Способ прогнозирования тяжелого течения лепрозных полиневритов

Способ прогнозирования тяжелого течения лепрозных полиневритов

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и может быть, в частности, использовано для прогнозирования тяжелого течения полиневритов.

Из практики медицины известно о способе прогнозирования состояния поражения периферических нервов у больных лепрой, основанный на методе электромиографии. Показано, что по степени замедления скорости проведения электрического импульса по двигательным волокнам периферических нервов можно судить об их прогрессирующей деструкции. N.H. Antia, S.S. Pandia, D.K. Dastur Nerves in the arm in leprosy. 1. Clinical, electrodiagnostic and operative aspects // Intern. J. Lepr., 1970 - Vol.38. - N1. - P.12-29.

Недостатками этого способа являются: недостаточная эффективность способа из-за отсутствия возможности прогнозирования нарушения чувствительной и трофической функций периферических нервов, что в комплексе с двигательными нарушениями и лежит в основе тяжелых лепрозных нейропатий. Кроме того, недостатком известного способа является тот факт, что предложенный этими авторами критерий может быть использован только уже при наличии патологических изменений в нервных стволах. Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - повышение эффективности способа.

Известен также способ прогнозирования тяжелого течения полиневритов у больных лепрой, заключающийся в обнаружении в сыворотке крови больных лепрой антител к одному из нейромаркеров периферических нервов - церамиду. Показано, что высокий уровень антицерамидных антител у больных лепрой обнаруживается при прогрессирующей деструкции периферических нервов (Narayan R., Maheshwari Р.К., Desikan K.V. Harinath B.C. Detection of S-100 protein and anticeramide antibodies in leprosy patients by ELISA. Lepr.Rev. - 1997. - Vol.68. - №2. - Р.117-124).

Недостатками этого способа являются: недостаточная эффективность способа из-за отсутствия возможности прогнозирования тяжелого течения лепрозных невропатий; кроме того, недостатком известного способа является тот факт, что предложенный этими авторами критерий может быть использован только уже при наличии патологических изменений в нервных стволах. Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - повышение эффективности способа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования тяжелого течения полиневритов, предложенный Барановым Ю.Н., Евстратовой В.А., Подоплеловым В.И. «Пальцевая дерматоглифика у больных лепрой с тяжелый неврологическими нарушениями» («Актуальные вопросы лепрологии», Астрахань, 1984 г., с.90-93).

Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что в обоих способах применен генетический подход, основанный на изучении генетических особенностей человека.

Сущность этого способа состоит в определении особенностей пальцевого узора в зонах пальцевой иннервации локтевого и срединного нервов. Недостатками известного способа являются:

- недостаточная эффективность прогнозирования развития тяжелого течения полиневрита из-за сложности определения пальцевого узора у больных лепрой, обусловленной трофическими изменениями концевых фаланг пальцев кисти, что в итоге затрудняет проведение данного исследования;

- различия в трактовке результатов по половому признаку, что сужает диагностический диапазон данного способа.

Таким образом, перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат - повышение эффективности способа.

Периферическая нервная система у больных лепрой обычно в той или иной степени вовлекается в процесс, однако тяжелые неврологические нарушения развиваются не у всех больных. Не всегда имеется соответствие между тяжестью процесса на коже и поражением периферических нервов, а острые невриты могут возникать на фоне регресса высыпаний на коже (Аламдаров И.Н. «Учен. зап. Ин-та по изуч. лепры.», Астрахань, 1976, №9 (14), с.5-12). Кроме того, лечение противолепрозными препаратами, начатое даже у больных с начальными неврологическими проявлениями, не во всех случаях предупреждает прогрессирование лепрозных полиневритов, а также не всегда способствует регрессу уже имевшихся неврологических нарушений (Андросюк Ю.Г. «Клинико-диагностическое значение сывороточных маркеров в распознавании и прогнозировании течения лепрозных невропатий»: Автореф. дис.-канд. мед. наук. - Саратов, 2005. - 19 с.). Этот факт дает основание предположить, что развитие неврологических нарушений у больных лепрой во многом зависит от врожденных свойств организма.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение эффективности способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Предлагаемый способ состоит в том, что определяют генотип HLA-DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602/08 в крови больного и по его наличию прогнозируют тяжелое течение лепрозных полиневритов.

Таким образом, реализуется положительный результат изобретения, суть которого состоит в повышении эффективности способа.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК проводили по методу Higuchi (R.Higuchi H.Erlich «Using PCR to engineer DNA, In: PCR Technology», Stockton Press, New York, N.Y.,1989, P.61-70) с некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, взятой с ЭДТА в качестве антикоагулянта, смешивали в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл типа Эппендорф, содержащих 0,5 мл лизирующего раствора. Состав лизирующего раствора: 0,32 М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl буфера рН 7,5, 5 мМ MgCl₂, 1% Тритона Х-100 центрифугировали в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза промывали вышеуказанным раствором. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН 8,3; 2,5 мМ MgCl₂, 0,45% NP-40, 0,45% Твина-20 и 250 мкг/мл протеиназы К при 37°С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К нагреванием в твердотельном термостате при 95°С в течение 5 мин. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при - 20°С. Концентрация ДНК, определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-флуориметре (Hoefer, США), составляла от 50 до 100 мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 мин. Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2 мМ каждого из дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), 67 мМ Трис-HCl рН 8,8; 2,5 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, 0,1 мг/мл желатина, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Для предотвращения изменения концентраций компонентов реакционной смеси из-за образования конденсата реакционную смесь покрывали 20 мкл минерального масла. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере «Терцик» (ЗАО НПФ "ДНК-Технология", Москва).

Типирование локуса DRB1 проводили в два этапа. Во время первого раунда геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках. В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRB1 (праймеры DRBsen и DRBas), а во второй - пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR3, DR5, DR6, DR8 (праймеры DR3568s и DRBas). В обоих случаях температурный режим амплификации (для термоциклера «Терцик») был следующим:

1.	94°С - 1 мин
2.	94°С - 20 с	7 циклов
	67°С - 2 с
3.	92°С - 1 с	28 циклов
	65°С - 2 с

Полученные продукты разводили в 10 раз и использовали на втором раунде.

При амплификации на втором раунде использовали следующий температурный режим:

1.	92°С - 1 с	15 циклов
	64°С - 1 с

Типирование локуса DQA1 проводилось в два этапа. На первом раунде использовалась пара праймеров, амплифицирующая все специфичности локуса DQA1, а на втором раунде использовались пары праймеров, амплифицирующие следующие специфичности *0101, *0102, *0103, *0201, *0301, *0401, *0501, *0601.

Первый раунд проводили по программе:

1.	94°С - 1 мин
2.	94°С - 20 с	7 циклов
	58°С - 5 с
3.	92°С -1 с	5 сек	28 циклов
	56°С - 2 с

Продукты амплификации первого раунда разводили в 10 раз и использовали на втором раунде по следующей программе:

	93°С - 1 с	12 циклов
	62°С - 2 с

Типирование локуса DQB1 также проводилось в два этапа. На первом раунде использовали пару праймеров, амплифицирующую все специфичности локуса DQB1. Температурный режим был следующий:

1.	94°С - 1 мин
2.	94°С - 20 с	7 циклов
	67°С - 5 с
3.	93°С - 1 с	28 циклов
	65°С - 2 с

На втором раунде использовали пары праймеров, амплифицирующие следующие специфичности: *0201, *0301, *0302, *0303, *0304, *0305, *04, *0501, *0502, *0503, *0601, *0602/08. Продукты первого раунда разводили в 10 раз и проводили амплификацию в следующем температурном режиме:

1.	93°С - 1 с.	12 циклов
	67°С - 2 с

Электрофорез проводили при напряжении 200-250V в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Время проведения электрофореза: после окончания I этапа - 10 минут, после окончания II этапа - 20 минут. Продукты амплификации видны в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета в ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм на трансиллюминаторе (Fluorescent tables combi-light, France). В качестве маркера длин использовали перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp I.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицами (таблицы 1, 2, 3) и примерами.

Вывод: в таблице 1 показано, что у больных с тяжелым течением лепрозных полиневритов гаплотип HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602\08 встречается в 57,1% случаев, что существенно отличается от группы больных, не имеющих в своем генотипе данный гаплотип (23,8%).

В таблице 2, 3 представлено и видно, что длительность заболевания и возраст больных не оказывают влияния на достоверность результатов.

Вывод: в таблицах 2 и 3 показано, что развитие тяжелых полиневритов у больных лепрой не зависит от возраста и длительности заболевания.

Предлагаемый способ был апробирован на 42 больных, находящихся на лечении и диспансерном наблюдении в ФГУ НИИ по изучению лепры Росздрава, г.Астрахань, в течение 8 лет с 1999 г. по 2006 годы. Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1.

Больной К-ко, 1946 г.р. (история болезни №2662). Болен лепрой с 1957 года. В 1957 году впервые госпитализирован в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, пограничный туберкулоид (ВТ). Лепрозный процесс носил ограниченный характер. Гистологическое исследование показало признаки нисходящей трансформации процесса в лепроматозный тип. После курса химиотерапии был выписан на амбулаторное лечение. В 1963 году больной поступил с рецидивом заболевания: лепроматозный тип лепры. Периферическая нервная система не была вовлечена в специфический лепрозный процесс.

В период апробации способа проведено генетическое исследование. У больного брали кровь из вены в количестве 1,5 мл и определяли генотип и прогнозировали тяжелое течение полиневрита. Геномную ДНК выделяли из периферической крови методом высаливания по стандартной процедуре, указанной выше. Для типирования генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) использовали наборы HLA-ДНК-Тех (НПФ «ДНК-технология», Россия). Реакцию амплификации проводили на амплификаторе «Терцик» («ЗАО НПФ ДНК-Технология») по программам, указанным выше. Детекцию продуктов амплификации проводили при помощи электрофореза в 3% агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

После типирования у больного выявлен гаплотип HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602\08.

У больного неврологический статус характеризовался сгибательной контрактурой II и V пальца правой кисти и V и IV пальцев левой кисти, амиотрофией межкостных мышц, специфическим полиневритом с распространенными чувствительными, трофическими и двигательными нарушениями, сгибательной контрактурой всех пальцев кистей, анестезией до плечевых суставов и ягодичных складок. Периферические нервные стволы утолщены, болезненны. С осени 2001 г. резко ухудшилось состояние трофики тканей левой стопы. Объективно: левая стопа резко отечна, в области I пальца на дистальной фаланге имеются несколько свищевых ходов. Диагноз: Хронический специфический остеомиелит в стадии обострения. 16 сентября 2001 г. назначено оперативное вмешательство. Произведена секвестротомия концевой фаланги первого пальца левой стопы.

29 декабря 2001 г. усилились боли в области II пальца левой стопы. Диагноз: Остеомиелит II пальца левой стопы. Назначено оперативное вмешательство. 15.02.2001 г. произведена экзартикуляция II пальца левой стопы.

Таким образом, по наличию в крови у больного гаплотипа HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602\08 можно прогнозировать тяжелое течение лепрозного полиневрита с глубокими трофическими расстройствами.

Пример №2.

Больной Б-ов, 1956 г.р. (история болезни №3206). Болен лепрой с 1963 года. В 1964 году впервые госпитализирован в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Клинически заболевание характеризовалось наличием кольцевидных элементов в области ягодиц с нарушением чувствительности. На верхних и нижних конечностях все виды поверхностной чувствительности были сохранены. Гистологически: лепроматозный инфильтрат с наличием большого количества микобактерий лепры. Лепроминовая проба была отрицательной. С 1974 г. больной поступил с рецидивом заболевания и начали беспокоить лепрозные невриты.

Неврологический статус в 2000 г.: локтевые нервы утолщены, больше справа, справа нерв болезненный. Справа парестезии и гипостезии в зоне иннервации n.ulnaris на фоне полиневритического типа. Амиотрофические изменения не нарастают. Больному назначено специфическое лечение: витамины группы В, десенсибилизирующие, мочегонные, болеутоляющие средства, фонофорез с гидрокортизоном на область локтевых и малоберцовых нервов. Комплексное лечение привело к улучшению неврологического статуса.

Прогнозирование тяжелого течения лепрозного полиневрита осуществляли способом, описанным в примере №1. После типирования у больного выявлен гаплотип HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602\08.

В дальнейшем, несмотря на проводимую специфическую противолепрозную терапию и лечение невритов, у больного прогрессировало ухудшение неврологического статуса.

В ноябре 2001 г. больной стал предъявлять жалобы на периодические боли в руках стреляющего характера, онемение рук, снижение чувствительности на верхних и нижних конечностях. Объективно: локтевые и малоберцовые нервы утолщены при пальпации, болезненны, нарушение чувствительности по полиневритическому типу: на руках гипестезии до плечевых суставов, на ногах до коленных. Атрофия межкостных мышц кистей, стоп, m.thenar, m.hypothenar, мышц голеней, предплечья. Сгибательная контрактура средней фаланги V пальцев обеих кистей. В настоящее время неврологический статус характеризуется специфическим полиневритом с распространенными чувствительными, трофическими и двигательными нарушениями, амиотрофией межкостных мышц правой кисти, утолщением и болезненностью локтевых и малоберцовых нервов.

Таким образом, по наличию в крови у больного гаплотипа HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602\08 можно прогнозировать тяжелое течение лепрозного полиневрита.

Пример №3.

Больная К-ва Н.И., 1938 г.р. (история болезни №1813). Болеет лепрой с 1948 года. Первичный диагноз: лепра, туберкулоидный тип. В 1971 и 1973 годах госпитализирована в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с рецидивом заболевания с диагнозом: лепра, лепроматозный тип, специфический полиневрит с чувствительными и трофическими нарушениями. Клинически заболевание характеризовалось очаговой инфильтрацией на коже туловища, ягодиц, верхних и нижних конечностей. Локтевые нервы были умеренно утолщены, слегка болезненны, анестезия до верхней трети плеч, трофические язвы стоп. Больная неоднократно лечилась в стационаре НИИЛ по поводу лепрозного полиневрита.

Прогнозирование тяжелого течения лепрозного полиневрита осуществляли способом, описанным в примере №1.

После типирования у больной выявлен гаплотип HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602Y08.

В декабре 2000 года у больной неврологический статус характеризовался нарушением чувствительности по полиневритическому типу, атрофией межкостных мышц кистей, стоп, m.thenar, m.hypothenar, контрактурой основных и концевых фаланг I, III, IV, V пальцев левой кисти, мутиляцией II и V пальцев правой стопы, трофической язвой на подошвенной поверхности правой стопы. Локтевые нервы умеренно утолщены, слегка болезненны при пальпации. В настоящее время неврологический статус характеризуется специфическим полиневритом с распространенными чувствительными, трофическими и двигательными нарушениями, медленно-прогрессирующее течение.

Таким образом, по наличию в крови у больной гаплотипа HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602\08 можно прогнозировать тяжелое течение лепрозного полиневрита.

Пример №4.

Больная Д-ва А.А., 1940 г.р. (история болезни №2441). Болеет лепрой с 1955 года. В 1955 году впервые госпитализирована в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Неоднократно лечилась по поводу рецидивов заболевания, остеомиелита костей нижних конечностей.

Прогнозирование тяжелого течения лепрозного полиневрита осуществляли способом, описанным в примере №1.

После типирования у больной выявлен гаплотип HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602\08.

В июне 2000 г. больная стала предъявлять жалобы на боли в левой стопе при ходьбе. Объективно: на подошвенной поверхности левой стопы имелась трофическая язва с обильными серозно-гнойными выделениями. Больной было произведено хирургическое вмешательство, что привело к исчезновению язвы. В дальнейшем у больной нарастала симптоматика обострения и утяжеление течения специфического полиневрита. Неврологический статус характеризовался умеренным утолщением периферических нервных стволов, умеренной болезненностью при пальпации. На правой руке отсутствовал III палец, остальные на обеих руках в состоянии сгибательной контрактуры. На правой ноге отсутствуют IV и V пальцы, на левой II и V пальцы, остальные деформированы. На обеих стопах с подошвенной поверхности трофические язвы. Степпаж с обеих сторон. Атрофия мышц кистей, предплечий.

Таким образом, по наличию в крови больной гаплотипа HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602\08 можно прогнозировать тяжелое течение лепрозного полиневрита.

Пример №5.

Больная Ю-на-Г-ва, 1932 г.р. (история болезни №3008). Болеет лепрой с 1961 года. В 1961 году впервые госпитализирована в клинику НИИ по изучению лепры МЗ РФ с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Клинически заболевание характеризовалось очаговой и диффузной поверхностной инфильтрацией. Локтевые нервы были утолщены, поверхностные виды чувствительности снижены. Гистологически: лепроматозный инфильтрат с наличием огромного количества гомогенных и зернистых форм микобактерий лепры. Неврологический статус: Локтевые нервы слегка утолщены, больше справа, при пальпации безболезненны, остальные периферические нервы не утолщены, безболезненны при пальпации. Контрактур, мутиляций, трофических нарушений нет.

Прогнозирование тяжелого течения лепрозного полиневрита осуществляли способом, описанным в примере №1.

После типирования у больной выявлен гаплотип HLA DRB1-1-DQA1-0101-DQB1-0501.

За время наблюдения клинических признаков обострения лепрозной невропатии не зарегистрировано, периферические нервные стволы не утолщены, безболезненны.

Таким образом, отсутствие в крови больной гаплотипа HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602V08 не дает возможность прогнозировать тяжелое течение лепрозного полиневрита.

Пример №6.

Больная Ч-ва Т.А., 1937 г.р. (история болезни №3759). Болеет лепрой с 1959 года. В 1959 году впервые госпитализирована в Абинский лепрозорий с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Неоднократно поступала с рецидивом заболевания. Неврологический статус характеризовался утолщением и болезненностью левого локтевого нерва.

Прогнозирование тяжелого течения лепрозного полиневрита осуществляли способом, описанным в примере №1.

После типирования у больной выявлен гаплотип HLA DRB1-11-DQA1-0501-DQB1-0301. Неврологический статус на протяжении всех лет наблюдения характеризуется спокойным течением, периферические нервные стволы не утолщены, безболезненны.

Таким образом, отсутствие в крови больного гаплотипа HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602V08 не дает возможность прогнозировать тяжелое течение лепрозного полиневрита.

Применением предложенного способа по сравнению со способом-прототипом достигается положительный результат, заключающийся в повышении эффективности прогнозирования тяжелого течения лепрозных полиневритов. Повышение эффективности способа достигается определением конкретного иммуногенетического маркера, определяющего тяжесть течения полиневритов, и может быть использован на всех стадиях лепрозного процесса, как на самых ранних, включая субклиническую стадию, так и на отдаленных стадиях антибактериальной терапии, а также возможностью предупреждения тяжелого поражения нервной системы больного лепрой с помощью своевременных лечебных и реабилитационных мероприятий.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагаемый способ прогнозирования тяжелого течения лепрозных полиневритов у больных лепрой.

Предлагаемый способ может быть рекомендован к клиническому использованию в противолепрозных учреждениях и неврологических клиниках для прогнозирования тяжести течения полиневритов.

Таблица 1
Распределение частоты гаплотипов у больных лепрой с полиневритами
DRB1-DQA1-DQB1	Больные лепрой (n=133)	Больные лепрой с тяжелыми полиневритами (n=21)	Больные лепрой с чувствительными нарушениями (n=21)
4-0301-0302	13,8	9,5	14,3
4-0301-0301	7,8	9,5	4,8
7-0201-0201	16,4	9,5	14,3
8-0401/2-0401/02	5,2	14,3	14,3
11-0501-0301	21,6	19,0	38,1
12-0501-0301	1,7	4,8	-
13-0501-0301	9,5	9,5	14,3
13-0102-0602/08	12,1	23,8	9,5
13-0103-0602/08	12,3	4,8	-
15-0102-0602/08	31,9	57,1*	23,8
16-0102-0502/04	15,1	14,3	4,8
17-0501-0201	13,5	14,3	4,8
*- р<0,05 - достоверное различие между группами больных

Таблица 2
Длительность заболевания	Больные лепрой с тяжелыми полиневритами (n=21)	Больные лепрой с чувствительными нарушениями (n=21)
0-10 л	5,6%	3,0%
10-20 л	5,6%	6,1%
20-30 л	5,6%	6,1%
30-40 л	11,1%	18,2%
40-50 л	38,9%	33,3%
50-60 л	44,4%	38,7%

Таблица 3
Возраст больного	Больные лепрой с тяжелыми полиневритами (n=21)	Больные лепрой с чувствительными нарушениями (n=21)
40-50 л	2,7%	3,3%
50-60 л	10,8%	13,3%
60-70 л	37,8%	40,0%
70-80 л	40,5%	36,7%

Способ прогнозирования тяжелого течения лепрозных полиневритов, состоящий в исследовании генотипа больных лепрой, отличающийся тем, что определяют гаплотип генотипа HLA DRB1-15-DQA1-0102-DQB1-0602\08 в крови больного и по его наличию прогнозируют тяжелое течение лепрозных полиневритов.