Растения-трансформанты кукурузы pv-zmir13 (mon863) и композиции и способы их обнаружения

Растения-трансформанты кукурузы pv-zmir13 (mon863) и композиции и способы их обнаружения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии растений. Более конкретно настоящее изобретение относится к растению кукурузы (Zea mays), резистентному к жесткокрылым, PV-ZMIR13 и обозначенному MON863; а также к семенам и к потомству указанного растения кукурузы MON863. Растение кукурузы MON863 и его потомство являются, в частности, резистентными к Diabrotica vergifera, Diabrotica undecimpunctata и Leptinotarsa decemlineata.

Более конкретно настоящее изобретение также относится к ДНК-конструкции, встроенной в геном растения-трансформанта (event) кукурузы MON863 для сообщения ему резистентности к заражению насекомыми отряда Жесткокрылых (Coleopteran). Настоящее изобретение также относится к анализам на детекцию присутствия ДНК растения кукурузы MON863 в образце и ее композиций.

Предпосылки создания изобретения

Кукуруза является ценной сельскохозяйственной культурой и главным источником питания во многих регионах мира. Для улучшения агрономических показателей и качества продуктов, производимых из растений кукурузы, применяются методы биотехнологии. Известно, что экспрессия чужеродных генов в растениях зависит от их положения на хромосоме, определяемого структурами хроматина (например, гетерохроматина) или непосредственной близостью элементов регуляции транскрипции (например, энхансеров) к сайту интеграции (Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988). По этой причине часто оказывается необходимым скринировать большое число трансформантов для идентификации трансформанта, характеризующегося оптимальной экспрессией нужного встроенного гена. Как известно, например, из наблюдений растений и других организмов, у различных трансформантов уровни экспрессии встроенного гена могут широко варьироваться. Могут также наблюдаться различия в типах пространственной или временной экспрессии, например различия в относительной экспрессии трансгена в различных тканях растений, которые могут не соответствовать ожидаемому характеру экспрессии, оцениваемому исходя из элементов регуляции транскрипции, присутствующих во встроенной генной конструкции. По этой причине обычно продуцируются сотни или тысячи различных трансформантов, и эти трансформанты скринируют в целях поиска одного трансформанта, который имеет желаемые уровни и типы экспрессии трансгена, необходимые для промышленного применения. Трансформант, который имеет нужные уровни или типы экспрессии трансгена, может быть использован для интрогрессии трансгена в другой генетический фон путем полового ауткроссинга с использованием стандартных методов селекции. Потомство таких кроссов сохраняет экспрессионные свойства трансгена, характерные для исходного трансформанта. Эта стратегия используется для гарантии надежной экспрессии гена у растений различных сортов, хорошо адаптированных к условиям роста в определенной местности.

Для того чтобы определить, содержит ли потомство кросса, полученного половым скрещиванием, нужный трансген, предпочтительно детектировать конкретный продукт трансформации. Кроме того, способ детекции конкретного трансформанта может оказаться полезным с точки зрения соблюдения правил, предписываемых регуляторными органами, дающими разрешение на поступление данного продукта на рынок и требующими, например, наличия на упаковке пищевого продукта информации о том, что он произведен из рекомбинантных сельскохозяйственных растений. Присутствие трансгена может быть установлено любым хорошо известным методом детекции нуклеиновых кислот, таким как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или ДНК-гибридизация с использованием нуклеиновокислотных зондов. Эти методы детекции обычно направлены на часто используемые генетические элементы, такие как промоторы, терминаторы, маркерные гены и т.п. А поэтому такие методы не могут быть использованы для идентификации различных трансформантов, а в частности, тех трансформантов, которые продуцируются с использованием тех же самых ДНК-конструкций, за исключением тех случаев, когда последовательность хромосомной ДНК, смежная со встроенной ДНК (“фланкирующая ДНК”), является известной. Трансформант-специфический ПЦР-анализ обсуждается, например, в работе Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent. 64/5b:459-462, 1999), где был идентифицирован резистентный к глифосату трансформант сои 40-3-2 ПЦР-методом с использованием серии праймеров, охватывающих стык между вставкой и фланкирующей ДНК, а в частности, одного праймера, который включает последовательность, начинающуюся от вставки, и второго праймера, который включает последовательность, начинающуюся от фланкирующей ДНК.

Краткое описание изобретения

В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к композициям и к способам детекции присутствия области-вставки “трансген/геном” в новом растении кукурузы PV-ZMIR13, обозначенном MON863. Настоящее изобретение относится к ДНК-последовательностям, которые содержат, по меньшей мере, одну последовательность стыка в MON863, выбранную из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO:1 (стыка “произвольно установленная 5'-концевая вставка - геном”) и последовательности SEQ ID NO:2 (стыка “произвольно установленная 3'-концевая вставка - геном”) и их комплементов, где указанная последовательность стыка охватывает область стыка между гетерологичной ДНК, встроенной в геном кукурузы, и ДНК клетки кукурузы, фланкирующей сайт инсерции, и является диагностическим признаком для данного трансформанта.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения описаны, например, ДНК-последовательности, которые содержат новую область-вставку “трансген/геном”, SEQ ID NO:3 (последовательность, содержащая произвольно установленный 5'-конец встроенной ДНК) и SEQ ID NO:4 (последовательность, содержащая произвольно установленный 3'-конец встроенной ДНК).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения также описаны ДНК-последовательности, которые содержат, по меньшей мере, примерно от 11 до 50 или более нуклеотидов 5'-трансгенной части ДНК-последовательности SEQ ID NO:7 и 5'-фланкирующую ДНК-последовательность кукурузы SEQ ID NO:5 аналогичной длины, или 3'-трансгенную часть ДНК-последовательности кукурузы SEQ ID NO:8 аналогичной длины и 3'-фланкирующую ДНК кукурузы SEQ ID NO:6 аналогичной длины, и которые используются в качестве ДНК-праймеров в методах амплификации ДНК. Ампликоны, продуцированные с использованием этих праймеров, являются диагностическими показателями присутствия трансформанта кукурузы MON863. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к ампликону, продуцированному первым ДНК-праймером, гомологичным или комплементарным последовательности SEQ ID NO:7 и связанным со вторым ДНК-праймером, гомологичным или комплементарным последовательности SEQ ID NO:5, где оба этих праймера присутствуют в реакционной смеси вместе с ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце. В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к ампликону, продуцированному третьим ДНК-праймером, гомологичным или комплементарным последовательности SEQ ID NO:8, и связанным с четвертым ДНК-праймером, гомологичным или комплементарным последовательности SEQ ID NO:6, где оба эти праймера присутствуют в реакционной смеси вместе с ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце. В других своих аспектах настоящее изобретение относится к растению кукурузы MON863 и к его потомству, происходящему от растений, которые содержат указанные ДНК-последовательности, используемые в реакции амплификации ДНК для получения одного или нескольких диагностических ампликонов.

В еще одном предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способам детекции присутствия ДНК, соответствующей ДНК трансформанта кукурузы MON863, в образце. Указанные способы включают стадии: (а) контактирования биологического образца, предположительно содержащего ДНК трансформанта MON863, с парой праймеров, которые, при использования в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с указанной ДНК, продуцируют ампликон, который является диагностическим показателем присутствия трансформанта кукурузы MON863; (b) проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты с продуцированием ампликона; и (с) детекции указанного ампликона. Конкретно проиллюстрированные здесь ампликоны соответствуют первому ампликону, имеющему примерно 508 пар нуклеотидов и представленному в SEQ ID NO:3, и второму ампликону, имеющему примерно 584 пар нуклеотидов и представленному в SEQ ID NO:4, либо более длинным или более коротким ампликонам, где указанный первый ампликон содержит, по меньшей мере, нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:1 и простирающуюся примерно от нуклеотида 1 до нуклеотида 11, или примерно от нуклеотида 10 до нуклеотида 20, а указанный второй ампликон содержит, по меньшей мере, нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:2 и простирающуюся примерно от нуклеотида 1 до нуклеотида 11, или примерно от нуклеотида 10 до нуклеотида 20.

В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способам детекции присутствия ДНК, соответствующей трансформанту MON863, в образце. Указанные способы включают стадии: (а) контактирования биологического образца, предположительно содержащего ДНК трансформанта MON863, с зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с указанной ДНК и не гибридизуется в жестких условиях гибридизации с ДНК контрольного растения кукурузы, не содержащего встроенную ДНК, происходящую от pMON25097; (b) создания жестких условий гибридизации для указанного образца и зонда; и (с) детекции гибридизации указанного зонда с геномной ДНК, где детекция связывания зонда с указанной ДНК является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта MON863 в указанном образце.

В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к новому растению кукурузы MON863, которое включает ДНК-последовательности, содержащие новые области вставки трансген/геном и представленные в SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4. В других своих вариантах настоящее изобретение относится к семенам растений MON863, к потомству растений MON863 и к способам продуцирования растения кукурузы путем скрещивания растения кукурузы MON863 с этим же растением или с другим растением кукурузы.

Вышеуказанные и другие предпочтительные варианты настоящего изобретения будут более понятными из нижеследующего подробного описания.

Краткое описание чертежей и последовательностей

Описание чертежей

На фиг.1 проиллюстрирован экспрессирующий вектор PV-ZMIR13, также обозначенный pMON25097, с помощью которого был генерирован трансформант растения кукурузы MON863, резистентный к кукурузному листоеду, методом бомбардировки ускоренными частицами с использованием рестрикционного M1ul-фрагмента, расположенного примерно от положения нуклеотида 149 до положения нуклеотида 4840.

На фиг.2 представлена графическая схема, иллюстрирующая общую организацию элементов, содержащих гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, встроенные в геном трансформанта кукурузы MON863, и указаны основные положения, в которых встроенные последовательности нуклеиновой кислоты присоединены к геномным ДНК-последовательностям кукурузы, именуемым здесь как геномные последовательности нуклеиновой кислоты кукурузы, фланкирующие концы встроенных гетерологичных ДНК-последовательностей; ниже охарактеризован трансформант кукурузы MON863, который содержит следующие последовательности: геномную ДНК кукурузы [1] (SEQ ID NO:5), фланкирующую произвольно установленный 5'-конец полноразмерной первичной функциональной встроенной ДНК-последовательности и являющуюся смежной с неприродной промоторной последовательностью CaMV35S AS4, [2], (P-CaMV.AS4 SEQ ID NO:17), функционально присоединенной к нетранслируемой лидерной последовательности связывающего белка А/В хлорофилла пшеницы, [3], (L-Ta.hcbl, SEQ ID NO:18), которая функционально присоединена к интронной последовательности актина риса, [4], (I-Os.Actl, SEQ ID NO:19), которая в свою очередь функционально присоединена к неприродной последовательности, кодирующей вариант белка Cry3Bb, [5], (SEQ ID NO:20) и функционально присоединенной к последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования белка теплового шока Hspl7 пшеницы, [6], (Т-Ta.Hspl7, SEQ ID NO:21), и полноразмерную первичную функциональную встроенную ДНК-последовательность, фланкированную геномной ДНК кукурузы у произвольно установленного 3'-конца, [7] (SEQ ID NO:6), где стык между [1] и [2] ([8]) соответствует SEQ ID NO:1, а стык между [6] и [7] ([9]) соответствует SEQ ID NO:2.

Описание последовательностей

SEQ ID NO:1 соответствует последовательности стыка между геномной и встроенной ДНК кукурузы, которая является диагностическим признаком для произвольно установленного 5'-конца полноразмерной первичной функциональной встроенной ДНК-последовательности в трансформанте кукурузы MON863.

SEQ ID NO:2 соответствует последовательности стыка между геномной и встроенной ДНК кукурузы, которая является диагностическим признаком для произвольно установленного 3'-конца полноразмерной первичной функциональной встроенной ДНК-последовательности в трансформанте кукурузы MON863.

SEQ ID NO:3 соответствует последовательности, представленной, в основном, последовательностями [1] и [2] на фиг.2.

SEQ ID NO:4 соответствует последовательности, представленной, в основном, последовательностями [6] и [7] на фиг.2.

SEQ ID NO:5 соответствует неполной геномной ДНК-последовательности кукурузы, которая является смежной с произвольно установленным 5'-концом неполной Cry3Bb-кодирующей ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863, и фланкирует указанный 5'-конец.

SEQ ID NO:6 соответствует неполной геномной ДНК-последовательности кукурузы, которая является смежной с произвольно установленным 3'-концом неполной Cry3Bb-кодирующей ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863, и фланкирует указанный 3'-конец.

SEQ ID NO:7 соответствует последовательности произвольно установленного 5'-конца неполной Cry3Bb-кодирующей ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863.

SEQ ID NO:8 соответствует последовательности произвольно установленного 3'-конца неполной Cry3Bb-кодирующей ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863.

SEQ ID NO:9 соответствует 5'-праймерной последовательности (праймер А), комплементарной части геномной ДНК-последовательности кукурузы, идентифицированной как последовательность, фланкирующая произвольно установленный 5'-конец полноразмерной первичной функциональной ДНК-последовательности, встроенной в трансформант кукурузы MON863 и, при спаривании с праймером, соответствующим обратному комплементу последовательности, представленной в SEQ ID NO:10 и с матричной ДНК трансформанта кукурузы MON863, продуцирует ампликон, содержащий SEQ ID NO:3, который является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце.

SEQ ID NO:10 соответствует обратному комплементу 3'-праймерной последовательности (праймер В), комплементарной части произвольно установленной 5'-концевой полноразмерной первичной функциональной ДНК, встроенной в геном кукурузы в трансформанте кукурузы MON863 и, при спаривании с праймером, соответствующим последовательности, представленной в SEQ ID NO:9 и матричной ДНК трансформанта кукурузы MON863, продуцирует ампликон, содержащий SEQ ID NO:3, который является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце.

SEQ ID NO:11 соответствует 5'-праймерной последовательности (праймер С), комплементарной части произвольно установленной 3'-концевой последовательности полноразмерной первичной функциональной ДНК, встроенной в геном кукурузы в трансформанте MON863 и, при спаривании с праймером, соответствующим обратному комплементу последовательности, представленной в SEQ ID NO:12 и с матричной ДНК трансформанта кукурузы MON863, продуцирует ампликон, содержащий SEQ ID NO:4, который является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце.

SEQ ID NO:12 соответствует обратному комплементу 3'-праймерной последовательности (праймер D), комплементарной части геномной ДНК-последовательности кукурузы, идентифицированной как последовательность, фланкирующая произвольно установленный 3'-конец полноразмерной первичной функциональной ДНК, встроенной в трансформант кукурузы MON863 и, при спаривании с праймером, соответствующим последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, и с матричной ДНК трансформанта кукурузы MON863, продуцирует ампликон, содержащий SEQ ID NO:4, который является диагностическим показателем присутствия ДНК трансформанта кукурузы MON863 в образце.

SEQ ID NO:13 соответствует 5'-праймеру 1 для “прогулки по геному”.

SEQ ID NO:14 соответствует 5'-праймеру 2 для “прогулки по геному”.

SEQ ID NO:15 соответствует 3'-праймеру 1 для “прогулки по геному”.

SEQ ID NO:16 соответствует 3'-праймеру 2 для “прогулки по геному”.

SEQ ID NO:17 соответствует промоторной последовательности CaMV35S AS4.

SEQ ID NO:18 соответствует нетранслируемой лидерной последовательности связывающего белка А/В хлорофилла пшеницы (L-Ta.hcb1).

SEQ ID NO:19 соответствует интронной последовательности актина риса (I-Os.Act1).

SEQ ID NO:20 соответствует неприродной последовательности, кодирующей вариант белка Cry3Bb.

SEQ ID NO:21 соответствует последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования белка теплового шока Hsp17 пшеницы (Т-Ta.Hsp17).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Ниже приводятся определения терминов и описание методов для лучшей характеризации настоящего изобретения и для облегчения его практического осуществления. Термины, которые не определены конкретно в нижеследующем описании, следует понимать в их обычно принятом значении. Определения общих терминов в молекулярной биологии можно также найти в работах Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991, и у Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Номенклатура для оснований ДНК используется в соответствии со ст. 37 Свода федеральных правил (CFR) § 1.822.

При использовании в настоящем описании термина “биологический образец” или “образец” предусматривается, что он включает нуклеиновые кислоты, полинуклеотиды, ДНК, РНК, тРНК, кДНК и т.п. в композиции с субстратом или фиксированные на субстрате, который позволяет проводить анализ образца с использованием молекулярного зонда или термоамплификацию с использованием олигонуклеотидных зондов и/или праймеров.

Используемый здесь термин “кукуруза” означает Zea mays или маис и охватывает все сорта растений, которые могут быть скрещены с кукурузой, включая дикие виды маиса.

Используемый здесь термин “содержащий” означает “включающий, но не ограничивающийся”.

Используемый здесь термин “диагностический” относится к показателю, используемому в целях идентификации последовательностей нуклеиновой кислоты, содержащихся в трансформанте кукурузы MON863 или происходящих от этого трансформанта; причем любая одна или несколько новых описанных здесь ДНК-последовательностей должны содержать геномные фланкирующие последовательности кукурузы, смежные и связанные с произвольно установленными концами встроенных гетерологичных ДНК-последовательностей, что является необходимым и достаточным для описания отличительных признаков генома трансформанта кукурузы MON863 при условии, что данная последовательность содержит, по меньшей мере, часть одного из концов встроенной гетерологичной ДНК-последовательности или кукурузной геномной последовательности, фланкирующей один из этих концов или смежной с этим концом, и включает, по меньшей мере, два нуклеотида, то есть динуклеотид, содержащий сайт, в котором кукурузная геномная последовательность и встроенная гетерологичная ДНК-последовательность присоединены друг к другу фосфодиэфирной связью. Специалистам хорошо известно, что если последовательность, которая является диагностическим признаком для конкретного трансформанта, такого как описываемый здесь трансформант кукурузы MON863, не присутствует в конкретном образце, содержащем геномные нуклеиновые кислоты кукурузы, то это является показателем того, что данный образец не содержит диагностической последовательности, а значит в указанном образце данные нуклеиновые кислоты отсутствуют либо эти нуклеиновые кислоты не происходят от генома трансформанта кукурузы MON863 и не содержатся в геноме этого трансформанта. Кроме того, в трансформанте кукурузы MON863 присутствуют описанные здесь дополнительные новые и диагностические последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 и их комплементов.

Трансгенный “трансформант” (“event”) продуцируется путем трансформации клеток растения гетерологичной ДНК, то есть нуклеиновокислотной конструкцией, которая включает нужный трансген, с последующей регенерацией популяции растений в результате встраивания трансгена в геном растения и отбора конкретного растения, характеризующегося наличием вставки в конкретном положении генома. Термин “трансформант” (“event”) означает исходный трансформант и потомство этого трансформанта, которое включает гетерологичную ДНК. Термин “трансформант” (“event”) также означает потомство, продуцированное путем полового ауткроссинга между данным трансформантом и другим сортом, который включает гетерологичную ДНК. Даже после повторного возвратного скрещивания (беккроссинга) с рекуррентным родителем встроенная ДНК и фланкирующая ДНК от трансформированного родителя присутствует в потомстве этого кросса в том же самом положении хромосомы. Термин “трансформант” (“event”) также означает ДНК от исходного трансформанта, содержащего встроенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно смежную со встроенной ДНК, которая, как ожидается, должна передаваться потомству, которое наследует встроенную ДНК, включающую нужный трансген, переданный в результате полового скрещивания родительской линии, содержащей встроенную ДНК (например, исходный трансформант и потомство, полученное в результате самоопыления), с родительской линией, которая не содержит встроенной ДНК.

Следует также отметить, что могут быть также скрещены два различных трансгенных растения с продуцированием потомства, которое содержит два или более независимо сегрегирующихся экзогенных гена (термин “экзогенные гены” означает нуклеотидные последовательности, которые не встречаются в природном геноме данного растения, то есть являются гетерогенными для данного растения кукурузы). В результате самоопыления соответствующего потомства могут продуцироваться растения, которые являются гомозиготными по любой комбинации этих экзогенных генов. В настоящем изобретении также рассматривается беккроссинг с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением, а также вегетативное размножение. Описание других методов скрещивания, которые обычно используются для получения различных фенотипов и культур, можно найти в одной из нескольких работ, например, Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox, J. ed. American Society of Agronomy, Madison WI (1987).

“Зонд” представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, к которой может быть присоединена или с которой может быть связана стандартная детектируемая метка или репортерная молекула, например радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентный агент или фермент. Такой зонд является комплементарным последовательности, присутствующей в нуклеиновой кислоте-мишени, а в случае настоящего изобретения последовательности геномной ДНК, происходящей от трансформанта кукурузы MON863, либо от растения кукурузы, либо из образца, который включает ДНК данного трансформанта. Зонды настоящего изобретения включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также и полиамиды и другие материалы-зонды, которые специфически связываются с ДНК-последовательностью-мишенью и могут быть использованы для детекции на присутствие такой ДНК-последовательности-мишени.

“Праймеры” представляют собой выделенные нуклеиновокислотные зонды, которые, в случае любого одного из данных праймеров, отжигаются с комплементарной ДНК-последовательностью-мишенью посредством гибридизации нуклеиновых кислот с образованием гибрида между праймером и ДНК-последовательностью-мишенью с последующим удлинением вдоль цепи ДНК-мишени под действием полимеразы, например ДНК-полимеразы. Термин “пары праймеров” настоящего изобретения означает две или более различных праймерных последовательности, используемых для амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, которая присутствует между последовательностями-мишенями и связана с этими последовательностями-мишенями, называемыми обратным комплементом или, по существу, обратным комплементом праймеров, и где указанная амплификация осуществляется, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или другими стандартными методами амплификации нуклеиновых кислот.

Зонды и праймеры обычно имеют длину примерно от 11 нуклеотидов или более, предпочтительно, примерно от 18 нуклеотидов или более, более предпочтительно, примерно от 24 нуклеотидов или более, а наиболее предпочтительно, примерно от 30 нуклеотидов или более. Такие зонды и праймеры специфически гибридизуются с последовательностью-мишенью в условиях гибридизации высокой жесткости. Зонды и праймеры настоящего изобретения, предпочтительно, имеют полную последовательность, аналогичную последовательности-мишени, хотя в соответствии со стандартными методами могут быть сконструированы зонды, отличающиеся от последовательности-мишени и сохраняющие способность гибридизоваться с последовательностями-мишенями.

Методы получения и использования зондов и праймеров описаны, например, в руководстве Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol.1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (далее называемом “Sambrook et al., 1989”); Current Protocols in Molecular Biology ed. Ausubel et al., Greene Publisching Associates and Wiley Interscience, New York, 1992 (с периодическими исправлениями) (далее называемом “Ausubel et al., 1992”); и Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Пары ПЦР-праймеров могут быть получены из известной последовательности, например, с использованием компьютерных программ, таких как программа “Primer”, предназначенная для этих целей (Version 0,5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).

Праймеры и зонды, сконструированные на основе фланкирующей ДНК, последовательностей-вставок и последовательностей стыков, описанных в настоящей заявке, могут быть использованы для подтверждения присутствия рассматриваемых последовательностей в образце стандартными методами, например путем повторного клонирования и секвенирования таких последовательностей.

Любой отдельно взятый нуклеиновокислотный зонд или праймер настоящего изобретения гибридизуется со специфической ДНК-последовательностью-мишенью в жестких условиях. Для идентификации присутствия ДНК, происходящей от трансгенсодержащего трансформанта в образце, могут быть использованы любые методы гибридизации или амплификации. Молекулы нуклеиновой кислоты или ее фрагменты специфически гибридизуются с другими молекулами нуклеиновой кислоты в определенных условиях. В соответствии с настоящим изобретением считается, что используемые здесь две различные молекулы нуклеиновой кислоты, каждая из которых содержит различные последовательности, специфически гибридизуются друг с другом, если указанные две молекулы образуют антипараллельную двухцепочечную структуру нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты считается “комплементарной” другой молекуле нуклеиновой кислоты, если эти молекулы имеют полную комплементарность. Считается, что используемые здесь молекулы имеют “полную комплементарность”, если каждый нуклеотид одной молекулы комплементарен нуклеотиду другой молекулы. В соответствии с настоящим изобретением считается, что две молекулы имеют “минимальную комплементарность”, если они могут гибридизоваться друг с другом со стабильностью, достаточной для их гибридизации друг с другом, по меньшей мере, в стандартных условиях “низкой жесткости”. Аналогичным образом считается, что данные молекулы являются комплементарными, если они могут гибридизоваться друг с другом со стабильностью, достаточной для их гибридизации друг с другом, по меньшей мере, в стандартных условиях “высокой жесткости”. Стандартные условия жесткости описаны у Sambrook et al., 1989, и у Haymes et al. (Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985). Поэтому отклонение от полной комплементарности допускается при условии, что такие отклонения абсолютно не препятствуют способности данных молекул образовывать двухцепочечные структуры. Для того чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила в качестве праймера или зонда, необходимо лишь, чтобы она была достаточно комплементарной последовательности, способной образовывать стабильную двухцепочечную структуру в конкретном растворителе и в конкретных концентрациях соли.

Термин “специфический для (последовательности-мишени)” указывает на то, что зонд или праймер гибридизуется в жестких условиях гибридизации только с последовательностью-мишенью в образце, содержащем такую последовательность-мишень, и что такая гибридизация является детектируемой.

Используемый здесь термин “выделенная нуклеиновая кислота” означает нуклеиновую кислоту, которая является, в основном, отделенной или очищенной от других последовательностей нуклеиновой кислоты в клетке данного организма, в которой обычно присутствует данная нуклеиновая кислота, то есть от других хромосомных и внехромосомных ДНК и РНК, стандартными методами очистки нуклеиновых кислот. Этот термин также включает рекомбинантные нуклеиновые кислоты и химически синтезированные нуклеиновые кислоты.

Используемый здесь термин “по существу гомологичная последовательность” означает последовательность нуклеиновой кислоты, специфически гибридизующуюся с комплементом последовательности нуклеиновой кислоты, с которой она сравнивается, то есть с последовательностью-мишенью, в условиях высокой жесткости. Соответствующие условия жесткости, которые обеспечивают гибридизацию ДНК, такие как, например, использование 6,0 × хлорида натрия/цитрат натрия (SSC) примерно при 45°С, и промывки 2,0 × SSC при 50°С, являются известными либо их описание можно найти в руководстве Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6., 1989. Так, например, концентрация соли в стадии промывки может быть выбрана из концентрации, используемой в условиях низкой жесткости и составляющей примерно 2,0 × SSC при 50°С, и концентрации, используемой в условиях высокой жесткости и составляющей примерно 0,2 × SSC при 50°С. Кроме того, температура в стадии промывки может быть увеличена от комнатной температуры, используемой в условиях низкой жесткости и составляющей примерно 22°С, до температуры, используемой в условиях высокой жесткости и составляющей примерно 65°С. Температура реакции и концентрация соли могут одновременно варьироваться, либо температура может оставаться постоянной, а концентрация соли варьироваться, или наоборот. В предпочтительном варианте нуклеиновая кислота настоящего изобретения может специфически гибридизоваться с одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты, представленными либо в SEQ ID NO:1, либо в SEQ ID NO:2, или с их комплементами или фрагментами в условиях умеренной жесткости, например, примерно в присутствии 2,0 × SSC и при температуре примерно 65°С. В особенно предпочтительном варианте нуклеиновая кислота настоящего изобретения может специфически гибридизоваться с одной или несколькими молекулами нуклеиновой кислоты, представленными либо в SEQ ID NO:1, либо в SEQ ID NO:2, или с их комплементами или фрагментами в условиях высокой жесткости. Нуклеиновая кислота настоящего изобретения, которая гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:1, или с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:3, необязательно должна гибридизоваться с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:2, или последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:4, и наоборот.

В одном из аспектов настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, или ее комплементы или фрагменты. В другом аспекте настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения на 80 - 100% или на 90 - 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, ее комплементу или фрагментам. В другом аспекте настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения на 95 - 100% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, ее комплементу или фрагментам. SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 могут быть использованы в качестве маркеров для идентификации потомства генетических кроссов в методах скрещивания растений, аналогичных методам, описанным для простого анализа на наличие ДНК-маркеров повторяющихся последовательностей, как описано в “DNA markers: Protocols, Applications, and Overviews, 173-185, Cregan et al., eds., Wiley-Liss NY, 1997. Гибридизация зонда с молекулой ДНК-мишени может быть детектирована различными методами, известными специалистам, и такими методами являются, но не ограничиваются ими, методы с использованием флуоресцентных меток, радиоактивных меток, меток на основе антител и хемилюминесцентных меток.

Что касается амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени (например, с помощью ПЦР), проводимой с использованием конкретной пары праймеров для амплификации, то “жесткими условиями” являются такие условия, которые позволяют отдельным праймерам в данной паре праймеров гибридизоваться только с отдельной и уникальной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, с которой должен связываться каждый праймер, содержащий соответствующую последовательность дикого типа (или ее комплемент), а предпочтительно продуцировать уникальный продукт амплификации, ампликон, в реакции термоамплификации ДНК.

Используемый здесь термин “трансформация” означает перенос фрагмента нуклеиновой кислоты в геном организма-хозяина, такого как растение-хозяин, в результате генетически стабильного наследования. Растения-хозяева, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновой кислоты, называются “трансгенными растениями”.

Используемый здесь термин “амплифицированная ДНК” или “ампликон” означает продукт амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, которая является частью матричной нуклеиновой кислоты. Так, например, для того чтобы определить, содержит или не содержит данное растение кукурузы, полученное в результате полового скрещивания, геномную ДНК трансгенного растения, происходящую от растения кукурузы MON863 настоящего изобретения, ДНК, экстрагированная из образца ткани растения кукурузы, может быть подвергнута нуклеиновокислотной амплификации с использованием пары праймеров, которая включает один праймер, происходящий от фланкирующей последовательности в геноме растения, смежной с сайтом инсерции встроенной гетерологичной ДНК, и второй праймер, происходящий от встроенной гетерологичной ДНК, в результате чего будет продуцироваться ампликон, который является диагностическим признаком присутствия трансгенной ДНК. Ампликон имеет длину и последовательность, которые также являются диагностическими показателями присутствия трансгенной ДНК. Длина этого ампликона может составлять в пределах от общей длины пар праймеров плюс одна пара нуклеотидов, предпочтительно плюс примерно пятьдесят пар нуклеотидов, более предпочтительно плюс примерно двести пятьдесят пар нуклеотидов, и даже более предпочтительно плюс примерно четыреста пятьдесят пар нуклеотидов. Альтернативно пара праймеров может происходить от фланкирующей последовательности с обеих сторон от встроенной ДНК так, чтобы мог продуцироваться ампликон, который включает всю вставку нуклеотидной последовательности. Член пары праймеров, происходящий от геномной последовательности растения, может быть локали