Способ подбора реципиента для осуществления трансдукции bacillus anthracis и близкородственных бацилл

Способ подбора реципиента для осуществления трансдукции bacillus anthracis и близкородственных бацилл

Реферат

Изобретение относится к микробиологии и генетике бактерий, в частности к способам трансдукции возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл.

На территории Российской Федерации, в странах ближнего и дальнего зарубежья находится значительное количество неблагополучных по сибирской язве регионов (10). В России ежегодно регистрируются случаи заболевания людей и животных сибирской язвой и, соответственно, выявляются очаги с различной эпидемиологической и эпизоотологической активностью (2). Особую актуальность возбудитель сибирской язвы приобрел после использования спор B.anthracis в качестве орудия биологического терроризма (3).

До настоящего времени не уделялось должного внимания изменчивости сибиреязвенного микроба, что затрудняло его индикацию и идентификацию. Особо остро этот вопрос стоит в контексте возможных изменений генетических свойств B.anthracis, когда спонтанные генетические процессы у B.anthracis и у близкородственных бацилл происходят в природных условиях (4).

Бактериофаги и плазмиды - классические векторы, осуществляющие горизонтальное распространение генов среди бактерий (5). Бактериофаги способны вносить в клетки бактерий генетический материал, изменяющий свойства хозяина и стабильно сохраняющийся в геноме в тех случаях, когда эти изменения для него полезны. Такой перенос генов от одних бактерий к другим с помощью бактериофага и есть трансдукция. Плазмидная трансдукция, т.е. процедура введения плазмид в новых хозяев, являющаяся ценным инструментом в изучении многих микроорганизмов, среди бациллярных видов впервые показана у Bacillus pumilis (6).

Разработка межвидовой трансдукции плазмид и хромосомных генов между B.anthracis, B.cereus и B.thuringiensis наиболее полно описана американскими экспериментаторами (7). Как свидетельствуют результаты опытов этих авторов, частота плазмидной трансдукции в значительной степени зависит от множественности инфекции (MOI), т.е. от соотношения в трансдуцирующей системе фаг - реципиентная клетка.

При большой множественности фага, адсорбировавшегося на реципиентных клетках, происходит гибель клеток в трансдуцирующей системе и достичь удовлетворительного выхода трансдуктантов невозможно (фиг.1).

В своих экспериментах (9, 10) мы убедились в этой закономерности.

Трансдукция, в которой соотношение фаг:клетка были 1:1, давала наиболее высокую частоту трансдукции.

С другой стороны, бактериальная клетка-хозяин (реципиент) в трансдуцирующей системе может обладать очень высокой эндонуклеазной (рестриктазной) активностью по отношению к ДНК трансдуцирующего фага (профага) и тогда большая часть нуклеинового материала трансдуцирующих частиц в реципиентных клетках трансдуцирующей системы будет разрушена.

Иногда в результате одного цикла размножения на определенном хозяине появляется потомство фага с измененным спектром литического действия. Это так называемые фенотипические модификации, или модификации, вызванные хозяином. Они коренным образом отличаются от мутационных изменений того же признака. Такая модификация определяется клеткой, в которой вирус размножается, и не является наследственной: при выращивании фага на каком-либо другом хозяине модификация утрачивается.

Впервые хозяин-контролирующая модификация была описана Луриа (11), и несколько позже примеры систем фаг - хозяин, в которых обнаруживается модификация, вызванная хозяином, описана Бертани и Уэйглом (12).

Опыты Арбера и Дюсуа (13, 14), в которых использовался фаг λ, а в качестве бактерий-хозяев - E.coli К 12 и E.coli (P1), пролили некоторый свет на молекулярную основу этого интересного явления.

Модификации, вызываемые хозяином, имеют два аспекта. Первый - это природа процесса, в результате которого инфицирующие геномы принимаются или отвергаются, а второй - механизм модификации тех геномов, которые были акцептированы. Оказалось, что в случаях, когда «ограниченные» частицы фага λ заражают хозяина, лизогенного по фагу P1, инъецируемая ДНК фага быстро распадается и продукты ее разрушения диффундируют в среду. При смешанном заражении «ограниченным» и «неограниченным» (модифицированным) фагом некоторые из маркеров «ограниченного» фага, в том числе и пары тесно сцепленных маркеров, могут быть «спасены» путем включения в рекомбинантные геномы, имеющие, в основном, модифицированный (метилированный) тип (14).

Некоторые бактериальные штаммы не оказывают на ДНК фага рестрицирующего и модифицирующего действия. Они называются штаммами типа О. Примером может служить E.coli С по отношению к фагу λ; другие аналогичные бактерии (мутанты по генам r^-, m^-), дефектные в отношении рестрикции и модификации (15).

У бактериальных штаммов может происходить один, два или больше видов, рестрикции и модификации. Ответственные за это гены могут быть локализованы в бактериальной хромосоме, либо в плазмидах или в лизогенизирующем профаге, иногда рестрикция и модификация детерминируется фактором устойчивости к лекарственным препаратам (фактором N3) (15).

Ларк и Арбер (19) обнаружили распад ДНК в бактериях, имеющих эндонуклеазы рестрикции, специфичные для профага Р1, плазмиды 15 и фактора устойчивости к лекарственным препаратам N3.

Штаммоспецифическая модификация (метилирование) защищает внутриклеточную ДНК фага от деградации при эндонуклеазной рестрикции. Специфичность хозяина можно рассматривать как систему иммунитета, направленную против немодифицированного генетического материала.

Метилирование ДНК происходит на полинуклеотидном уровне (16) и катализируется специфическими ферментами ДНК - метилазами (метилтрансферазами). Во всех клеточных организмах источником метильных групп служит метионин; реакция проходит через образование в качестве промежуточного соединения S-аденозил - L-метионина, обладающего высокой свободной энергией гидролиза (17). Арбер (18) индуцировал нуждающуюся в метионине и лизогенный по фагу λ штамм в среде без метионина и добавлял недостающую аминокислоту на поздних стадиях латентного периода. Значительная часть фаговых частиц, образовавшихся вначале, была немодифицированной. Поскольку при исключении из среды любой другой аминокислоты такого эффекта не наблюдалось, Арбер заключил, что в модификации ключевую роль играет метионин (18).

В отличие от эндонуклеаз рестрикции у некоторых родственных штаммов E.coli фермент рестрикции, детерменированный генами фактора устойчивости к лекарственным препаратам N3, не нуждается в S-аденозилметионине (20, 21), как не нуждается в нем эндонуклеаза Hemophilus influenzae, свойства которой сходны со свойствами ранее изученных ферментов рестрикции (22). Следовательно, механизм действия этих ферментов может и не включать метилирование.

Таким образом, рестрикция и модификация ДНК фагов являются координированными функциями. Рестрикция осуществляется эндонуклеазой, которая разрезает ДНК в специфичных участках при условии, что ДНК не модифицирована. Модификация осуществляется метилирующим ферментом, который действует на тот же участок, что и фермент рестрикции. Для рестрикции и модификации, вероятно, необходим уникальный участок. Эти участки располагаются на молекуле ДНК многократно и, по-видимому, случайно.

Бактериальные штаммы, способные к активной рестрикции ДНК фагов, не пригодны в качестве реципиентов в трансдуцирующей системе, но, по-видимому, получают преимущество в природе из-за довольно эффективного иммунитета к чужому генетическому материалу.

Изучение феномена хозяина контролирующей модификации у донорной и реципиентной культур бацилл в трансдуцирующей системе открывает новый путь к подбору реципиента для оптимального осуществления трансдукции в экспериментах.

Донор для трансдуцирующей системы обычно подбирается по надежному селективному маркеру (фенотическому свойству - чаще всего по свойству антибиотикорезистентности), а реципиент должен обладать достаточно модифицирующим свойством к ДНК трансдуцирующего фага, размноженного (репродуцированного) на штамме доноре.

Наиболее близким к трансдукции рекомбинационным процессом, обусловленным судьбой с ДНК фага в реципиентной клетке, является процесс трансфекции, т.е. трансформации посредством ДНК профагов (23).

Обычно опыты с трансфекцией ставят на штаммах бактерий, чувствительных к инфекции фагом (24), из которого выделяется трансфецирующая ДНК. Однако могут быть и другие ситуации. Известно существование фагоустойчивых мутантов с нарушением способности адсорбировать фаговые частицы, у которых трансфекция, однако, возможна (25). Это объясняется совершенно разными механизмами адсорбции частиц фага и поглощения фаговой ДНК при трансфекции. При трансформации и трансфекции реципиент должен, прежде всего, быть способным адсорбировать и поглощать ДНК донора, т.е. быть «компетентным» (26). Штамм P.pseudomallei СВБК 141 Pur^- - универсальный реципиент для генетической идентификации микроорганизмов, используемый при трансформации (Авт. свид. №1131902 - 1983. Бюлл. №48, 1984), - наиболее подходящий прототип нашему предложению, но при трансдукции другие критерии оценки реципиента. Реципиент должен обладать способностью адсорбировать трансдуцирующий фаг, т.е. у клеток донорных бацилл, на которых репродуцируется (размножается) фаг, и у клеток реципиента должны быть одинаковые рецепторы адсорбции фага, кроме того, у донора и реципиента должен быть совпадающий спектр эндонуклеаз (рестриктаз), участвующих в рестрикции и модификации (метилировании) ДНК трансдуцирующего фага.

Целью настоящей разработки является подбор оптимальных реципиентов для осуществления трансдукции из имеющейся коллекции штаммов B.anthracis и близкородственных бацилл.

Поставленная цель достигается решением следующих задач:

- подбор трансдуцирующего фага;

- подбор донора с соответствующими маркерами;

- определение концентрации фага, размноженного на штамме-доноре и различных штаммах бацилл будущих (перспективных-неперспективных) реципиентов;

- определение эффективности посева трансдуцирующего фага, размноженного на штамме-доноре и штаммах будущих реципиентов;

- проверка качества реципиента при постановке внутривидовой и межвидовой трансдукции.

В экспериментах по трансдукции нами был использован фаг «Бф»-производный аналог трансдуцирующего фага СР-51 из набора коллекции Торне (27). Трансдуцирующий фаг «Бф» селекционирован нами и отличается от фага СР-51 тем, что он может храниться в холодильнике (при +4°С) в течение 1-2 лет и для его репродукции не нужна индуция ультрафиолетом.

Эффективность посева (28) - титр фагового препарата, определяемый путем посева на плотную питательную среду при установленных условиях, выражается отношением числа стерильных пятен, развившихся в стандартных (оптимальных) условиях, к числу пятен, развившихся в данных конкретных условиях. Обычно эффективность посева фагов лежит при оптимальных условиях в пределах 0,5-1,0 (29, 30, 31).

У большинства родственных между собой микроорганизмов, способных к рекомбинационному процессу внутри вида, возможна и межвидовая рекомбинация (трансформация) (24, 32). Однако частота ее, как правило, гораздо меньше внутривидовой. Это объясняется, главным образом, неполной гомологией между участками ДНК донора и реципиента, что ведет к пониженной частоте рекомбинации. Для успешной рекомбинации обязательна гомология не только того участка, который нужно заменить, чтобы изменился изучаемый признак, но и близлежащих областей хромосомы. Кроме того, возможно, что известную роль в снижении частоты межвидовой трансформации, играют, в некоторых случаях, системы рестрикции - модификации (24).

Однако, при трансдукции межвидовой рекомбинационный процесс иногда по частоте превосходит внутривидовой.

Это обусловлено отсутствием рестрикции ДНК трансдукцирующего фага и возможной активной модифицирующей (метилирующей) активностью эндонуклеаз гетерологичного штамма бацилл. (См.табл.Примера №1, где эффективность посева фага Бф/B.anthracis Davies (рВС16)Tet^R на B.thuringiensis V.g. больше 1). В то же время, несмотря на то, что фаг «Бф» (СР-51) выделен из почвенного микроорганизма Bacillus cereus (33), эффективность посева фага «Бф» (рВС16) на штаммах В.cereus из коллекционных центров АТСС и NRRL набора Торне (табл. Примера №1) значительно меньше 0,5, и в реципиенты для трансдукции не годятся.

Поставленная цель достигается тем, что на первоначальном этапе определяется эффективность посева трансдуцирующего фага, размноженного на штамме-доноре и штаммах будущих реципиентов, при этом эффективность посева считается оптимальной в пределах 0,5-1,0, после чего осуществляют проверку качества реципиента при постановке внутривидовой и межвидовой трансдукции: к 1 мл реципиентных культур B.anthracis, B.thuringiensis и В.cereus с различной характеристикой эффективности посева трансдуцирующего фага добавляют 1 мл трансдуцирующего фага различной концентрации, а контроль - 1 мл реципиентной культуры смешивают с 1 мл фагового буфера и инкубируют 20 мин при 33°С в шейкере при 100 кач. обр./мин, затем во все опытные и контрольные пробы вносится по 1 мл препарата клеточных рецепторов соответствующих реципиентов и вновь инкубируют 30 мин при 33°С, после чего в каждую пробу трансдуцирующей смеси вносят еще по 1 мл соответствующих рецепторов и высевают по 0,2 мл из опытной и контрольной пробы на селективные (с тетрациклином 20 мкг/мл) среды Хоттингера (по 3 чашки на пробу), выросшие Tet^R колонии-трансдуктанты учитывают через 48-72 часа инкубации посевов при 35°С и реципиент считается оптимальным для трансдукции, если эффективность посева трансдуцирующего фага равна 0,5-1,0 (отношение показателя концентрации трансдуцирующего фага, полученного на штамме-доноре, к показателю концентрации, полученной на подбираемом штамме-реципиенте.

Для этого способ включает следующие этапы определения чувствительности донора и реципиента к трансдуцирующему фагу:

- определение эффективности посева трансдуцирующего фага, размноженного на штамме-доноре и штаммах будущих реципиентов, при этом эффективность посева считается оптимальной в пределах 0,5-1,0;

- проверяют качество реципиента при постановке внутривидовой и межвидовой трансдукции путем добавления 1 мл трансдуцирующего фага различной концентрации к 1 мл реципиентных культур B.anthracis, B.thuringiensis и B.cereus с различной характеристикой эффективности посева трансдуцирующего фага, а контроль - 1 мл реципиентной культуры смешивают с 1 мл фагового буфера и инкубируют 20 мин при 33°С в шейкере при 100 кач. обр./мин, затем во все опытные и контрольные пробы вносится по 1 мл препарата клеточных рецепторов соответствующих реципиентов и вновь инкубируют 30 мин при 33°С, после чего в каждую пробу трансдуцирующей смеси вносят еще по 1 мл соответствующих рецепторов и высевают по 0,2 мл из опытной и контрольной пробы на селективные (с тетрациклином 20 мкг/мл) среды Хоттингера (по 3 чашки на пробу), выросшие Tet^R колонии-трансдуктанты учитывают через 48-72 часа инкубации посевов при 35°С,

- реципиента считают оптимальным для трансдукции, если эффективность посева трансдуцирующего фага равна 0,5-1,0 (отношение показателя концентрации трансдуцирующего фага, полученного на штамме-доноре, к показателю концентрации, полученной на подбираемом штамме-реципиенте.

Пример №1. Эффективность посева фага Бф/B.anthracis Davies (рВC16)Tet^R на различных штаммах бацилл. Изучена способность модификации ДНК трансдуцирующего фага «Бф», размноженного (репродуцированного) на донорных клетках B.anthracis Davies (рВС16)Tet^R. Для этого определялась концентрация фага Бф (рВС16) двухслойным методом по Грациа (28) на клетках штамма-донора и с B.anthracis, B.cereus и B.thuringiensis. Затем при сравнении концентраций бактериофага «Бф» (рВС16), полученных на различных штаммах бацилл, определяли эффективность посева фага (см. табл.1).

Пример №2. Проверка качества реципиента при постановке внутривидовой и межвидовой трансдукции.

Внутривидовую и межвидовую трансдукцию осуществляли на различных реципиентах модифицированным нами способом (37) с помощью препарата рецепторов реципиентных клеток.

Материал: 1) B.anthracis Davies (рВС16) STc^R - донор рВС16 (Тс^R);

2) B.anthracis СТИ-1 тб Tc⁹ - реципиент Э.п. - 0,5;

3) B.anthracis 81/1 TR Tc⁹ - реципиент Э.п. - 0,2-0,4;

4) B.thuringiensis Var. thuringiensis Pasteur - реципиент Э.п. - 0,5-0,8;

5) B.cereus ATCC6464 cured of CP53 - реципиент Э.п.-≈0,01.

6) Фаг Бф/Д. (рВС16) с концентрацией 1,2·10⁹ ф.ч./мл.

7) Препараты рецепторов к фагу из реципиентных клеток 2); 3); 4); 5).

8) Фаговый буфер SM (pH-7,2) по Маниатису (38).

Методика: По 1 мл реципиентных культур 2); 3); 4); 5), выращенных в бульоне BHI (DIFCO) при 35°С в течение 3 часов, смешивали с 1 мл фага Бф/Д (рВС16) с концентрациями 1,2·10⁹; 1,2·10⁸; 1,2·10⁷; ф.ч./мл, а контроль - 1 мл, реципиентной культуры 2), 3), 4), 5) с 1 мл фагового буфера. Смеси инкубировали 20 мин при 33°С в шейкере при 100 кач. обр./мин. Затем во все опытные и контрольные пробы вносили по 1 мл препарата клеточных рецепторов соответствующих реципиентов 2); 3); 4); 5) и вновь инкубировали при 33°С. Через 30 мин вносили в каждую пробу трансдуцирующей смеси еще по 1 мл соответствующих рецепторов и высевали по 0,2 мл из каждой опытной и контрольной пробы на селективные (cTet 20 мкг/мл) среды Хоттингера (по 3 чашки на пробу). Выросшие Тс^R колонии-трансдуктанты учитывали через 48-72 часа инкубации посевов при 35°С (см. таблица 2).

Как свидетельствует результат эксперимента (таблица 2), при внутривидовой и межвидовой трансдукции частота выхода трансдуктантов в опытах зависит не только от концентрации фага, т.е. от состояния в трансдуцирующей системе фаг - реципиентная клетка, но и от эндонуклеазной активности (хозяин-контролирующей модификации) реципиента, выраженной в единицах эффективности посева трансдуцирующего фага.

Таким образом, благодаря предложенному методу можно определить более перспективный реципиент, у которого эффективность посева трансдуцирующего фага равна от 0,5-1,0.

Источники информации

1. Микробиологическая диагностика сибирской язвы/ Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В. и др. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 224 с.

2. Черкасский Б.Л. Закономерности территориального распространения и проявления активности стационарно-неблагополучных по сибирской язве пунктов // Эпидемиология и инфекционные болезни. -1999, - №2. - С.48-52.

3. Inglesby Т., O'Toole Т., Henderson D. et al. Anthrax as a biological weapon // JAMA. - 2002. - V.287. - P.2236-2252.

4. Буланцев А.Л., Липницкий А.В. Спонтанные генетические процессы у Bacillus anthracis и у близкородственных бацилл // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2003. - С.79-86.

5. Ильина Т.С.Механизмы горизонтального переноса генов: Роль бактериофагов и интегронов в эволюции патогенных бактерий // Молекулярная генетика микробиол. и вирусол. - 2003. - №4. - С.3-10.

6. Bramucci M.G., Lovett P.S. Low-frequency pBSl-mediated plasmid transduction in Bacillus pumilis // J.Bacteriol. - 1976. - V.127. - P.829-831.

7. Ruhfel R.E., Robillard N.J., Thorne C.B. Interspecies transduction of plasmid among Bacillus anthracis, B.cereus and B.thuringiensis // J.Bacteriol. - 1984. - V.157. - N3. - P.708-711.

8. Буланцев А.Л. Влияние бактериофага на электрофоретическую подвижность некоторых видов бактерий семейства Enterobacteriaceae// Диссер. канд. мед. наук. - Ростов-на-Дону. - 1970. - 170 с.

9. Буланцев А.Л., Липницкий А.В., Барков A.M., Шелохович А.И. Возможности генетического обмена между родственными бациллами с помощью трансдукции. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции. Волгоград. - 1992. - С.56.

10. Bulantsev A.L., Lippnitsky A.V., Barcov A.M. Genetic exchange Bacilli by transduction //The 2^nd international workshop on the molecular biology of Bacillus cereus, B.anthracis and B.thuringiensis. - Taos, New Mexico USA. August 11-13, 1999. - P.31.

11. Luria S.E. Host-induced modifications of viruses // Cold spr. Harb. symp.quant. Biol. -1953. - 18. - P.237.

12. Bertani J., Weigle I.I. Host controlled variation in bacterial viruses / J.Bacteriol. - 1953. - V.65. - P.113.

13. Arber W., Dussoix D. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli I. Host controlled modification bacteriophage λ. / /J., mol. Biol., - 1992. - N5, - P.18.

14. Dussoix D., Arber W., Host specificity of DNA produced by Escherichia coli II. Control over acceptance of DNA from infecting phage λ. / J.mol. Biol., - 1962. - N5, - P.37.

15. Фаг лямбда. Изменчивость, контролируемая хозяином. В. Арбер. - Изд-во «Мир». - М. - 1975. - Гл. IV., - С.112-128.

16. Биохимия нуклеиновых кислот. / Метилирование. Дж.Дэвидсон. // Изд. «Мир». - М. - 1976. - Гл.9. - С.216-225.

17. Gola М., Hurwitz J., Anders M., Functional analysis of host-specificity mutants in Escherichia coli // Proc. Nat. Acad.Sci. - 1964. - N50. - P.164.

18. Arber W. Host-speciflcity of DNA produced by Escherichia coli. V. The role methionine in the production of host specificity. // J. Mol. Biol. - 1965. - N11. - P.247.

19. Lark C., Arber W. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. XIII. Breakdown of cellular DNA upon growth in ethionine of strains r⁺ ₁₅, r⁺ _P1 or r⁺ _N3 restriction phenotypes // J. Mol. Biol. - 1970. - v.52. - P.337.

20.Takano Т., Watanabe T. Fukasawa T. Specific inactivation of infectious λ DNA by sonicates of restrictive bacteria with R factors // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1966/-N25. - P.192.

21. Takano Т., Watanabe Т., Fukasawa T. Mechanism of host-controlled restriction of bacteriophage λ by R factors Esherichia coli K12 // Virology. - 1968. - V.34. - P.290.

22. Smith И.О., Wilcox K.W. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. // J. Mol. Biol. - 1970. - V.51. - P.379.

23. Домарадский И.В., Ключарева Л.А., Лапина Г.Ф. Об условиях трансфекций у бактерий // ЖМЭИ. - 1976. - №4.

24. Генетическая трансформация и трансфекция. Прозоров А.А. // Изд-во «Наука». - М. 1980. - 248 с.

25. Reilly В., Spizisen J. Transformation of Bacillus subtilis by bacteriophage DNA // Fed. Proc. - 1964. - V.23. - N2. - P.1.

26. Штамм Pseudomonas pseudomallei СВБК 141 Pur^-- универсальный рецепт для генетической идентификации культур микроорганизмов. Буланцев А.Л., Кучеряева В.Т., Авт. свид. №1131902. - 1983. Бюлл. №48, 1984.

27. Thorne C.B., Holt S.C. Cold lability of Bacillus cereus bacteriophage CP-51 // J. Virol. - 1974. - 14. - P.1008. - 1012.

28. Бактериофаги. Адамс // Изд-во «Ин.лит». - М. - 1961. - С.391-401.

29. Luria S.E., Williams R.C., Backus R.C. Electron micrographic counts of bacteriophage particles //J. Bacteriol. - 1951. - V.61. - P.179.

30. Kellenberger E., Arber W. electron microscopical studies of phage multiplication. A method for quantative analysis of particle suspensions// Virology. - 1957. - V.3. - P.245.

31. Генетика бактерий и бактериофагов. Хейс Y. // Изд-во «Мир». - М. - 1965. - С.278.

32. Буланцев А.Л., Лозовая Н.А. Спонтанная генетическая трансформация у Pseudomonas pseudomallei // Ж. молек. генет. микроб. и вирусолог. - М. «Медицина». - 1985. - №9. - С.11-14.

33. Thorne C.B. Trancducing bacteriophage for Bacillus cereus / J.Virolog. - 1968. - 2. - P.257-262.

34. Davies D.Y., Harvey B.W.S. The isolation of Bacillus anthracis from bones // Lancet. -1955. - V.269. - N2. - P.86-87.

35. Способ получения стрептомицин-резистентных вариантов возбудителя сибирской язвы из симбиотической смеси клеток Bacillus anthracis и скользящих бактерий - Myxococcus xanthus: Патент №2233883 МПК⁷ C12Q 1/02 / Буланцев А.Л., Липницкий А.В. Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт; №2002135751; Приоритет 30.12.2002. Бюл. №22, 2004.

36. Способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена: Патент №2230570 RU МПК⁷ А61К 39/07, 35/74. Ермакова И.А., Липницкий А.В., Барков A.M., Евтеева Е.В., Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт; №2002129683; Приоритет 04.11.202. Бюл. №17, 2004 г.

37. Способ трансдукции Bacillus anthracis и близкородственных бацилл: Патент №2287579 RU МПК⁷ С1. Буланцев А.Л. (RU), Елизаров В.В. (RU), Курилов В.Я. (RU), Липницкий А.В. (RU); Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт; №2005112490/13; Приоритет от 25.04.2005.

38. Мониатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование // Изд-во М. «Мир» - 1984. - С.85.

Таблица 1
Эффективность посева (Э.п.) фага Бф/B.anthracis Davies (рВС16) TetR на различных штаммах бациллА. Оптимальные реципиенты с Э.п.0,5-1 и более
Штамм	Происхождение	Э.п.
1. B.anthracis Davies	Авирулентный штамм (34). Получен из коллек. центра	≈0,8-1
	ВолгоградНИПЧИ
2. B.anthracis СТИ-1 тб	Вакцинный штамм из Тбилиси Сер. 104 K116.	≈0,5
3. B.anthracis СТИ-1 морф.	Вакцинный штамм из Екатеринбурга Сер. 32-0303.	≈0,8
4. B.anthracis Ценковский II	Вакцинный штамм. Получен из коллек. Центра ВолгоградНИПЧИ.	≈0,5-0,8
5. B.anthracis Ichteman	Вакцинный штамм получен из коллек. Центра	>1
	ВолгоградНИПЧИ.
6. B.thuringiensis Var.galleria T-4 (69-6)	Из ГосНИИ генетика М. 117545 от Р.Р.Азизбекяна.	>1
7. B.thuringiensis Var. thuringiensis Pasteur	-	≈0,6-0,8
8. B.cereus ATCC6464 infected with phage CP53	Из набора Торне (33) Получен из Ставропольского НИПЧИ от Е.И.Еременко.	≈0,8

Продолжение табл.1
Б. Реципиенты, рестрицирующие фаг «Бф/ В.а. Д (рВС16) TetR с Э.п. меньше 0,5
1. B.anthracis Davies StrR	Получен нами (35)	≈0,1
2. B.anthracis Davies StrRD	-	≈0,2
3. B.anthracis 81/1 TR	Получен от Баркова А.М. (36)	≈0,2-0,4
4. B.anthracis Sterne	Вакцинный штамм из коллекционного центра ВолгоградНИПЧИ	-0,3
5.B.cereus ATCC6464 curedufCP53	Получен из Ставропольского НИПЧИ от Е.И. Еременко (набор Торне).	≈0,01
6. B.cereus NRRL 569 K36 Met-.	-	≈0,05
7. B.cereus NRRL 569 spores with phage CP 51	-	≈0,3
8. B.cereus NRRL 569 wild tupe Prototroph.	-	≈0,4
9. B.cereus NRRL 569 «R» M20 StrR3trp-.	-	≈0,2

Таблица 2.
Результаты внутривидовой и межвидовой трансдукции
Трансдуцирующие смеси	Концентрация фага Бф/Д (рВС16)	№ чашки	Количество ТсR колоний	Трансдуцирующие смеси	Концентрация фага Бф/Д (рВС16)	№ чашки	Количество ТсR колоний
B.anthracis СТИ-1 тб Тсs + Бф/Д (рВС16) + К.р. Ва СТИ-1 тб		1	151	B.thuringiensis Ver.thuringiensis Pasteur Tcs + Бф/Д (рВС16) ТсR + Kp.B.t.p.		1	23
1,2·109	2	97	1,2·109	2	18
	3	82		3	21
	1	64		1	50
1,2·108	2	69	1,2·108	2	41
	3	52		3	53
	1	8		1	3
1,2·107	23	124	1,2·107	23	64
B.anthracis СТИ-1 тб + фаговый буфер + К.р./В.а. СТИ-1 тб		1	0	B.thuringiensis Ver.thuringiensis Pasteur + фаговый буфер + K.p./B.t.P.		1	0
	2	0		2	0
	3	0		3	0

Трансдуцирующие смеси	Концентрация фага Бф/Д (рВС16)	№ чашки	Количество ТсR колоний	Трансдуцирующие смеси	Концентрация фага Бф/Д (рВС16)	№ чашки	Количество ТсR колоний
B.anthracis 81/1TR Tcs + Бф/Д (рВС16) + К.р.Ва 81/1 TR		1	26	B.cereus ATCC6464 Tcs+Бф/Д (рВС16) + Кр.В.с6464		1	0
1,2·109	2	23	1,2·109	2	0
	3	23		3	0
	1	26		1	0
1,2·108	2	24	1,2·108	2	0
	3	19		3	0
	1	1		1	0
1,2·107	23	12	1,2·109	23	00
B.anthracis 81/1TR + фаговый буфер + К.р. Ва 81/1 TR.		1	0	B.cereus АТСС6464 + фаговый буфер + Кр.В.с6464		1	0
	2	0		2	0
	3	0		3	0

Способ подбора реципиента для осуществления трансдукции Bacillus anthracis и близкородственных бацилл, включающий следующие этапы определенния чувствительности донора и реципиента к трансдуцирующему фагу:

определение эффективности посева трансдуцирующего фага, размноженного на штамме-доноре, и штаммах будущих реципиентов, при этом эффективность посева считается оптимальной в пределах 0,5-1,0;

проверяют качество реципиента при постановке внутривидовой и межвидовой трансдукции путем добавления 1 мл трансдуцирующего фага различной концентрации к 1 мл реципиентных культур В.anthracis, B.thuringiensis и B.cereus с различной характеристикой эффективности посева трансдуцирующего фага, а контроль - 1 мл реципиентной культуры смешивают с 1 мл фагового буфера и инкубируют 20 мин при 33°С в шейкере при 100 кач. обр./мин, затем во все опытные и контрольные пробы вносится по 1 мл препарата клеточных рецепторов соответствующих реципиентов, и вновь инкубируют 30 мин при 33°С, после чего в каждую пробу трансдуцирующей смеси вносят еще по 1 мл соответствующих рецепторов и высевают по 0,2 мл из опытной и контрольной пробы на селективные (с тетрациклином 20 мкг/мл) среды Хоттингера (по 3 чашки на пробу), выросшие Tet^R колонии-трансдуктанты учитывают через 48-72 ч инкубации посевов при 35°С,

реципиента считают оптимальным для трансдукции, если эффективность посева трансдуцирующего фага равна 0,5-1,0 (отношение показателя концентрации трансдуцирующего фага, полученного на штамме-доноре к показателю концентрации, полученной на подбираемом штамме-реципиенте).