Фармацевтическая композиция, используемая для мобилизации стволовых клеток
Патент 2351357
Авторы
Правообладатели
Классы МПК
Фармацевтическая композиция, используемая для мобилизации стволовых клеток
Изобретение относится к медицине и биохимии и касается комбинированного фармацевтического препарата, содержащего G-CSF и P1GF в качестве активных веществ. Изобретение обеспечивает синергический эффект в мобилизации стволовых клеток крови у пациента или у нуждающегося в этом субъекта. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 11 табл.
Реферат
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к смеси биологически активных молекул, используемых в мобилизации стволовых клеток крови у пациента или у нуждающегося в этом субъекта. В частности, в настоящем изобретении представлена смесь гранулоцитарного колониестимулирующего фактора G-CSF и плацентарного фактора роста PlGF, особенно эффективная в стимулировании мобилизации клеток-предшественников периферической крови (КППК), увеличивающая тем самым возможность осуществления и эффективность органной или клеточной трансплантации и протоколов радиохимиотерапии у онкологических пациентов.
ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Аутологичные КППК значительно расширили показания, возможности осуществления и эффективность высоких доз радиохимиотерапии и трансплантации аутологичных стволовых клеток (ТСК)1,2 среди больных с неходжкинской лимфомой (НХЛ)3, рецидивом ходжкинской лимфомы (ХЛ)4, а также множественной миеломой (ММ)5.
Аллогенные КППК представляют собой предпочтительный источник стволовых клеток для совпадающих по HLA-антигенам ТСК и уникальный источник для не совпадающих по HLA аллотрансплантатов6,7,8,9,10,11, которые потенциально являются эффективной терапией для пациентов с высоким риском развития лейкозов, не имеющих близких по HLA-антигенам родственных или неродственных доноров, то есть приблизительно для 40% общего числа пациентов, которым может быть полезна аллогенная трансплантация.
Протоколы, используемые для мобилизации аутологичных КППК у онкологических пациентов, включают в себя применение миелоидных факторов роста отдельно, или совместно со средствами, позволяющими достичь оптимальной мобилизации КППК, в течение восстановительного периода после цитотоксической химиотерапии12,13,14. Мобилизация аллогенных КППК, полученных от здоровых доноров, обычно достигается короткими курсами рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (rhG-CSF) в интервале доз от 10 до 20 мкг/кг/в день15,16,17,18.
У онкологических пациентов, которым производили аутотрансплантацию ≥5×106 CD34+клеток/кг, происходило быстрое и длительное гематопоэтическое приживление, тогда как пациенты, составившие группу риска в отношении замедленного приживления, отсутствия приживления или вторичной миелодисплазии19, получали ≤2×106 CD34+клеток/кг. Поэтому существенным необходимым предварительным условием для проведения аутологичной ТСК является доступность адекватных количеств клеток CD34+. У значительной части не подвергавшихся химиотерапии (от 10 до 20%) или рецидивирующих/невосприимчивых (от 30 до 40%) онкологических пациентов не происходит мобилизации оптимальных количеств клеток CD34+ как вследствие предшествующей обширной радиохимиотерапии, так и факторов, связанных с болезнью 20,21,22.
Накопление адекватного количества аллогенных клеток CD34+ не является критической проблемой у реципиентов, идентичных по HLA, трансплантатов; однако от 5 до 15% нормальных доноров проявляют слабую мобилизацию стволовых клеток требуют увеличенных доз rhG-CSF и проведения многократных процедур афереза23,24,25. После несовпадающей по HLA аллотрансплантации реципиентам требовалась реинфузия «мега» доз CD34+ клеток без Т-лимфоцитов для предотвращения отторжения трансплантата и тяжелой реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD)26. При стандартном режиме мобилизации (то есть при 7-дневном курсе rhG-CSF) доноры несовпадающих по HLA ТСК подвергались в среднем 4-кратному лейкаферезу для забора дозы клеток-мишеней - клеток CD34+ (12×106 CD34+клеток/кг веса тела), при том, что значительный процент доноров (от 20 до 25%) не способен обеспечить дозу клеток-мишеней CD34+.
Несмотря на то, что возраст, пол, схема лечения цитокинами, а также предшествующая радиохимиотерапия может влиять на мобилизацию стволовых клеток27,28,29, не было выявлено никаких определенных характеристик, являющихся прогностическими факторами для мобилизации цитокинов. Поэтому предполагается, что любая процедура, применимая к онкологическим пациентам или нормальным донорам и способствующая увеличению выработки циркулирующих клеток-предшественников при отсутствии дополнительной токсичности, будет играть существенную роль в возможности осуществления, снижения токсичности и стоимости как аутологичной, так и аллогенной ТСК.
Увеличение мобилизации КППК может быть достигнуто путем использования молекул, способных к интерференции, по механизму (механизмам) регуляции направленной миграции гематопоэтических стволовых клеток, то есть трансмиграции через просвет эндотелия к экстраваскулярным промежуткам костного мозга в хоминге и обратно при мобилизации30,31,32,33. Один дополнительный подход для усиления мобилизации КППК основан на использовании комбинаций цитокинов, таких как рекомбинантный человеческий (rh) гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (rhGM-CSF) вместе с rhG-CSF34, интерлейкин-3 (rhIL-3) вместе с rhG-CSF или rhGM-CSF35, и PIXY-32136. Наконец, усиление мобилизации КППК может быть достигнуто путем включения в стандартный режим мобилизации цитокинов раннего действия, таких как фактор стволовых клеток (rhSCF)37,38 лиганд flt-339, способствующих росту костномозговых клеток-предшественников, таким образом увеличивая количество клеток, восприимчивых к последующей мобилизации rhG-CSF.
До сих пор и заменители, и средства, дополняющие rhG-CSF, не могли значительно усилить мобилизацию клеток-предшественников крови, достигаемую только под действием rhG-CSF, или приводили к ограниченному улучшению, сводившемуся к нулю значительным увеличением токсичности.
Плацентарный фактор роста (PlGF) является членом семейства сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и действует как ангиогенный амплификатор, передавая сигнал через рецептор-1 VEGF (VEGFR1). В последнее время показано, что введение аденовирусного вектора, экспрессирующего человеческий (h) PlGF, вызывает сложные гематопоэтические эффекты, включая усиление восстановления костного мозга после миелосупрессии и мобилизацию гематопоэтических клеток-предшественников. Однако введение факторов роста после инъекции рекомбинантных аденовирусных векторов имеет несколько основных отличий от непосредственной инъекции очищенного фактора, и невозможно прогнозировать эффект, когда факторы роста вводятся согласно методикам, используемым в клинических условиях.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вследствие существенного клинического воздействия любой процедуры, способной повысить мобилизацию стволовых клеток, авторы изобретения тестировали мобилизующую активность PlGF в экспериментах на животных моделях, позволяющих стимулировать мобилизацию КППК, как это происходит в клинической ситуации. Нормальным мышам BALB/c внутрибрюшинно (в/б) в течение 5 дней вводили либо контрольный носитель, забуференный фосфатом солевой раствор/метансульфоновая кислота (PBS/MSA), отдельно rhG-CSF (10 мкг/д), либо комбинацию rhG-CSF (10 мкг/д) и рекомбинантного мышиного (rm)PlGF (2,5-5 мкг/д). Через 2 часа после последнего введения цитокинов осуществляли забор проб крови и оценивали следующие параметры: количество белых клеток крови (WBC), частота экспрессии и абсолютное количество колониеобразующих клеток (CFC), абсолютное количество клеток-стимуляторов долговременной культуры (LTC-IC).
Действие rmPlGF показано ниже в Таблицах 1-4. Очевидно, что отдельно введенный rmPlGF не оказывает никакого эффекта на мобилизацию WBC, CFC и LTC-IC. Введение rmPlGF (5 мкг/д) в сочетании с rhG-CSF в течение 5 дней значительно повышает мобилизацию CFC и LTC-IC по сравнению с изолированным введением rhG-CSF.
Кроме того, на модели приматов (макак Резус) тестировали мобилизирующую активность комбинаций PlGF/G-CSF. В дальнейшем полученные на мышах результаты подтвердились на этой экспериментальной животной модели. В частности, комбинация PlGF/G-CSF повышала мобилизацию WBC, CFC, колониеобразующих клеток с высоким пролиферативным потенциалом (HPP-CFC) и LTC-IC, в терминах кинетики, частоты экспрессии и абсолютных количеств.
Вышеупомянутое исследование проводили с использованием манипуляций и условий, которые очень сходны с введением гематопоэтических факторов роста больному человеку. Результаты ясно показывают наличие синергического эффекта hG-CSF и rhPlGF в мобилизации клеток-предшественников периферической крови.
В этой связи, объектом настоящего изобретения является комбинированный препарат G-CSF и PlGF, полезный для стимуляции мобилизации стволовых клеток крови у пациента или у нуждающегося в этом субъекта. Используемые в настоящем описании термины "пациент" и "субъект" предпочтительно относятся к человеку, но они могут относиться также и к животным, в частности к млекопитающим. Примеры симптомов, состояний или заболеваний, при которых может быть эффективна мобилизация стволовых клеток крови, включают в себя органную или клеточную трансплантацию и радиохимиотерапию опухолей, в частности, аутологичную1,2 или аллогенную ТСК у больных с НХЛ, рецидивом ХЛ4, (ММ)5 или на стадии восстановления после миелосупрессивной химиотерапии, не ограничиваясь перечисленным.
Активные компоненты комбинированного препарата можно вводить одновременно или раздельно в составе с фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями. Парентеральный путь введения является предпочтительным. Способы приготовления фармацевтических композиций, подходящих для парентерального введения, известны в данной области техники; подробности можно найти в "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Mack Publishing Со. Согласно настоящему изобретению количество активных компонентов в комбинированных препаратах может изменяться в зависимости, например, от пути введения, от искомого эффекта или состояния, которое намереваются лечить, и от ответной реакции пациента. Является общим правилом, что эффективное количество G-CSF и PlGF способно вызвать желательную реакцию в плане мобилизации стволовых клеток крови. В ходе лечения можно осуществлять мониторинг ответа пациента/субъекта, например, путем подсчета стволовых клеток циркулирующей крови и, при необходимости, соответственно менять дозировки. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантный hG-CSF и rhPlGF используются в форме растворов для инъекций, обеспечивающих ежедневное количество активных веществ, содержащих G-CSF от 1 до 150, предпочтительно от 5 до 20 мкг/кг и PIGF от 10 до 300, предпочтительно от 20 до 150 мкг/кг.
Далее следующие примеры поясняют настоящее изобретение.
ПРИМЕРЫ 1-11 - активирующие эффекты объединения PIGF/G-CSF на модели мыши
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Животные. Самки мышей BALB/c в возрасте от шести до 8-недель, с весом тела от 20 до 25 г, были получены от Charles River (Milano, Italy, EU). Экспериментальные манипуляции, выполнявшиеся на животных, проводились в соответствии с руководящими принципами Координационного Комитета Великобритании по онкологическим исследованиям (UK Coordinating Committee on Cancer Research. UKCCCR guidelines for the welfare of animals in experimental neoplasia. Br. J. Cancer., 58:109-113, 1998). Ежедневно, внутрибрюшинно (в/б), в течение 5 дней, мышам вводили в качестве контрольного носителя (PBS/MSA), изолированно rhG-CSF (10 мкг/д), или rhG-CSF (10 мкг/д) вместе с рекомбинантным мышиным (rm)PlGF (2,5-5 мкг/д). Каждый эксперимент проводили по меньшей мере в три отдельных приема и на каждую группу в каждой временной точке использовали от трех до четырех мышей.
Цитокины. Рекомбинантный гранулоцитарный человеческий колониестимулирующий фактор (rhG-CSF, Neupogen®) приобретали у Roche (Milan, Italy, EU); rmPlGF был приобретен в R&D Systems Inc., Abingdon, United Kingdom); наличие rhPIGF было обеспечено Geymonat SpA (Anagni, Italy, EU).
Протоколы мобилизации. Стандартный протокол мобилизации включал в себя однократное ежедневное введение мышам BALB/c rhG-CSF (10 мкг/мышь, в/б) в течение 5 дней. Для оценки эффектов мобилизации под действием PIGF, rmPlGF (2,5-5 мкг/мышь, в/б) вводили однократно ежедневно в течение 5 дней либо в качестве единственного средства, либо совместно с rhG-CSF. Контрольным группам производили инъекции PBS/MSA.
Параметры мобилизации. Мобилизацию оценивали путем подсчета лейкоцитов (WBC), частоты экспрессии и абсолютных количеств колониеобразующих клеток (CFC) и абсолютного количества клеток-стимуляторов долговременной культуры (LTC-IC). Если не оговорено особо, животных забивали через два часа после последнего введения.
Получение и сепарация клеток. ПК отбирали в содержащие гепарин пробирки из орбитального сплетения. После подсчета лейкоцитов (WBC) ПК разбавляли в объемном отношении 1:4 PBS и мононуклеарные клетки (МНК) отделяли центрифугированием (280 g, 30 минут, при комнатной температуре) в непрерывном градиенте плотности Фиколла. После этого клетки дважды промывали в питательной среде Dulbecco, модифицированной по способу Iscove (IMDM, Seromed, Berlin, Germany, EU), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada), 2 ммоль L-глутамина и антибиотиков.
Подсчет WBC. Подсчет WBC проводили, используя обработанную гепарином кровь и автоматизированный счетчик (ADVIA 120, Bayer, Milano, Italy, EU).
Анализ колониеобразующих клеток (CFC). Все колониеобразующие клетки (CFC), т.е. гранулоцитарно-макрофагальные колониеобразующие единицы (CFU-GM), ранние эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и линиенеспецифические колониеобразующие единицы (CFU-GEMM) оценивались суммарно в стандартной метилцеллюлозной культуре. Кратко, 1 мл аликвотного количества крови (от 5×104 до 2×105 МНК) высевали в чашках Петри (размером 35 мм) в питательной среде на основе метилцеллюлозы (НСС-3434; Stem Cell Technologies) с добавлением рекомбинантного мышиного (rm) фактора стволовых клеток (rmSCF, 50 нг/мл), рекомбинантного мышиного (rm) интерлейкина-3 (rmIL-З, 10 нг/мл), рекомбинантного человеческого (rh) интерлейкина-6 (rhIL-6, 10 нг/мл) и рекомбинантного человеческого (rh) эритропоэтина (rhEpo, 3 Ед/мл). Колонии подсчитывались согласно стандартным критериям после 12-14 дней инкубации при 37°С во влажной атмосфере с содержанием в воздухе 5% CO2 (Humphries, R.К. et al., Blood, 53:746-763, 1979).
Анализ клеток-стимуляторов долговременной культуры (LTC-IC). LTC-IC оценивали в смешанной культуре (Carlo-Stella С, et al. Blood. 1999; 93:3973-82). Кратко, в полной питательной среде (MyelocultTM 5100, Stem Cell Technologies) тестируемые клетки (5-8×106) ресуспендировали и высевали в культуры, содержащие фидер из облученных (2000 сГи) мышиных клеток AFT024 (любезно предоставленных Dr. К. Moore, Princeton University, Princeton, NJ, USA) (Moore КА, et al., Blood. 1997;89:4337-47).
Полная питательная среда состояла из альфа-среды с добавлением FBS (12,5%), лошадиной сыворотки (12,5%), L-глутамина (2 ммоль), 2-меркаптоэтанола (10-4 моль), инозита (0,2 ммоль), фолиевой кислоты (20 мкмоль) вместе со свежим раствором гидрокортизона (10-6 моль). Культуры еженедельно подпитывались путем замены половины среды для выращивания на свежую полную питательную среду. После 4 недель культивирования неадгезивные клетки и адгезивные клетки, полученные путем обработки трипсином, смешивали, промывали и совместно анализировали на предмет наличия клоногенных клеток в метилцеллюлозных культурах. Общее количество клоногенных клеток (а именно, CFU-GEMM плюс BFU-Е плюс CFU-GM), присутствующее в 4-недельной долговременной культуре (LTC), определяет относительный показатель количества LTC-IC, изначально представленных в тестируемой суспензии. Абсолютные количества LTC-IC рассчитывали путем деления общего количества клоногенных клеток на 4, что является средним выходом клоногенных клеток из LTC-IC (Sutherland HJ, et al., Blood. 1989;74:1563-70).
ПРИМЕР 1
| Таблица 1 Подсчет лейкоцитов у мышей после введения rmPlGF и/или rhG-CSF | ||
| Режим мобилизации* | WBC/мкл крови | |
| Средние значения (диапазон) | Среднее значение ± СО (стандартное отклонение) | |
| PBS/MSA | 2000 (850-4000) | 2165±929 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) | 6000 (5200-21650) | 9577±5575 |
| rmPlGF (5 мкг/д) | 2450 (1350-2950) | 2450±141 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (2,5 мкг/д) | 5600 (4600-13700) | 7040±3778 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (5 мкг/д) | 9500 (4800-18400) | 9980±5715 |
*Мышам BALB/c в течение 5 дней внутрибрюшинно (в/б) вводили либо PBS/MSA, либо отдельно rhG-CSF (10 мкг/д), либо совместно rhG-CSF (10 мкг/д) и rmPlGF (2,5-5 мкг/д). Пробы крови отбирали через 2 часа после последнего введения rmPlGF и/или rhG-CSF.
ПРИМЕР 2
| Таблица 2 Частота экспрессии циркулирующих CFC у мышей после введения rmPlGF и/или rhG-CSF | ||
| Режим мобилизации* | WBC/мкл крови | |
| Средние значения (диапазон) | Среднее значение ± СО (стандартное отклонение) | |
| PBS/MSA | 7(2-15) | 8±3 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) | 76 (51-148) | 82±29 |
| rmPlGF (5 мкг/д) | 8 (7-9) | 8±1 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (2,5 мкг/д) | 115 (93-184) | 130±37 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (5 мкг/д) | 195 (113-253) | 180±58 |
*Мышам BALB/c в течение 5 дней внутрибрюшинно (в/б) вводили либо PBS/MSA, либо отдельно rhG-CSF (10 мкг/д), либо совместно rhG-CSF (10 мкг/д) и rmPlGF (2,5-5 мкг/д). Пробы крови отбирали через 2 часа после последнего введения rmPlGF и/или rhG-CSF. CFC включают в себя гранулоцитарно-макрофагальную колониеобразующую единицу (CFU-GM), эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и полипотентную колониеобразующую единицу (CFU-Mix). Данные о CFC получены на четырехкратно пересеянных культурах на основе проб от каждого животного.
ПРИМЕР 3
| Таблица 3 Абсолютное количество циркулирующих CFC у мышей после введения rmPlGF и/или rhG-CSF | ||
| Режим мобилизации* | WBC/мкл крови | |
| Средние значения (диапазон) | Среднее значение ± СО (стандартное отклонение) | |
| PBS/MSA | 57 (9-288) | 81±75 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) | 3129 (1042-5518) | 2977±1126 |
| RmPlGF (5 мкг/д) | 96 (87-105) | 96±13 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (2,5 мкг/д) | 2568 (1480-5885) | 3198±1928 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (5 мкг/д) | 6143 (2486-11520) | 6015±3674 |
*Мышам BALB/c в течение 5 дней внутрибрюшинно (в/б) вводили в виде инъекции либо PBS/MSA, либо только rhG-CSF (10 мкг/д), либо совместно rhG-CSF (10 мкг/д) и rmPlGF (2,5-5 мкг/д). Пробы крови забирали через 2 часа после последнего введения rmPlGF и/или rhG-CSF. CFC включают в себя гранулоцитарно-макрофагальную колониеобразующую единицу (CFU-GM), ранние эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и полипотентную колониеобразующую единицу (CFU-Mix). Данные о CFC получены на четырехкратно пересеянных культурах на основе проб от каждого животного. Абсолютным количеством циркулирующих в крови CFC является показатель частоты экспрессии CFC, умноженный на общее количество МНК/мл крови.
ПРИМЕР 4
| Таблица 4 Абсолютное количество циркулирующих LTC-IC у мышей после введения mPlGF и/или rhG-CSF | ||
| Режим мобилизации* | WBC/мкл крови | |
| Средние значения (диапазон) | Среднее значение ± СО (стандартное отклонение) | |
| PBS/MSA | 7 (3-29) | 9±5 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) | 194 (57-337) | 208±98 |
| RmPlGF (5 мкг/д) | 4 (3-5) | 4±2 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (2,5 мкг/д) | 565 (279-852) | 565±405 |
| rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (5 мкг/д) | 1173 (852-2070) | 1365±364 |
*Мышам BALB/c в течение 5 дней внутрибрюшинно (в/б) вводили либо PBS/MSA, либо только rhG-CSF (10 мкг/д), либо совместно rhG-CSF (10 мкг/д) и rmPlGF (2,5-5 мкг/д). Пробы крови забирали через 2 часа после последнего введения rmPlGF и/или rhG-CSF. Абсолютное количество циркулирующих LTC-IC анализировали в смешанной культуре. Тестируемые клетки (5-8×106) высевали в культуры, содержащие фидер из облученных мышиных клеток AFT024. После 4 недель культивирования полученные путем трипсинизации неадгезивные клетки и адгезивные клетки смешивали, промывали и совместно анализировали на клоногенные клетки. Общее количество клоногенных клеток (т.е. CFU-Mix плюс BFU-Е плюс CFU-GM), присутствующее в 4-недельной LTC, определяет относительный показатель количества LTC-IC, изначально представленных в тестируемой суспензии. Абсолютным количеством LTC-IC в крови является показатель частоты экспрессии LTC-IC, умноженный на общее количество МНК/мл крови.
ПРИМЕРЫ 5-11 - Активирующие эффекты объединения PIGF/G-CSF на модели приматов
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Схема эксперимента. Группе макак Резус (n=4) вначале для мобилизации отдельно вводили G-CSF (100 мкг/кг/ в день, подкожно (п/к), в течение 5 дней) (цикл 1) и после 6-недельного периода выведения им проводили вторую мобилизацию, состоящую из rhPlGF (130 мкг/кг, внутривенно (в/в), в течение 5 дней) совместно с rhG-CSF (100 мкг/кг/ в день, п/к, в течение 5 дней) (цикл 2). После дополнительного 6-недельного периода выведения у той же группы макак применяли третий цикл мобилизации, состоящий из rhPlGF (260 мкг/кг, ВВ, в течение 5 дней) плюс rhG-CSF (100 мкг/кг/ в день, ПК, в течение 5 дней) (цикл 3). Согласно схемам исследований, кинетика мобилизации после цикла 1 послужила внутренней контрольной группой у макак для оценки мобилизации во время циклов 2 и 3.
Параметры мобилизации. Авторы анализировали кинетику мобилизации белых клеток крови (WBC), а также частоту экспрессии и абсолютные количества коммиттированных колониеобразующих клеток (CFC), колониеобразующих клеток с высоким пролиферативным потенциалом (HPP-CFC) и клеток-стимуляторов долговременной культуры (LTC-IC). Параметры мобилизации анализировали ежедневно в течение периода введения (дни от 1 до 5), и на 3 и 5 дни после прекращения введения. Пробы периферической крови забирали из бедренной вены приматов с применением асептики после анестезии (кетамин, 10 мг/кг, внутримышечно).
Подсчет WBC. Подсчет WBC производили, используя обработанную ЭДТА кровь и автоматизированный счетчик (ADVIA 120, Bayer, Milano, Italy, EU).
Анализ CFC и HPP-CFC. Общее количество CFC [т.е. гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц (CFU-GM), х эритроидных предшественников, образующих «взрывообразные» колонии (BFU-E) и линиенеспецифических (гранулоцитарных, эритроцитарных, макрофагальных, мегакариоцитарных) колониеобразующих единиц CFU (CFU-GEMM)] и HPP-CFC анализировали, используя гепаринизированную кровь согласно вышеописанной технологии (41, 42). Кратко, мононуклеарные клетки (МНК), полученные путем центрифугирования в непрерывном градиенте Фиколла (плотность=1,077 г/мл) четырехкратно пересевали (от 1×104 до 2×105 на мл) в чашках Петри размером 35 мм в питательной среде на основе метилцеллюлозы (НСС-4100, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) с добавлением рекомбинантного человеческого фактора стволовых клеток (rhSCF, 50 нг/мл, Stem Cell Technologies), интерлейкина-3 (rhIL-3, 20 нг/мл, Stem Cell Technologies), интерлейкина-6 (rhIL-6, 20 нг/мл, Stem Cell Technologies), rhG-CSF (20 нг/мл, Stem Cell Technologies), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (rhGM-CSF, 20 нг/мл, Stem Cell Technologies), и эритропоэтина (rhEpo, 3 Ед/мл, R&D Systems Inc, Abingdon, United Kingdom). Подсчет CFC проводили после 12-14 дней инкубации (37°С, 5% СО2) согласно стандартным критериям. НРР-CFC, определяемые как макроскопически видимые колонии > 1 мм в диаметре при компактном росте колоний, подсчитывали после 28 дней инкубации в метилцеллюлозных культурах с добавлением rhSCF (50 нг/мл), rhIL-3 (20 нг/мл), rhIL-6 (20 нг/мл), rhG-CSF (20 нг/мл), rhGM-CSF (20 нг/мл), и rhEpo (3 Ед/мл) (43). Абсолютным количеством циркулирующих в крови CFC или НРР-CFC является показатель частоты экспрессии CFC или НРР-CFC, умноженный на общее количество МНК на мл крови.
Анализ LTC-IC. Частоту экспрессии LTC-IC оценивали в условиях серийных разведений (44). Кратко, последовательные разведения тестируемых клеток (от 2×105 до 3×103) ресуспендировали в 150 мкл полной питательной среды (MyelocultTM 5100, Stem Cell Technologies), состоящий из альфа-среды с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки (12,5 %), лошадиной сыворотки (12,5 %), L-глутамина (2 ммоль), 2-меркаптоэтанола (10-4 моль), инозита (0,2 ммоль), фолиевой кислоты (20 мкмоль) вместе со свежим раствором гидрокортизона (10-6 моль) и высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты. Для каждой дозы тестируемых клеток высевали от 16 до 22 репликаций. Тестируемые клетки высевались в чашки, содержащие фидерный слой из облученных (8,000 сГи) мышиных клеток М2-10В4 (3 х 104/см2, любезно предоставленных Dr. С. Eaves, Terry Fox Laboratory, Vancouver, Canada), полученных путем переноса ретровирусного гена с целью выработки человеческого IL-3 и G-CSF (45). Культуры еженедельно подпитывали путем замены половины среды растущих клеток свежей полной питательной средой. После 5 недель культивирования неадгезивные и адгезивные клетки из индивидуальных лунок, полученные в результате трипсинизации, промывали и совместно анализировали на рост CFC. После периода инкубации от 12 до 14 дней культуры оценивались как положительные (≥ колоний) или отрицательные (отсутствие колоний) и частоту экспрессии LTC-IC подсчитывали с использованием программного обеспечения L-Calc (Stem Cell Technologies). Абсолютные количества циркулирующих LTC-IC оценивали в смешанной культуре (46). Кратко, тестируемые клетки (5-8×106) ресуспендировали в полной питательной среде и высевали в культуры, содержащие фидерный слой из облученных мышиных клеток М2-10В4 (3×104/см2). Через 5 недель культивирования неадгезивные клетки и адгезивные клетки, полученные путем трипсинизации, смешивали, промывали и совместно анализировали на клоногенные клетки. Общее количество клоногенных клеток (а именно, CFU-GEMM плюс BFU-Е плюс CFU-GM), присутствующее в 5-недельной долговременной культуре (LTC), определяет относительный показатель количества LTC-IC, изначально представленных в тестируемой суспензии. Абсолютное количество LTC-IC в крови рассчитывали путем деления общего количества клоногенных клеток на 4, что является средним выходом клоногенных клеток на LTC-IC.
ПРИМЕР 5
Циркулирующие WBC. Введение только rhG-CSF в течение 5 дней вызывало в среднем 5-кратное увеличение средних количеств (±СО) WBC по сравнению с их количеством до введения. Добавление 130 или 260 мкг/кг rhPlGF к rhG-CSF приводило к незначительному увеличению количества WBC, определяемому на 5 день введения.
| Таблица 5 Подсчет WBC у макак Резус после введения только rhG-CSF или введения rhPIGF вместе с rhG-CSF | |||
| Число WBC на мкл крови* | |||
| Цикл 1 | Цикл 2 | Цикл 3 | |
| День | rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) | rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней rhG-CSF + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) | rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) |
| 1 | 8708±2458 | 13498±5514 | 8370±1585 |
| 2 | 31313±3889 | 24533±2789 | 41180±7364 |
| 3 | 40600±6274 | 35388±2207 | 44085±6588 |
| 4 | 43055±6562 | 39440±6744 | 37960±3598 |
| 5 | 43523±13790 | 60040±9508 | 49048±7120 |
| 8 | 14363±4163 | 23073±9017 | 17783±5964 |
| 10 | 12145±5421 | 16398±8314 | 11150±2915 |
*У макак Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1-5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, и с 1 по 5 день) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество WBC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО.
ПРИМЕР 6
Частота экспрессии CFC. По сравнению с исходными значениями, средняя частота экспрессии CFC в крови (на 105 МНК), зарегистрированная на пике, увеличилась в 19, 53 и 52 раза при введении только rhG-CSF, rhG-CSF/rhPlGF (130 мкг/кг) и rhG-CSF/rhPlGF (260 мкг/кг) соответственно. По сравнению с введением только rhG-CSF, совместное введение rhPlGF/rhG-CSF вызвало 2-кратное увеличение частоты экспрессии CFC в пиковый день.
| Таблица 6 Частота экспрессии циркулирующих CFC у макак Резус после введения только rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF | |||
| CFC/105 МНК* | |||
| Цикл 1 | Цикл 2 | Цикл 3 | |
| День | rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) | rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней rhG-CSF + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) | rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) |
| 1 | 6±1 | 4±1 | 5±3 |
| 2 | 4±2 | 9±1 | 19±8 |
| 3 | 9±1 | 39±13 | 48±26 |
| 4 | 114±51 | 213±87 | 245±151 |
| 5 | 63±26 | 196±26 | 261±83 |
| 8 | 66±11 | 40±11 | 60±39 |
| 10 | 10±7 | 19±10 | 21±18 |
*У макак Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации, с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhP1GF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1-5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhP1GF (260 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день) с rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество CFC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО. CFC включают в себя гранулоцитарно-макрофагальную колониеобразующие единицы (CFU-GM), ранние эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и полипотентные колониеобразующие единицы (CFU-Mix). Данные о CFC получены после четырехкратного пассирования проб от каждого животного.
ПРИМЕР 7
Абсолютные значения CFC. Абсолютным количеством циркулирующих в крови CFC является показатель частоты экспрессии CFC, умноженный на общее количество MNC в мл крови. По сравнению с исходными значениями, введение только rhG-CSF, введение rhG-CSF/rhPlGF (130 мкг/кг) и rhG-CSF/rhPlGF (260 мкг/кг) приводило соответственно к 85-, 335 и 358-кратному увеличению CFC. В циклах 2 и 3 пиковые уровни CFC возросли в 4 и 5 раз по сравнению с циклом 1 (отдельное введение rhG-CSF).
| Таблица 7 Абсолютные количества циркулирующих CFC у макак Резус после отдельного введения rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF | |||
| CFC на мл крови* | |||
| Цикл 1 | Цикл 2 | Цикл 3 | |
| День | rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) | rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней rhG-CSF + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) | rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) |
| 1 | 134±9 | 138±38 | 170±129 |
| 2 | 344±207 | 724±254 | 6552±4365 |
| 3 | 472±60 | 6420±4775 | 9634±7006 |
| 4 | 11406±4093 | 32347±14206 | 53002±25250 |
| 5 | 5397±3074 | 46283±8287 | 60777±8563 |
| 8 | 3952±2666 | 4532±3714 | 3719±1899 |
| 10 | 224±164 | 448±168 | 943±994 |
*У мака Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1-5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество CFC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО. CFC включают в себя гранулоцитарно-макрофагальные колониеобразующие единицы (CFU-GM), ранние эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и полипотентные колониеобразующие единицы (CFU-Mix). Данные о CFC получены после четырехкратного пассирования проб от каждого животного. Абсолютным количеством циркулирующих в крови CFC является показатель частоты экспрессии CFC, умноженный на общее количество МНК на мл крови.
ПРИМЕР 8
Частота экспрессии HPP-CFC. По сравнению с исходными данными, средние значения частоты экспрессии в крови HPP-СРС (на 105 МНК), зарегистрированные на 5 день мобилизации, возросли в 5 и в 12 раз после введения только rhG-CSF или введения rhG-CSF/rhPlGF (130 мкг/кг) соответственно. По сравнению с отдельным введением rhG-CSF, совместное введение rhPlGF/rhG-CSF вызывало 2-кратное увеличение частоты экспрессии HPP-CFC в пиковый день.
| Таблица 8 Частота экспрессии циркулирующих HPP-CFC у макак Резус после введения только rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF | ||
| HPP-CFC/105 МНК* | ||
| Цикл 1 | Цикл 2 | |
| День | rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) | rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) |
| 1 | 4±1 | 3±1 |
| 2 | 6±1 | 3±1 |
| 3 | 13±4 | 11±3 |
| 4 | 15±4 | 27±10 |
| 5 | 20±9 | 37±8 |
| 8 | 18±6 | 6±4 |
| 10 | 6±1 | 5±4 |
*У макак Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhP1GF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1-5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество HPP-CFC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО. Данные о HPP-CFC получены после четырехкратного пассирования проб от каждого животного.
ПРИМЕР 9
Абсолютные значения HPP-CFC. Абсолютное количество в крови HPP-CFC на мл, зарегистрированное на 5 день введения rhG-CSF, было в 17 раз выше, чем значение перед введением. У обезьян, которым вводили объединенный rhG-CSF/rhPlGF (130 мкг/кг), наблюдалось 158-кратное увеличение HPP-CFC по сравнению с исходными данными. В цикле 2 уровень HPP-CFC на 5 день 5-кратно превосходил уровень цикла 1.
| Таблица 9 Абсолютные количества циркулирующих HPP-CFC у макак Резус после введения только rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF | ||
| HPP-CFC на мл крови* | ||
| Цикл 1 | Цикл 2 | |
| День | rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) | rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) |
| 1 | 96±17 | 54±49 |
| 2 | 493±218 | 258±34 |
| 3 | 683±155 | 1709±989 |
| 4 | 1521±332 | 3883±1309 |
| 5 | 1593±405 | 8557±1142 |
| 8 | 998±541 | 603±384 |
| 10 | 121±52 | 121±87 |
*У макак Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1 - 5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество HPP-CFC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО. Данные о HPP-CFC получены после четырехкратного пассирования проб от каждого животного. Абсолютным количеством циркулирующих в крови HPP-CFC является показатель частоты экспрессии HPP-CFC, умноженный на общее количество МНК на мл крови.
ПРИМЕР 10
Частота экспрессии LTC-IC. Анализ частоты экспрессии LTC-IC путем серийного разведения показал, что совместное введение rhPlGF (130 мкг/кг) и rhG-CSF в среднем приводит к увеличению частоты экспрессии LTC-IC в 11 раз (1 в 5829 против 1 в 64064 клетках), по сравнению с введением только rhG-CSF.
| Таблица 10 Частота экспрессии циркулирующих LTC-IC у макак Резус при 5-дневном курсе изолированного введения rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF | |||||
| Животное № | Режим мобилизации | Частота экспрессии LTC-IC (значение)* | Доверительный интервал (CI) 95% | LTC-IC на 105 MN | |
| Нижняя частота | Верхняя частота | ||||
| 1 | rhG-CSF | 1/84265 | 1/69209 | 1/102598 | 1,2 |
| 2 | rhG-CSF | 1/65835 | 1/54341 | 1/79761 | 1,5 |
| 3 | rhG-CSF | не установлено** | не установлено | не установлено | не установлено |
| 4 | rhG-CSF | 1/42091 | 1/34837 | 1/50854 | 2,4 |
| 1 | rhPlGF (130 мкг/кг) + rhG-CSF | 1/4009 | 1/5977 | 1/2689 | 24,9 |
| 2 | rhPlGF (130 мкг/кг) + rhG-CSF | 1/7562 | 1/11100 | 1/5152 | 13,2 |
| 3 | rhPIGF (130 мкг/кг) + rhG-CSF | не установлено | не установлено | не установлено | не установлено |
| 4 | rhPlGF (130 мкг/кг) + rhG-CSF | 1/5916 | 1/8725 | 1/4011 | 16,9 |
*Частоту экспрессии LTC-IC анализировали при серийном разведении с использованием мышиных клеток линии М2-10В4 в качестве стромального слоя. Пробы крови отбирали на 5 день мобилизации. Последовательные разведения тестируемых клеток (от 2×105 до 3×103) культивировали в течение 5 недель, и высе