концов олиго-dT-праймера присоединялись магнитные гранулы, поскольку так метка может успешно выделяться без контаминации с использованием магнитных гранул.

На стадии 2 процесс отделения метки после расщепления кДНК состоит из следующих стадий:

a) получения метки путем расщепления кДНК ферментом рестрикции типа IIS 1;

b) соединения двух видов адаптеров, каждый из которых включает в себя участок распознавания фермента рестрикции типа IIS 1, в одном конечном участке связывания метки, полученной на стадии a;

c) выделения метки путем отщепления метки, связанной с адаптером на стадии b посредством фермента рестрикции типа IIS 2, и отщепления магнитных гранул с олиго-dT от метки;

d) получения двойной метки путем соединения друг с другом меток, полученных на стадии c; и

e) получения только двойной метки путем расщепления двойной метки, полученной на стадии d, ферментом рестрикции типа IIS 1 и отщепления адаптера.

На стадии a синтезированную кДНК расщепляли ферментом рестрикции типа IIS 1 по той причине, что участок расщепления данным ферментом, мог быть получен в виде участка связывания метки, и фактически было легко применять данную область для связывания с меткой, поскольку участок расщепления образовывал 5'-концевые свисания. В качестве фермента рестрикции типа IIS 1 возможно применение любого подходящего фермента, и предпочтителен фермент рестрикции NlaIII. Причиной для этого является то, что кДНК имеет участки распознавания ферментом рестрикции NlaIII каждые 250 п.н., так что регулярно расположенная метка может быть легко получена расщеплением кДНК данным ферментом.

На стадии b два вида адаптеров, подлежащие соединению с участком расщепления метки, имеют последовательности длиной примерно 40 п.н., которые комплементарно связанных друг с другом. Адаптеры включают в себя участок распознавания ферментом рестрикции NlaIII (CATG) с одного конца, с которым связана метка и образуют свисания, которые упрощают связывание метки.

На стадии c метку, связанную с адаптером, расщепляли ферментом рестрикции типа IIS 2. Фермент рестрикции типа IIS 2 связан с участком фермента рестрикции адаптера для расщепления области, расположенной в 10-14 п.н. ниже участка расщепления фермента рестрикции, что приводило к отделению метки длиной примерно 50 п.н., содержащей конец размером 4 п.н., свисающий с 5′-конца. В качестве фермента рестрикции типа IIS 2 предпочтительно применяли BsmFI.

На стадии d метки соединяли друг с другом с образованием двойной метки. Точнее, образовывали свисающий конец на каждом 5'-конце меток, так что двойная метка могла легко образоваться соединением данных концов. Полученная в результате двойная метка составляла примерно 100 п.н. в длину.

На стадии e двойную метку расщепляли ферментом рестрикции типа IIS 1 для отщепления адаптера, что приводило только к образованию чистой двойной метки. Точнее, область связывания, в которой соединялись конец метки и адаптер, содержала участок распознавания фермента рестрикции типа IIS, так что адаптер мог отщепляться с использованием фермента рестрикции типа IIS 1. В результате получали чистую двойную метку длиной примерно 26 п.н.

Между тем на стадии 3, 10-20 фрагментов-меток, полученных на стадии 2, связывали, и исследовали их нуклеотидную последовательность. И процесс исследования состоял из следующих стадий:

a) клонирование двойной метки типа конкатемера, полученной путем связывания двойных меток, полученных на стадии 2, в вектор; и

b) исследование нуклеотидной последовательности метки вектора, использованного для клонирования на стадии a.

На стадии a двойные метки связывали с образованием конкатемера. Точнее, оба конца двойной метки включали в себя участок распознавания ферментом рестрикции типа IIS 1, что указывало на возможность образования свисания. Такие двойные метки могут легко связываться, и так примерно 20-50 меток соединяли с образованием конкатемера. Полученную метку типа конкатемера встраивали в обычный вектор для клонирования с целью исследования нуклеотидной ее последовательности. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для клонирования применяли вектор pZerO-1. Указанный экспрессирующий вектор включен в набор (Invitrogen Life Science), предоставленный для анализа SAGE, и он очень удобен.

На стадии 4 экспрессию подвергали количественному анализу, полученному путем исследования нуклеотидной последовательности, полученной выше, посредством программы анализа SAGE. Точнее, полученную нуклеотидную последовательность сравнивали с другими последовательностями генов, которые находятся в GenBank, для их идентификации. Затем программу анализа SAGE использовали для классификации последовательностей с высоким уровнем экспрессии и с низким уровнем экспрессии. Их отмечали красным, желтым, зеленым и синим цветом после кластеризации, что ясно показывало уровень экспрессии. И уровень экспрессии может оцениваться численным значением. Программа анализа SAGE может предоставляться компанией или являться одной из программ, предоставляемых через Интернет.Согласно изобретению применяли обычную программу (компьютерная программа кластеризации и построения «деревьев», http://rana.lbl.gov), широко используемую для кластеризации результатов SAGE.

Способ скрининга согласно изобретению основан на анализе SAGE. Каждую стадию способа проводили, отдавая предпочтение обычному анализу SAGE, или ее могли проводить модифицированными способами по инструкции производителя. План способа согласно изобретению показан на схематической диаграмме фиг.2.

Описание фигур

На фиг.1a - фиг.1c показано сравнение экспрессии поверхностных молекул в процессе дифференцировки из кроветворных стволовых клеток мыши (HSC) через ранние NK-клетки (pNK) в зрелые NK-клетки (mNK) в присутствии (+OP9) или в отсутствие (-OP9) интерстициальных клеток OP9.

Фиг.1a представляет собой набор графиков, на которых показана чистота клеток на каждой стадии дифференцировки NK-клеток, что представлено двумя разными цветами и определено путем проточной цитометрии. Числа в каждом квадранте указывают на процент соответствующих клеток.

Lin-c-kit+:(96%), CD122+NK1.1-: (95%),

CD122+NK1.1+: (94%, 95% соответственно)

Фиг.1b представляет собой набор графиков, на которых показана экспрессия связанных с NK-клетками поверхностных маркеров (NK1.1, DX5, CD94, NKG2A), индуцированных во время дифференцировки из ранних NK-клеток в зрелые NK-клетки, причем в культуру добавляли интерстициальные клетки OP9.

Фиг.1c представляет собой набор фотографий, на которых показаны результаты ОТ-ПЦР. Цельную цитоплазматическую РНК выделяли из клеток на каждой стадии дифференцировки NK-клеток для исследования того, экспрессировались ли CD122, представительно связанных с NK-клетками генов, и перфорин.

Фиг.2 представляет собой схематичную диаграмму, на которой показан процесс SAGE для выявления регулирующего дифференцировку гена согласно изобретению.

На фиг.3a - фиг.3f показана кластеризация профиля генной экспрессии, полученного во время дифференцировки NK-клеток, путем анализа SAGE.

На фиг.3a показана группа генов, наиболее экспрессированных в HSC-клетках, фиг.3b представляет группу генов, наиболее экспрессированных в pNK-клетках, на фиг.3c показана группа генов, наиболее экспрессированных в mNK(-OP9)-клетках, и фиг.3d представляет группу генов, наиболее экспрессированных в mNK(+OP9)-клетках.

На фиг.3e показаны гены, ингибирующие активацию NK-клеток, и на фиг.3f показаны гены, способствующие активации NK-клеток.

На описанных выше фиг.3a - фиг.3f в кластеризации, основанной на анализе SAGE, когда частота кластера превышала 80, его маркировали красным, когда частота составляла 50-79, его маркировали желтым, когда частота составляла 30-49, его маркировали зеленым, а когда частота была ниже 29, его маркировали синим.

На фиг.4a - фиг.4d показаны результаты ОТ-ПЦР для исследования того, действительно ли экспрессируется ген, который, по данным SAGE, регулировал дифференцировку NK-клеток. Экспрессию подвергали количественному анализу по сравнению с контрольным геном бета-актина.

На фиг.4a показаны гены, специфично экспрессированные в HSC-клетках во время дифференцировки NK-клеток, фиг.4b представляет гены, специфично экспрессированные в pNK-клетках, на фиг.4c показаны гены, специфично экспрессированные в mNK-клетках, и на фиг.4d показано, как NK-клетки обрабатывали LPL в разных концентрациях (250 нг/мл и 500 нг/мл) для исследования эффекта LPL на дифференцировку NK-клеток, и в результате обеспечивалась дифференцировка в mNK-клетки.

Способ изобретения

Практические и предпочтительные в настоящее время варианты осуществления настоящего изобретения иллюстрируются следующими примерами.

Однако, понятно, что специалисты в данной области при рассмотрении данного описания могут сделать модификации и улучшения по сущности и в объеме настоящего изобретения.

Пример 1. Выделение стволовых клеток из костного мозга

Все кости, включая большеберцовые и бедренные кости, мыши C57BL/6 (Dae Han Biolink), в возрасте 6-9 недель, пульверизовали. Пульверизованные кусочки пропускали через 70-микронный клеточный фильтр, и эритроциты удаляли обработкой раствором для лизиса (Sigma, St.Louse, Миссури) для получения одних клеток костного мозга. Клетки костного мозга взаимодействовали с антителами-маркерами, меченными биотином, на предмет системных маркеров (CD11b: маркер макрофагов, Gr-1: маркер гранулоцитов, B220: маркер B-клеток, NK1.1: маркер NK-клеток, CD2: маркер T-клеток, TER-119: маркер эритроцитов), с последующей промывкой. Затем клетки взаимодействовали с меченными стрептавидином магнитными гранулами (Miltenyi Biotec, Auburn, Калифорния). Магнитно-меченные клетки Lin+выделяли пропусканием через колонку CS (Miltenyi Biotec) в магнитном поле MACS (Miltenyi Biotec). Остальные Lin-, пропущенные через колонку, взаимодействовали с магнитными гранулами, связанными с c-kit, и затем их пропускали через колонку MACS (Miltenyi Biotec), что приводило к задержке c-kit+клеток на колонке. Чистоту полученных Lin- c-kit+кроветворных стволовых клеток (обозначенных здесь и далее как "HSC-клетки") измеряли путем FACS (BD Bioscience, Mountainview, Калифорния). В результате подтверждали, что клетки характеризовались чистотой свыше 96%.

Пример 2. Индукция дифференцировки из стволовых клеток в NK-клетки

HSC-клетки, выделенные из костного мозга в примере 1, в полной среде RPMI, дополненной мышиным SCF (30 нг/мл, BioSource, Camarillo, Калифорния), мышиным Flt3L (50 нг/мл, PeproTech, Rocky Hill, Нью-Джерси), мышиным IL-7 (0,5 нг/мл, PeproTech), индометацином (2 мкг/мл, Sigma), гентамицином (20 мкг/мл) и 10% фетальной сывороткой теленка, инокулировали в 6-луночный планшет (Falcon) в концентрации 2×10⁶ клеток/лунку. Клетки культивировали при 37°C, 5% CO₂ в инкубаторе в течение 6 суток. После 3 суток культивирования половину надосадочной жидкости отбрасывали и добавляли свежую среду, дополненную цитокинами в той же композиции, как указано выше. Через 6 суток CD122+ранние NK-клетки (обозначенные здесь и далее как "pNK-клетки") отделяли посредством MACS с использованием меченного FITC антитела против CD122 и магнитных гранул, конъюгированных с антителом против FITC. Чистоту ранних NK-клеток измеряли путем FACS и в результате подтверждали, что клетки имели чистоту свыше 92%.

Для индукции дифференцировки в зрелые NK-клетки (обозначенные здесь и далее как mNK-клетки), HSC-клетки получали через 6 суток из культуры и затем культивировали их отдельно или со стромальными клетками OP9 (Science 1994, 265 (5175):1098-1101; Nakano T, Kodama H, Honjo T.: Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture) в присутствии мышиного IL-15 (20 нг/мл, PeproTech). Через 3 суток половину среды заменяли свежей с той же композицией. На 12 сутки NK1.1+клетки отделяли с использованием меченного FITC антитела против NK1.1 и магнитных гранул, конъюгированных с антителом против FITC. Зрелые NK-клетки исследовали путем проточной цитометрии с использованием антител против CD122, NK1.1, DX5 и антител против NK-клеточного рецептора.

Пример 3. Исследование фенотипа очищенных NK-клеток, специфичного в отношении стадий дифференцировки

Для сбора специфичных NK-клеток с каждой стадии дифференцировки Lin-c-kit+HSC (>95%) клетки, выделенные из костного мозга мыши, культивировали в присутствии SCF, Fit-3L и IL-7 в течение 6 суток. Затем CD122+pNK-клетки выделяли и анализировали путем проточной цитометрии. В случае mNK-клеток (-OP9 или+OP9) IL-15 клетки культивировали отдельно или со стромальными клетками OP9 в течение еще одних 6 суток. Полученные клетки анализировали путем проточной цитометрии (фиг.1a). Когда клетки культивировали вместе со стромальными клетками OP9, число mNK-клеток повышалось (-OP9; 94% и+OP9;>95%). Рецепторы Ly49 на поверхности mNK-клеток играют важную роль в функционировании mNK-клеток, и их экспрессия регулируется путем трансдукции сигнала за счет коммуникации с другими иммунными клетками. Для подтверждения того, является ли совместное культивирование HSC-клеток, происходящих из костного мозга и стромальных клеток, существенным для экспрессии Ly49-рецепторов mNK-клеток, mNK-клетки культивировали отдельно или вместе с клетками OP9 в присутствии IL-15 и затем исследовали экспрессию Ly49 (фиг.1b). Когда клетки культивировали вместе с клетками ОР9 (+OP9), в mNK-клетках экспрессировались Ly49C/I и Ly49G2. С другой стороны, когда клетки культивировали независимо (-OP9), ни Ly49C/I, ни Ly49G2 не экспрессировались. Данные результаты показывают, что совместное культивирование HSC-клеток и OP9-клеток существенно для созревания NK-клеток. После исследования экспрессии генов CD122 и перфорина по стадиям дифференцировки NK-клеток доказывали, что HSC-клетки созревали в NK-клетки во время дифференцировки (фиг.1c).

Пример 3. SAGE (серийный анализ генной экспрессии)

Цельную РНК выделяли из HSC-клеток, полученных в примере 2 и из NK-клеток, специфичных для стадий дифференцировки (pNK и mNK). мРНК выделяли и очищали из 5 мкг цельной РНК с использованием магнитных гранул (dT)25 (Dynal A.S., Осло, Норвегия). мРНК, выделенную и очищенную олиго-dT-гранулами, использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК посредством набора для синтеза кДНК (Invitrogen, Life Technologies) с использованием олиго-(dT)-праймера, который был 5′-биотинилирован и связан с 3′-конца. По инструкциям производителя (Invitrogen, Life Technologies) метку для SAGE получали из кДНК способом, который объясняется на схематической диаграмме фиг.2. кДНК расщепляли ферментом рестрикции NIaIII и 3′-область связывали с магнитными гранулами (Dynal), покрытыми стрептавидином. Метку разделяли на две фракции, которые связывали с линкерами (Invitrogen, Life Technologies), имеющими участок распознавании NIaIII, соответственно. Связывающуюся с линкером метку расщепляли BsmFI. Выделенную метку и линкер обрабатывали ДНК-полимеразой Pfu для получения тупого конца. Тупые концы связывали вместе с образованием двойной метки. Проводили ПЦР для амплификации двойной метки с использованием меченного биотином праймера для SAGE (Invitrogen, Life Technologies). Затем двойную метку расщепляли NIaIII для отделения от линкера. Ее обрабатывали ДНК-лигазой T4 с образованием конкатемера.

Полученный конкатемер клонировали в предварительно расщепленный SphI вектор pZero-1 (Invitrogen, Carlsbad, Калифорния) (фиг.2). Затем продукт клонирования амплифицировали путем ПЦР с использованием прямого праймера M13, представленного SEQ ID NO:1, и обратного праймера M13, представленного SEQ ID NO:2. Амплифицированную позитивную колонию собирали и затем последовательность исследовали с использованием набора для секвенирования (набор для секвенирования Big-Dye) и нуклеотидного секвенатора (секвенатор ABI377, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Branchburg, Нью-Джерси). Последовательность метки идентифицировали посредством программного обеспечения SAGE 300.

Пример 4. Анализ данных SAGE

4-1. Биоинформационный анализ

Базу данных сравнения SAGE-меток получали из мышиной базы данных UniGene, содержащей большую часть последовательностей, экспрессированных в мыши, которую подавали в GenBank. Метку SAGE определяли по (i) направлению каждого транскрипта, (ii) наличию или отсутствию поли(A)-сигнала (AATAAA или ATTAAA), (iii) наличию или отсутствию поли-A-хвоста, и (iv) наличию или отсутствию последнего участка расщепления CATG в последовательности. Все метки SAGE, полученные из последовательностей сравнения, использовали для конструирования базы данных сравнения SAGE. Экспериментальная метка SAGE совпадала с базой данных сравнения SAGE (http://www.hpc1.cs. uchicago. edu/gist). Для идентификации гена, соответствующего каждой метке SAGE, использовали компьютерную программу SAGEmap (Lash A. E et al., 2000).

4-2. Анализ кластеров согласно количественному распределению профиля SAGE

Компьютерную программу кластеризации (компьютерная программа кластеризации и визуализации деревьев, http://rana.lbl.gov) использовали для исследования кластеризации данных SAGE, полученных в примере 4-1, основываясь на других профилях экспрессии и функциональных профилях, показанных во время процессов дифференцировки NK-клеток. Коротко, на каждой стадии различными цветами, такими как синий, зеленый, желтый и красный, метки маркировали по частоте (скрипт PERL доступен по запросу). Среднюю точку включали в соответствующее значение RGB. По данным цветным рез