Способ определения зараженности продовольствия патогенными биологическими агентами в условиях чрезвычайных ситуаций

Способ определения зараженности продовольствия патогенными биологическими агентами в условиях чрезвычайных ситуаций

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано при проведении лабораторного контроля продовольствия на зараженность патогенными биологическими агентами в условиях чрезвычайных ситуаций.

Совершенствование системы и методов мониторинга и прогнозирования чрезвычайных ситуаций является в настоящее время актуальной задачей для специалистов различных служб и ведомств, занимающихся организацией и проведением специфической индикации (СИ) патогенных биологических агентов и лабораторного контроля продовольствия (ЛКП) на зараженность ими. Использование патогенных биологических агентов (ПБА) для целей биотерроризма может создать чрезвычайную ситуацию, поэтому повышение уровня готовности специалистов к ликвидации последствий использования ПБА приобретает в настоящее время особую значимость.

Известен способ специфической индикации бактерий, риккетсий, хламидий, вирусов, грибов и токсинов (см. «Руководство по индикации и идентификации бактериальных (биологических) средств», М.: Военное издательство, 1989 г., стр.24-30), включающий лабораторные методы микробиологического экспресс-анализа, предусматривающие два взаимодополняющих этапа исследования:

- непосредственный анализ нативных материалов проб посредством экспресс-методов;

- исследование этими же методами материалов тех же проб после их предварительного биологического обогащения.

Однако известный способ предназначен для исследования объектов внешней среды, материала от больных людей и сельскохозяйственных животных, а также диких грызунов и насекомых - переносчиков заболеваний, но не учитывает специфику контроля продуктов питания.

Известны способы лабораторных исследований продовольствия (см. «Инструкцию по лабораторному контролю продовольствия на зараженность возбудителями опасных инфекционных заболеваний и токсинами», М.: Военное издательство, 1983 г., стр.6-12), заключающиеся в том, что из каждой доставленной пробы делают три навески по 25 г (мл) и проводят с ними следующие технологические приемы:

- первую предназначают для посева на элективные среды, вторую - для заражения лабораторных животных при исследовании на бактериальные и риккетсиозные возбудители, третью - для исследования экспрессными методами, при этом четвертая и пятая навески по 100 г (мл) предназначаются для вирусологических исследований и для обнаружения токсинов.

Недостатком известного способа является громоздкость технологии исследования пищевых продуктов на всех этапах экспертизы, а длительность их проведения снижает в целом его эффективность, что важно при исследовании ряда возбудителей инфекционных заболеваний, а именно: чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, сальмонеллеза, патогенной кишечной палочки, которые в настоящее время рассматриваются как возможные агенты для целей биотерроризма.

Кроме того, в известном способе включены приемы исследований, которые малочувствительны и неэффективны, например:

- нагрев и расплавление жиров до 40°С затрудняет исследование жиров классическими и экспрессными методами, снижая чувствительность и специфичность;

- использование формалина для инактивации проб, исследуемых МФА, резко снижает специфичность свечения, причем необходимость в его использовании может быть полностью исключена, т.к. обеззараживание достигается путем фиксации мазков ацетоном или спиртом;

- прогревание проб до 56° в течение 30 минут при постановке серологических реакций используют при исследовании сывороток людей и животных для разрушения комплимента, что неэффективно для инактивации ПБА;

- низкоэффективен в плане чувствительности встречный иммуноэлектрофорез.

Эти обстоятельства указывают на актуальность создания нового, современного способа лабораторного контроля продовольствия, который бы удовлетворял требованиям оперативности, четкости и результативности проводимых анализов, предъявляемых специалистами лабораторной службы, занимающихся вопросами индикации и идентификации ПБА в условиях ЧС.

Задача предлагаемого изобретения состояла в повышении эффективности и совершенствовании существующих методов лабораторного контроля продовольствии с целью их унификации и приближения к специфической индикации патогенных биологических агентов.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе определения зараженности продовольствия патогенными биологическими агентами в условиях чрезвычайных ситуаций, включающем подготовку проб и их лабораторное исследование, подготовку проб проводят в два этапа, на первом, в зависимости от плотности, жиросодержания и текучести продукта, его подвергают соответственно: взвешиванию, выделяя 25 г (мл) продукта с последующим измельчением, и переводу в жидкую фазу в объеме 50-100 мл посредством добавления физиологического раствора, а при исследовании воды последнюю в количестве 500 мл фильтруют через мембранные фильтры; второй этап включает разделение жидкой фазы пробы на 5 частей: первые три части (по 2 мл) используют для проведения экспрессных и ускоренных методов анализа - МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР, четвертую часть пробы (также 2 мл) высевают на питательные среды для проведения бактериологического анализа, а 5 часть (5 мл) - для заражения лабораторных животных, причем проведение этапов на 25 пробах осуществляют параллельно в течение 1,5-2 часов, исследование проб экспрессными методами - в течение 4-10 часов, а биологическим путем - в течение 48-120 часов, при этом зараженность продуктов подтверждают при высокой обсемененности (≥1·10⁶ м.к. в 1 мл или 1 г) на стадии исследований нативного материала, в случае низкой обсемененности (≤1·10⁴ м.к. в 1 мл или 1 г) - положительный результат фиксируют в ПЦР и ИФА и после биологического накопления патогенных биологических агентов в посевах и органах ослабленных биопробных животных - в ПЦР, ИФА, МФА, РНГА или РАО.

При этом МФА проводят в следующей последовательности: первоначально пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут, осаждая микробные клетки, затем к осадку добавляют 0,1 мл физиологического раствора и готовят мазки, причем при анализе жиров на мазки перед фиксацией наносят для обезжиривания эфир на 1-2 минуты, в последующем мазки подвергают фиксации в спирте или ацетоне с дальнейшей обработкой люминесцирующей сывороткой и просмотром в люминесцентном микроскопе.

При проведении РАО используют полимерные иммуноглобулиновые диагностические препараты, которые вводят по 25 мкл в опытную лунку, содержащую 50 мкл исследуемого материала, и в контрольную лунку, в которую наливают 25 мкл исследуемого материала и 25 мкл специфической сыворотки в разведении 1:10, при этом учет реакции проводят через 2-3 часа по характеру цветового агломерата.

Для проведения ПЦР выделяют ДНК микроорганизмов из проб пищевых продуктов, применяя в зависимости от сложности их состава гуанидинтиоцианатный метод или фенольную экстракцию, а затем проводят постановку ПЦР, используя 1-5 мкл раствора, содержащего ДНК, с последующим учетом ее реакции, обеспечивающей чувствительность 2·10³ м.к./мл.

Биологическое исследование на присутствие микроорганизмов проводят в два этапа, первоначально осуществляют посев по 0,2 мл материала на 1-2 чашки селективной питательной среды, проводят инкубацию при 28 и 37°С и после появления колоний осуществляют исследование посредством экспрессных и ускоренных методов (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР), второй этап заключается в том, что четырем исследуемым животным предварительно (за 2-4 часа до заражения) подкожно вводят гидрокортизон в объеме 5 мг, а исследуемый материал - по 1 мл внутрибрюшинно, в случае использования других иммунодепрессантов (желток, циклофосфан, муцин) их вводят вместе с исследуемым материалом внутрибрюшинно в количестве 0,5 мл иммунодепрессанта и 0,5 мл пробы; через 24 часа двух мышей вскрывают, делают посевы на питательные среды, мазки-отпечатки для МФА, а материал из органов животных исследуют в ПЦР, РНГА, РАО или ИФА, причем двух оставшихся животных подвергают вскрытию через 48 часов и исследуют по вышеприведенной технологии.

Кроме того, в качестве селективных питательных сред используют: АДЭТ-агар диагностический элективный туляремийный, АДЭСБ-агар диагностический элективный сибиреязвенный, СЭДХ-среду элективную диагностическую холерную, ЧДС-37 чумную дрожжевую среду.

Предлагаемый способ (см. таблицу 1) осуществляют по следующим этапам:

I этап - подготовительный

1. Готовят одну навеску пробы пищевого продукта, причем в зависимости от его плотности, жиросодержания, текучести - проводят:

а) взвешивание по 25 г (мл) продукта с последующим измельчением;

б) перевод пробы в жидкую фазу в объеме 50-100 мл посредством добавления физиологического раствора;

в) фильтрование воды в количестве не менее 500 мл через мембранные фильтры.

2. Деление проб на части:

а) по 2 мл для исследования:

- МФА;

- РНГА (РАО) или ИФА;

- ПЦР;

- бактериологическим методом (посев на питательные среды);

б) 5 мл для исследования:

- биологическим методом (заражение биопробных животных).

Подготовительный этап на 25 пробах осуществляют в течение 1,5-2 часов.

При наличии в надосадочной жидкости частиц продукта пробу предварительно центрифугируют при 1000 об/мин 10 минут. Исследуют надосадочную часть пробы.

II этап - исследовательский

1. Пробы исследуют ускоренными и экспрессными методами в течение 4-10 часов, используя высокоспецифичные и чувствительные методы для экспресс-диагностики продовольствия на наличие патогенных биологических агентов (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР):

а) исследование методом флюоресцирующих антител (МФА) проводят в следующей последовательности:

Во-первых, пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут для осаждения микробных клеток, затем к осадку добавляют 0,1 мл физиологического раствора и готовят мазки для МФА.

При исследовании жиров и жиросодержащих продуктов методом флюоресцирующих антител проводят обезжиривание приготовленных мазков эфиром в течение нескольких минут перед их фиксацией в ацетоне или спирте, что на 2-3 порядка повышает чувствительность МФА. Мазки обрабатывают люминесцирующими сыворотками и просматривают в люминесцентном микроскопе. Чувствительность метода 1·10⁴-1·10⁵ м.к./мл;

б) исследование с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) заключается в том, что в подготовленную пробу добавляют формалин до концентрации 4%, контакт длится 1 час, рН доводят до 7,0. Реакцию ставят в 2 лунках как при специфической индикации: 1 - опытная, 2 - контрольная (торможение), через 2-3 часа учитывают реакцию. Чувствительность метода 1·10⁵-1·10⁷ м.к./мл;

в) исследование посредством реакции агломерации объемной (РАО) осуществляют посредством полимерных иммуноглобулиновых диагностических препаратов, где в качестве носителя используют не эритроциты, а полимеры. Чувствительность метода 1·10⁵-1·10⁷ м.к./мл. Ростовским НИПЧИ раз работаны диагностикумы для обнаружения возбудителя чумы (РП №978-00 от 20.06.2000 г., регистрационный №94/90/3) и туляремийного микроба (РП №979-00 от 20.06.2000 г., регистрационный №94/90/2).

Методика постановки РАО для всех продуктов питания одинакова и проводится в следующей последовательности: подготовленную пробу в соответствии с технологией по I этапу (см. таблицу 1) обрабатывают формалином до концентрации 4%, контакт 1 час, доводят рН до 7,0, после этого ставят реакцию в 2 лунках. В первую лунку (опытную) наливают 50 мкл исследуемого материала, а во вторую лунку (контрольную) - по 25 мкл исследуемого материала и специфической сыворотки в разведении 1:10, длительность контакта 10-15 минут. Затем через 15 минут в обе лунки вводят диагностический препарат в объеме 25 мкл. Учет реакции предварительный ведут через 2- 3 часа, а окончательный через сутки.

За положительный результат принимают цветной ярко-розовый агломерат, выстилающий все дно лунки равномерно. При отрицательном результате в опыте и контроле образуется компактное «колечко» или «точка» в центре лунки.

г) исследование проб посредством иммуноферментного анализа (ИФА) проводят в соответствии с общепринятыми методами. Чувствительность метода 1·10³-1·10⁴ м.к./мл.

Для обеззараживания проб их кипятят в течение 10-15 минут, а постановку реакции осуществляют в 2 лунках (опытной и контрольной) и через 2-3 часа учитывают реакцию.

д) исследование патогенных микроорганизмов с помощью ПЦР осуществляют в соответствии с разработанной технологией (см. таблицу 1). Чувствительность метода 1·10¹-1·10³ м.к./мл.

Для проведения реакции из 2 мл проб пищевых продуктов выделяют ДНК микроорганизмов. Пробы твердых продуктов и пробы, представленные смывами, подвергают обработке гуанидинтиоцианатным методом, который обеспечивает чувствительность 2·10³ м.к./мл.

Пробы, содержащие большое количество белка, такие как простое и сквашенное молоко, подвергают фенольной экстракции, обеспечивая высокую чувствительность и воспроизводимость результатов. Затем проводят постановку полимеразной цепной реакции, используя от 1 до 5 мкл раствора, содержащего ДНК, с последующим учетом результатов реакции. На получение положительного результата влияет состав пищевых продуктов, некоторые компоненты которых могут ингибировать течение реакции, поэтому подбор метода выделения ДНК, устранение интерферирующих веществ и ингибиторов являются основными моментами при проведении ПЦР.

Экспрессные и ускоренные методы проводят в течение 4-10 часов.

2. Исследование проб биологическим методом:

а) путем посева на питательные среды. Для этого производят посев по 0,2 мл исследуемого материала на одну чашку питательной селективной среды (в случае исследования на возбудителя чумы посев делают на две чашки), выращивают в термостате при 37°С, для Y.pestis - инкубация при 28 и 37°С. При появлении характерных для каждого вида микроорганизмов колоний проводят их исследование посредством экспрессных и ускоренных методов (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР), отсевают колонии для получения чистых культур с последующей идентификацией до вида.

Причем для выделения патогенных биологических агентов из пищевого сырья, продуктов и воды впервые были использованы питательные селективные среды, зарегистрированные в госреестре:

агар диагностический элективный туляремийный - АДЭТ (№93/270/11, 2001 г.)

агар диагностический элективный сибиреязвенный - АДЭСБ (№93/270/13, 2001 г.)

среда элективная диагностическая холерная - СЭДХ (№93/270/17, 2001 г.).

Выделение бруцелл из пищевых продуктов осуществляют на эритрит-агаре с генцианвиолетом в разведении 1:500000 и полимиксином в концентрации 0,02 г/л, чумного микроба - на эритрит-агаре с генцианвиолетом в разведении 1:200000 и 0,02 г/л полимиксина. На эритрит-агаре чумной микроб одинаково хорошо вырастает как при 28°С, так и при 37°С. Среда обеспечивает продукцию фракции 1 (Ф1) чумным микробом, которая выявляется табельными индикационными методами.

При проведении лабораторного контроля продовольствия на энтеробактерии используют висмут-сульфитный агар, среды Эндо и Плоскирева.

В предлагаемых средах использованы новые антибиотики, не вызывающие резистентность в сравнении с ранее использованными.

б) путем заражения биопробных животных.

Для снижения естественной резистентности лабораторных животных чаще используется гидрокортизон ацетат. Гидрокортизон вводят четырем белым мышам за 2-4 часа до заражения в количестве 5 мг под кожу бедра. Подготовленный образец продуктов инъецируют мышам внутрибрюшинно в объеме 1 мл. При отсутствии гидрокортизона используют другие иммунодепрессанты (суспензию желтка, 4 мг/мышь циклофосфана, 5% муцин). Их вводят вместе с исследуемым материалом внутрибрюшинно (0,5 мл иммуно-депрессанта и 0,5 мл пробы).

Вскрывают животных по аналогии со схемой специфической индикации в два срока (по две белых мыши через 24 и 48 часов). При вскрытии лабораторных животных из всех органов делают посевы, мазки-отпечатки на стеклах для обработки флуоресцирующими сыворотками. Ткани органов используют для постановки РНГА, РАО, ИФА, ПЦР. После выделения чистых культур от биопробных животных их идентифицируют с помощью классических и экспрессных методов.

В зависимости от вида ПБА все исследование по схеме ЛКП проводится в течение 48-120 часов (см. таблицу 1).

Пример 1. Обнаружение (индикация) чумного микроба в пищевых продуктах с помощью предлагаемого способа.

В примере приведен ход исследования колбасы, пшена, сливочного и растительного масел, сыра, хлеба пшеничного и ржаного, сахара, молока пресного и простокваши, воды на зараженность их чумным микробом по схеме лабораторного контроля продовольствия (см. таблицу 1).

Индикация Y.pestis в пищевых продуктах осуществляется в соответствии с предлагаемыми в таблице 1 этапами.

I этап - подготовка проб к исследованию

На I этапе проводится специальная подготовка продуктов к исследованию и деление их на части для последующего проведения индикации:

а) колбаса

Продукт в количестве 25 г измельчают, затем добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость.

Далее пробу делят на 5 частей по количеству методов исследования:

1. 2 мл для исследования методом флуоресцирующих антител (МФА);

2. 2 мл для постановки РНГА (РАО), ИФА;

3. 2 мл для постановки ПЦР;

4. 2 мл для посева на питательные среды;

5. 5 мл для заражения биопробных животных.

б) пшено:

В 25 г пшена добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость. Деление пробы, как в пункте «а».

в) сливочное и растительное масла:

25 г сливочного масла режут на кусочки, добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. Для дальнейшей работы используют жидкость из-под слоя жира. При исследовании растительного масла физиологический раствор в пробы не добавляют.

Деление пробы, как в пункте «а».

г) сыр:

Сыр в количестве 25 г измельчают, затем добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. После встряхивания и отстаивания исследуют жидкость из-под слоя жира, но над осадком.

Деление пробы, как в пункте «а».

д) хлеб:

Хлеб (пшеничный и ржаной) в количестве 25 г измельчают, затем в каждую пробу добавляют по 100 мл физиологического раствора (хлеб впитывает в себя много жидкости). Суспензию встряхивают в течение 5 минут и затем отстаивают 15 минут. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость.

Деление пробы, как в пункте «а».

е) сахар:

К 25 г сахара добавляют 50 мл физиологического раствора и после растворения пробу немедленно (поскольку в растворе сахара микроорганизмы быстро погибают) делят на части, сеют на питательные среды и заражают биопробных животных.

Деление пробы, как в пункте «а».

ж) молоко и простокваша:

Молоко 50 мл исследуют без предварительной обработки, если простокваша густая, то ее необходимо развести 50 мл физиологического раствора.

Деление пробы, как в пункте «а».

з) вода:

Воду 500 мл фильтруют через мембранные фильтры, которые затем смывают 15 мл физиологического раствора.

Деление пробы, как в пункте «а».

II этап - исследование проб

II этап включает в себя необходимую дополнительную подготовку проб и их исследование экспрессными, ускоренными и биологическими методами.

1. Исследование продуктов экспрессными и ускоренными методами:

а) колбаса: для исследования подготовленной на I этапе пробы экспрессными и ускоренными методами (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР) ее предварительно центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин для осаждения грубых частиц продуктов. После центрифугирования исследуют надосадочную жидкость.

Часть пробы, предназначенную для МФА, дополнительно центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин для осаждения микробных клеток. После центрифугирования к осадку добавляют 0,1 мл физиологического раствора и готовят на предметных стеклах мазки для люминесцентной микроскопии, которые после высыхания фиксируют в ацетоне или спирте. Затем мазки обрабатывают флуоресцирующей чумной адсорбированной лошадиной сывороткой производства Всероссийского НИПЧИ «Микроб» (г.Саратов) и просматривают в люминесцентном микроскопе.

Перед постановкой РНГА в пробу для обеззараживания добавляют формалин до конечной концентрации 4%, экспозиция 1 час, доводят рН до 7,0, ставят и учитывают реакции.

Перед постановкой ИФА материал кипятят 10-15 мин.

Реакции ставят микрометодом в 2 лунках полистироловых пластин (1 - опытная, 2 - контроль торможения). Для РНГА используют диагностикум эритроцитарный чумной иммуноглобулиновый сухой производства НИИМ МО РФ (г.Киров), для РАО - чумной иммуноглобулиновый полимерный сухой диагностикум производства РостНИПЧИ, для ИФА - тест-систему иммуноферментную моноклональную для обнаружения и идентификации капсульного антигена Ф1 возбудителя чумы производства НИИМ МО РФ (г.Киров).

Для постановки ПЦР выделяют ДНК, ставят и учитывают реакцию с Ген-Пест Тест-системой производства Российского НИПЧИ «Микроб» (г.Саратов);

б) пшено: исследование пшена экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;

в) сливочное и растительное масла: исследование масел экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы.

Особенности исследования жиров для обнаружения чумного микроба с помощью МФА: на мазки перед фиксацией наносят для обезжиривания эфир на 1-2 мин;

г) сыр: исследование сыра экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;

д) хлеб: исследование хлеба экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;

е) сахар: исследование сахара экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;

ж) молоко и простокваша: исследование молока и простокваши экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы;

з) вода: исследование воды экспрессными и ускоренными методами осуществляют по аналогии с исследованием колбасы.

Вероятность обнаружения чумного микроба в нативном материале экспрессными и ускоренными методами зависит от:

а) обсемененности продуктов Y.pestis;

б) срока (давности) заражения продуктов;

в) чувствительности используемых для индикации методов.

Было экспериментально доказано, что удельный вес микроорганизмов, сохраняющихся в различных пищевых продуктах, зависит как от характера продукта, так и от времени, прошедшего от момента заражения продуктов до начала их исследования (см. таблицу 2).

Из таблицы 2 видно, что в таких продуктах, как сливочное и растительное масло, вода, микроорганизмы хорошо сохраняются довольно длительное время, так через 1 сутки в этих продуктах сохраняется от 48,8 до 100% живых микробных клеток, а через 3 суток - от 5 до 100% (растительное масло).

Наиболее быстрая гибель бактерий происходит в таких продуктах, как простокваша, пшено, хлеб ржаной, сахар. Уже через 1 час после заражения этих продуктов в них остается всего 5-11,6% жизнеспособных микроорганизмов; через 24 часа - от 0,2 до 6%, а через 72 часа - от 0 до 0,08%, что создает определенные сложности для индикации Y.pestis экспрессными и ускоренными методами, имеющими определенную чувствительность (см. таблицу 3).

При исследовании нативных проб экспрессными и ускоренными методами были сделаны выводы: наиболее чувствительным является метод ПЦР (возможность обнаружения ДНК чумного микроба составляет 2·10³ м.к./г(мл) продукта).

Второе место по чувствительности занимает метод РАО (выявляет от 1·10⁵ до 2·10⁷ м.к./г (мл), т.е он дает положительные результаты только с достаточно высоко обсемененными пробами), но даже при высокой обсеменности РАО не дает положительных результатов при исследовании растительного масла.

Метод РНГА по чувствительности приближается к РАО (выявляет от 2·10⁶ до 1·10⁷ м.к./г (мл) продукта и при этом неэффективен при исследовании молока, простокваши, сливочного и растительного масел, пшена.

Методом МФА выявляются микробы, находящиеся только в жизнеспособном состоянии, при этом обсемененность продуктов должна быть не ниже 2·10⁵-2·10⁷ м.к./г (мл). В таких продуктах, как молоко фляжное и простокваша, чумную палочку не удается выявить уже через 1 час после заражения, хотя обсемененность остается достаточно высокой (5-50%). По-видимому, сам продукт вызывает гашение специфической люминесценции.

Метод МФА достаточно эффективен при анализе растительного масла (даже через 3 суток от момента заражения в этом продукте возбудитель чумы обнаруживается в концентрации 1·10⁵ м.к./мл, так как чумная палочка за этот период, как показано в таблице 2, практически не отмирает).

Представленные данные иллюстрируют динамику снижения концентрации Y.pestis в ряде продуктов и достаточно ограниченные возможности экспрессных и ускоренных методов при исследовании нативных проб, поэтому схема лабораторного контроля предусматривает биологическое накопление (размножение) возбудителя с последующим исследованием проб с помощью тех же экспрессных и ускоренных методов. Предполагается, что высокая концентрация Y.pestis даст возможность провести успешную индикацию возбудителя.

2. Исследование продуктов биологическими методами

Проведение исследования проб биологическими методами включает в себя посев на питательные среды, заражение биопробных животных.

а) посев на питательные среды:

Для выделения культуры Y.pestis производят посев всех подготовленных на I этапе проб пищевых продуктов в объеме 0,2 мл на 2 чашки селективной питательной среды, посевы инкубируют в термостате при 37 и 28° в течение 48 часов. Выращивание при 28 позволяет выделить культуру для ее идентификации, при 37° происходит накопление фракции 1, которая может быть выявлена с помощью вышеуказанных серологических методов и в ПЦР.

При появлении колоний Y.pestis их изучают с помощью экспрессных и ускоренных методов (МФА, РНГА, РАО, ИФА, ПЦР), отсевают для получения чистых культур с последующей идентификацией до вида.

Хорошей средой для выделения Y.pestis является эритрит-агар (показатели прорастания чумного микроба на этой среде при 37° на 2 порядка выше, чем на агаре Хоттингера или среде Морриса) (см. таблицу 4).

При использовании этой среды минимальное количество микробных клеток Y.pestis, выявляемое при помощи серологических методов, составляет 1:10⁴-1·10⁵.

Добавление генцианвиолета в эритрит-агар в концентрации 1:200000 и полимиксина 0,02 г/л придает ей селективные свойства, не препятствуя росту чумного микроба и тормозя размножение как грамположительной, так и грамотрицательной микрофлоры (кроме Proteus vulgaris, который при этом не роится).

Помимо эритрит-агара для выделения возбудителя чумы из пищевых продуктов использовали среду ЧДС-37 (чумная дрожжевая среда), на которую в РостНИПЧИ в настоящее время оформляется нормативно-техническая документация. Морфология колоний чумного микроба на опытной среде ЧДС-37 типична для культуры, выращенной при 37°С.

Среда ЧДС-37 обеспечивает пророст не менее 40% клеток в популяции штамма EV (см. таблицу 5), т.е. по показателю прорастания она превосходит эритрит-агар.

Использование в качестве селективной добавки генцианвиолета в разведении 1:200000 и полимиксина в концентрации 0,02 г/л не угнетает рост чумного микроба, не снижает продукции Ф1, определяемой в МФА, РАО, РНГА. Среда ЧДС-37 обладает такими же селективными свойствами, как и эритрит-агар.

ЧДС-37 с генцианвиолетом 1:200000 и 0,02 г/л полимиксина впервые была использована для обнаружения чумного микроба в пищевых продуктах. Возможности выявления Y.pestis из различных продуктов при разной степени их обсемененности представлены в таблице 6.

На ЧДС-37 через час после заражения можно выделить Y.pestis в пищевых продуктах (кроме пшена, сахара, простокваши, ржаного хлеба), если количество микробных клеток в 10 г (мл) продукта не ниже 1·10³ м.к. Из-за быстрого отмирания микроорганизмов в сахаре, пшене, кислом молоке и ржаном хлебе через час Y.pestis можно обнаруживать лишь в дозе 1·10⁴ м.к.

Через 24 часа вероятность выделения микробных клеток из пшена, колбасы, кислого молока и ржаного хлеба снижается на порядок, т.е. составляет 1·10⁵ м.к. Выживаемость чумного микроба в молоке, сыре, сливочном и растительном масле, воде достаточно высока, поэтому в них возбудитель на среде ЧДС-37 мог быть обнаружен в дозе 1·10³ м.к.

Таким образом, возможность выделения чумного микроба из пищевых продуктов путем посева на питательные среды в определенной степени ограничена сроками заражения, обсемененностью и качеством продуктов.

При невозможности выделения культуры чумного микроба на селективных питательных средах при низком содержании возбудителя в продуктах это удавалось сделать с помощью заражения биопробных животных, в организме которых происходит размножение даже единичных микробных клеток, сохранившихся в продукте, что позволяет проводить их индикацию с помощью экспрессных и ускоренных методов.

б) заражение биопробных животных.

В качестве биологического метода для накопления и выделения чумного микроба используют биопробных животных (белых мышей), у которых предварительно снижают естественную резистентность с помощью иммунодепрессантов (схема). Гидрокортизон вводят четырем белым мышам за 2-4 часа до заражения исследуемым материалом в количестве 5 мг под кожу бедра. Подготовленный образец продуктов вводят мышам внутрибрюшинно в объеме 1 мл. При отсутствии гидрокортизона используют другие препараты (суспензию желтка, 4 мг/мышь циклофосфана, 5% муцин). Их вводят вместе с исследуемым материалом внутрибрюшинно (0,5 мл иммунодепрессанта и 0,5 мл пробы).

Вскрывают животных в 2 срока (по две белые мыши через 24 и 48 часов). При вскрытии лабораторных животных из всех органов делают посевы, мазки-отпечатки на стеклах для МФА. Ткани органов используют для постановки РНГА, РАО, ИФА, ПНР. После выделения чистых культур от биопробных животных их идентифицируют с помощью классических и экспрессных методов.

Таким образом, все исследование по предложенному способу проводится в течение 5 дней.

Пример 2. Обнаружение (индикация) сибиреязвенного микроба в пищевых продуктах с помощью предлагаемого способа (таблица 1).

Индикацию В. anthracis в пищевых продуктах (плотных, сыпучих, жирах, жиросодержащих, сахаре, воде, молочных) осуществляют в соответствии с предлагаемым способом (см. таблицу 1).

I этап - подготовка проб к исследованию

Плотные продукты (например, колбасу) готовят к исследованию, как в примере 1, пункте «а»: 25 г продукта измельчают, затем добавляют 50 мл физиологического раствора. Суспензию встряхивают в течение 15 минут. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость.

Сыпучие продукты (например, пшено), сливочное и растительное масло, сыр, ржаной и пшеничный хлеб, сахар, воду, молоко и простоквашу готовят для дальнейшего исследования так же, как описано в 1 примере, пункты «б», «в», «г», «д», «е», «ж» и «з».

Далее, как в 1 примере, подготовленные пробы делят на 5 частей по количеству методов исследования:

1. 2 мл для исследования методом флуоресцирующих антител (МФА);

2. 2 мл для постановки РИГА и ИФА;

3. 2 мл для постановки ПЦР (при наличии праймеров);

4. 2 мл для посева на питательные среды;

5. 5 мл для заражения биопробных животных.

II этап - исследование проб

Второй этап включает в себя необходимую дополнительную подготовку проб и исследование их экспрессными, ускоренными и биологическими методами.

1. Исследование продуктов экспрессными методами (МФА, РНГА, ИФА, ПЦР) осуществляют, как в примере 1, на II этапе в пунктах «а» «б», «в», «г», «д», «е», «ж» и «з» с использованием специфических сибиреязвенных диагностикумов: иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных неадсорбированных (производитель: предприятие по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, Москва); экспериментальные серии иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных неадсорбированных сухих (производитель: научно-производственное объединение «Пульс», НИИПЧИ, Ставрополь); экспериментальные серии иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных соматических люминесцирующих сухих; экспериментальные серии иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных антиспоровых адсорбированных люминесцирующих сухих (производитель: нучно-производственное объединение «Пульс», НИПЧИ, Ставрополь); диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного иммуноглобулинового сухого (производитель: НИИМ МО РФ, Киров); экспериментальные серии иммуноферментной тест-системы для диагностики возбудителя сибирской язвы (производитель: Российский НИПЧИ «Микроб», Саратов); ГенСибТест-системы для выявления ДНК B.anthracis pX0I+ методом полимеразной цепной реакции (производитель: Российский НИПЧИ «Микроб», Саратов и НИИМ МО РФ, Киров).

Вероятность обнаружения сибиреязвенного микроба в нативном материале экспрессными и ускоренными методами зависит от:

а) обсемененности продуктов возбудителем сибирской язвы или его спорами;

б) срока (давности) заражения продуктов;

в) чувствительности используемых методов исследования.

При отработке технологии способа лабораторного контроля продуктов на наличие сибиреязвенного микроба (или его спор) было установлено, что удельный вес микроорганизмов, сохраняющихся в различных продуктах, зависит как от характера пищевых продуктов, так и от времени, прошедшего от момента их заражения до начала исследования (см. таблицу 7).

Результаты экспериментального изучения выживаемости вакцинного штамма B.anthracis в различных продуктах были следующими. Через час после «заражения» количество выявляемых бацилл в кислом молоке и сахаре резко снизилось (1,5 и 2,1% соответственно); через сутки в этих продуктах живых клеток осталось 10 и 17%, через трое суток единичные микробные клетки выявлялись только в сахаре (0,3%).

Через час в два-три раза снизилось количество жизнеспособных клеток в ржаном хлебе, пшене, воде; через сутки их удельный вес составил 2,8-14,2%, через трое суток в этой группе продуктов клетки В. anthracis выживали только в пшене (2%).

В жирах и жиросодержащих продуктах (сливочное масло, сыр, колбаса) бациллы сохранялись на протяжении трех суток в большом количестве (10-18%), в подсолнечном масле - 100%.

Полученные экспериментальным путем результаты свидетельствуют о том, что вероятность обнаружения возбудителя сибирской язвы экспрессными и ускоренными методами, с учетом их чувствительности, снижается по мере снижения удельного веса жизнеспособных микробных клеток в пробах.

Методом флюоресцирующих антител выявляются микробы, находящиеся только в жизнеспособном состоянии, при этом обсемененность продуктов должна быть не ниже 5,0·10⁵-5,5·10⁶ м.к./г (мл) (таблица 8). В таких продуктах, как простокваша и сахар, сибиреязвенную палочку не удавалось выявить даже через 1 час после заражения, что соответствовало их низкой обсемененности (1,5-2%).

МФА достаточно эффективен при анализе растительного масла, так как сибиреязвенная палочка практически не отмирала в этом продукте даже через трое суток после заражения и возбудитель сибирской язвы обнаруживался в концентрации 5,5·10⁶ м.к./мл.

Метод РНГА дает положительные результаты только с высоко обсемененными пробами (2·10⁶-1·10⁷ м.к./г (мл) продукта), независимо от того в жизнеспособном или нежизнеспособном состоянии находятся микробные клетки (таблица 8). В пресном молоке, простокваше, растительном масле при помощи РНГА возбудитель сибирской язвы не мог быть выявлен даже в таких высоких концентрациях, так как в этих продуктах эритроцитарный диагностикум не осаждался, с пшеном результаты были также отрицательными из-за большого количества взвешенных частиц в пробе.

Нереальность обнаружения возбудителя сибирской яз