Способ оценки устойчивости организма животного к туберкулезу

Способ оценки устойчивости организма животного к туберкулезу

Реферат

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при оценке устойчивых и восприимчивых к туберкулезу лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Известно широкое использование биохимических тестов в медицине, в частности для диагностики и прогнозирования состояния больных в послеоперационный период и при развитии острого воспалительного процесса. Так, известен способ оценки состояния больного, основанный на определении активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы (патент РФ №2103692 по кл. МПК G01N 33/53, опубл. 27.01.98 г.).

Однако способ предназначен только для человека и используется для прогнозирования течения заболевания у больных.

Известны способы определения активности туберкулеза по биохимическим показателям крови (например, а.с. СССР №1287010, патенты РФ №2187818, №2238564, №2161313, №2305286). В частности, известен способ диагностики степени тяжести туберкулеза (а.с. СССР №1287010 по кл. МПК G01N 33/68, опубл. 30.01.87) путем определения в крови больного содержания глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6ФДГ). В способе по патенту РФ №2187818 (по кл. МПК G01N 33/68, опубл.20.08.02) определяют соотношение церулоплазмин (Цп)/трансферрин (Тр) и наличие свободнорадикальных соединений (СРС) методом электронного парамагнитного резонанса.

Известен также способ оценки тяжести туберкулезной инфекции путем определения концентрации в плазме крови таурина и глутаминовой кислоты (патент РФ №2305286 по кл. МПК G01N 33/68, опубл. 27.08.2007). При этом способ проверен только в эксперименте на морских свинках.

Однако все вышеуказанные способы, как и предыдущий аналог, используются только в медицине и предназначены для оценки состояния уже больных людей.

Известен способ прогнозирования продуктивности коров по биохимическому анализу крови (патент РФ №2214709, кл МПК А01К 67/02, опубл. 27.10.03 г.). Определяют уровень калия в эритроцитах телок и при содержании калия до 19 мэкв/л животных относят к высокопродуктивным с укороченным сроком хозяйственного использования и низкой пожизненной продуктивностью; при содержании калия свыше 26 мэкв/л животных относят к низкопродуктивным, но с высокой пожизненной продуктивностью и длительным сроком хозяйственного использования.

Данный способ позволяет в раннем возрасте прогнозировать пожизненную продуктивность и срок хозяйственного использования здоровых животных. Однако он не предназначен для оценки устойчивости организма животных к заболеванию туберкулезом.

Наиболее близким к заявляемому является способ отбора крупного рогатого скота на устойчивость к туберкулезу здоровых животных (см. патент РФ №2080061 по кл. МКИ А01К 67/02, опубл. 27.05.97). Способ основан на отборе животных по комплексу аллелей групп крови и антигенов BoLA-системы, маркирующих устойчивость. Данный метод направлен на решение задачи определения генетической устойчивости животных и позволяет отбирать для воспроизводства животных конкретной породы - крупный рогатый скот.

Однако способ длителен и сложен в исполнении, требует большого количества ингредиентов. Кроме этого, способ не позволяет определять устойчивость к туберкулезу других видов животных (свиней, овец), включая и лабораторных (морских свинок, мышей, крыс, кроликов).

Изобретение направлено на решение задачи создания способа оценки восприимчивости организма здорового животного к туберкулезу на основе изучения его биохимических показателей крови.

Техническим результатом изобретения является быстрота и простота исполнения способа при снижении затрат и расширении области применения за счет возможности использования как для сельскохозяйственных, так и лабораторных животных.

Для решения поставленной задачи в способе оценки устойчивости организма животного к туберкулезу путем исследования крови согласно изобретению формируют группу клинически здоровых животных одного вида, исследуют активность креатинкиназы и лактатдегидрогеназы, определяют среднее значение каждого из этих показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение показателя каждого животного со средней величиной этого же показателя для конкретной группы животных, при повышении активности креатинкиназы и одновременном понижении активности лактатдегидрогеназы относительно среднего значения каждого показателя для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.

Для повышения точности оценки устойчивости организма животного к туберкулезу дополнительно исследуют активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы, определяют среднее значение каждого из показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы только у животных с повышенной активностью креатинкиназы и пониженной активностью лактатдегидрогеназы со средней величиной аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы соответственно для конкретной группы животных, при понижении активности аланинаминотрансферазы и/или повышении активности аспартатаминотрансферазы относительно среднего значения каждого из этих показателей для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа оценки устойчивости организма животного к туберкулезу, позволяющего проводить дифференциацию здоровых животных на восприимчивых и устойчивых к заболеванию туберкулезом по некоторым биохимическими показателям крови. При этом при повышении активности креатинкиназы (КК) и одновременном понижении активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) относительно среднего значения каждого показателя для конкретной группы животных одного вида судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.

ЛДГ - фермент, катализирующий реакцию превращения пирувата в лактат, которая является конечной реакцией анаэробного пути окисления глюкозы. Поэтому повышение активности ЛДГ свидетельствует о повышении активности гликолиза, т.е. о повышении анаэробной доли окислительного процесса.

КК - фермент, катализирующий реакцию фосфорилирования креатина, протекающую в аэробных условиях с использованием энергии связи АТФ в тканях и органах с высокой активностью анаэробного окисления. Поэтому увеличение значения КК говорит о возрастании аэробного окисления.

Следовательно, низкие значения ЛДГ и высокие КК свидетельствуют о возрастании доли аэробного окисления. Возрастание доли аэробного окисления, в свою очередь, говорит об увеличении кислородзависимой килинговой активности нейтрофилов в отношении микобактерий, что приводит, в конечном итоге, к устойчивости животных к заражению туберкулезом.

Для повышения точности оценки устойчивости организма здорового животного к туберкулезу дополнительно исследуют активность аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ).

ACT - фермент, катализирующий перенос аминогруппы с аспарагиновой кислоты на α-кетоглутарат. Активность этого фермента высока в органах и тканях с преобладанием аэробного окисления.

АЛТ - фермент, катализирующий перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Активность этого фермента высока в органах и тканях с преобладанием анаэробного окисления, например в печени. Поскольку холестерин синтезируется в печени, целесообразно определять его уровень для того, чтобы убедиться, что снижение активности АЛТ связано не с угнетением функциональной активности гепатоцитов, а именно со снижением доли анаэробного окисления.

Следовательно, у животных с высоким относительно среднего значением ACT, низким значением АЛТ и повышенным содержанием холестерина преобладает высокая доля аэробного окисления, что также свидетельствует об устойчивости животных к заражению туберкулезом.

Таким образом, авторами впервые выявлено, что увеличение доли аэробного процесса окисления в организме и снижение доли анаэробного процесса окисления способствуют формированию защитных сил организма и, как следствие - повышению устойчивости животных к заражению туберкулезом.

Все известные на сегодняшний день методы связаны с исследованиями уже инфицированного организма. Авторами выявлен лишь один источник информации, являющийся прототипом данного изобретения (см. патент РФ №2080061), в котором была решена задача выявления устойчивых к заражению туберкулезом здоровых животных (крупного рогатого скота). Однако он основан на определении генетической устойчивости организма.

Кроме этого, авторами запатентованы методы оценки устойчивости здорового организма животных к туберкулезу. В одном случае - путем определения поглотительной способности нейтрофилов и наличия микобактерий на лимфоцитах (патент РФ №2295725), а в другом случае - путем постановки реакции агломерации лейкоцитов (РАЛ) и определения индекса агломерации лейкоцитов (патент РФ №2280872).

Задачу выявления устойчивого к заражению туберкулезом здорового организма животного на основе изучения его биохимических показателей крови, никто не ставил.

Сказанное позволяет нам сделать вывод о наличии в заявляемом способе критерия «изобретательский уровень».

Все ферменты (КК, ЛДГ, ACT, АЛТ) определялись кинетическими методами.

КК - методом Оливера и Розальского (Recommendation of the German Society for Clinical Chemistry. Standartization of methods for the estimation of enzyme activities in biological fluids: Standard method for the determination of creatine kinase activity. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1977; 15: 255-260; Stein W. Creatine kinase (total activity), creatine kinase isoenzymes and variants, In: Tomas L., ed. Clinical laboratory diagnostics. Frankfurt: TH-Books Verlagsgesellschaft; 1998., p.71-80), основанным на способности КК катализировать разрушение креатин-фосфата с одновременным превращением АДФ в АТФ, которое далее участвует в ферментативном фосфорилировании глюкозы.

ЛДГ - методом Врублевского и Ля Дью (Wilkinson J., Qureshi A. Catabolism of plasma enzymes, as Studied I-125 labeled lactate dehydrogenase-I in the rabbit. - Clin. chem., 1976, v.22, p.1269-1276), основанным на оптическом тесте Варбурга.

ACT - методом без применения фосфопиридоксаля Кармен (Moss D.W., Henderson A.R. Clinical enzymology. In: Burtis C.A., Ashwood E.R., editors. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 3^rd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company; 1999), основанным на способности ACT катализировать перенос аминогруппы с аспарагиновой кислоты на α-кетоглутарат.

АЛТ - методом без применения фосфопиридоксаля Генлей, Врублевского и Ля Дью (Bergmeyer H.U., Horder M., Rej R. International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) Scientific Committee. Analitical section: approved recommendation (1985) on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part 3. IFCC methods for alanine aminotransferase (L-alanine:2-oxoglutarate aminotransferase, EC 2.6.1.2; J. Clin. Biochem. 1986; 24: 481-495), основанным на способности АЛТ катализировать перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат.

Для проверки устойчивости к заражению туберкулезом проводили контрольное заражение лабораторных животных. Морским свинкам, крысам, кроликам вводили 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis.

За телятами вели наблюдения в течение 4 лет.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Формируют группу клинически здоровых животных одного вида (кролики, крысы, морские свинки, телята, цыплята-бройлеры) в количестве до 100 животных в группе.

2. У этих животных берут кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность КК и ЛДГ.

3. По каждому показателю в каждой группе животных находят среднее арифметические значение.

4. Выявляют животных, у которых активность ЛДГ ниже найденного среднего арифметического значения для конкретной группы, а активность КК - выше. Этих животных считают устойчивыми к заражению туберкулезом.

5. При необходимости более точной оценки, в этой группе животных дополнительно определяют значения ACT и АЛТ.

При понижении активности АЛТ и/или повышении активности ACT относительно среднего значения каждого из этих показателей для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.

Пример 1.

Формируют группу морских свинок в количестве 7 голов.

Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность ЛДГ, КК. Для повышения точности оценки устойчивости определяют ACT и АЛТ. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Биохимические показатели плазмы крови морских свинок
№ животного	ЛДГ (Е/л)	КК (Е/л)	АЛТ (Е/л)	АСТ (Е/л)
1	343,5	1134,2	59,9	77,0
2	430,9	486,0	56,2	77,8
3	12,2	577,2	40,0	48,8
4	305,9	901,6	59,8	41,4
5	167,4	302,4	43,2	34,6
6	523,6	244,2	30,8	70,4
7	305,3	239,6	178,1	38,2
Ср. зн.	298,4	421,95	66,86	55,46

Как видно из таблицы 1, из 7 животных показатель КК выше среднего наблюдался у животных №1-4, а показатель ЛДГ ниже среднего - у животных №3 и №5.

В данной группе животных только одна морская свинка (№3) соответствует критерию отбора на устойчивость.

Дополнительные критерии оценки по значениям АЛТ и ACT выявили уровень активности АЛТ у животного №3 ниже среднего, что подтверждает вывод о его высокой устойчивости.

При экспериментальном заражении животных туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis, животное №3 не заболело. Остальные морские свинки заболели.

Всего было обследовано в опытах 25 морских свинок.

Пример 2.

Формируют 2 группы телят в возрасте до одного месяца и в возрасте 3-4 месяца из неблагополучных по туберкулезу хозяйств.

Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность ЛДГ, КК, ACT и АЛТ.

Результаты исследований представлены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2
Биохимические показатели плазмы крови телят в возрасте до одного месяца
№ п/п	ACT (Е/л)	АЛТ (Е/л)	КК (Е/л)	ЛДГ (Е/л)
1	17,8	5,6	144,3	1475,2
2	16,6	1,1	199,8	1167,7
3	18,9	3,3	142,1	1275,3
4	16,6	3,3	153,2	1301,6
5	20,0	2,2	133,2	1231,5
6	16,6	2,2	177,6	1772,4
7	18,9	1,1	146,5	2003,6
8	17,8	3,3	180,9	1633,9
9	14,4	1,1	194,2	1461,9
Ср	17,51	2,58	163,53	1480,34
Таблица 3
Биохимические показатели плазмы крови телят в возрасте 3-4 месяцев
№ п/п	ACT (Е/л)	АЛТ (Е/л)	КК (Е/л)	ЛДГ (Е/л)
1	47,7	7,8	228,7	1806,0
2	78,8	14,4	385,2	2704,0
3	63,3	13,3	444,0	2716,2
4	51,4	12,2	254,8	2344,8
5	60,9	12,1	428,0	2431,0
6	75,6	13,8	339,7	2064,6
7	104,3	20,0	906,9	3506,0
8	36,6	7,8	226,4	1536,2
9	45,5	5,6	258,6	1511,8
10	41,4	6,6	243,9	1534,0
Ср.	60,55	1136	371,62	2215,46

В первой группе (см. таблицу 2) у 4 животных (№2, №6, №8, №9) из 9 показатель КК выше среднего значения и у 6 животных (№1-5, №9) ЛДГ ниже среднего значения. В данной группе животных только у двух телят (№2 и №9) значения КК и ЛДГ соответствуют условиям отбора.

У отобранных телят (№2 и №9) произвели сравнение показателей ACT и АЛТ и ОХс.

Уровень АЛТ у обоих животных оказался ниже среднего.

Концентрация холестерина у животного №2 ниже, а у животного №9 выше среднего.

Совокупность полученных данных позволяет сделать вывод о высокой устойчивости к туберкулезу животных №2 и №9, причем у животного №9 она выше.

Таким образом, 22% животных будут устойчивы к туберкулезу.

Из таблицы 3 следует, что показатели ЛДГ ниже среднего значения наблюдались у животных №1, 6, 8, 9, 10, показатель КК выше среднего был у животных №2, 3, 5, 7.

Поскольку ни одно животное не удовлетворяло требуемому условию (одновременно превышения КК и понижения ЛДГ относительно среднего значения), делаем вывод об отсутствии устойчивых к туберкулезу животных в этой группе.

Всего в опытах было использовано 40 телят. В дальнейшем, за этими телятами вели наблюдения в течение 4 лет.

Животные №2 и №9 (таблица 2) туберкулезом не заразились. Животные №1, 3-8, 10 (таблица 2), находясь в естественных условиях неблагополучного хозяйства, заразились туберкулезом.

Все животные, указанные в таблице 3, в дальнейшем также заразились.

Пример 3. Исследования проводились на крысах.

Берут у них кровь, стабилизируют гепарином, получают плазму и определяют в ней активность ЛДГ, КК.

Для повышения точности оценки устойчивости определяют ACT и АЛТ. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4
Биохимические показатели плазмы крови крыс
№ животного	ЛДГ (Е/л)	КК (Е/л)	АЛТ (Е/л)	АСТ (Е/л)
1	307,5	411,0	40,0	88,0
2	352,8	421,8	346,3	279,7
3	853,9	390,6	24.4	108,8
4	743,9	137,6	71,0	93,2
5	328,5	501,7	42,2	108,9
6	184,6	380,7	35,5	95,5
7	330,2	515,0	57,7	117,7
8	479,5	148,5	55,5	99,9
9	319,7	473,1	35,5	102,1
10	392,6	799,2	113,2	137,6
11	417,4	474,3	144,8	254,7
12	1430,7	148,5	59,9	88,9
13	1045,5	190,9	17,8	51,1
14	443,7	466,2	24,4	102,1
15	240,9	478,5	28,9	139,9
16	424,9	586,1	26,6	104,3
17	332,7	697,1	51,1	91,0
18	283,0	410,7	31,1	66,6
19	438,7	768,1	46,6	128,8
20	495,8	558,9	24,4	68,8
21	503,9	475,3	20,0	68,9
22	528,4	577,4	17,8	66,6
23	514,4	555,8	35,5	55,5
24	196,5	455,4	59,9	84,5
25	1233,6	137,6	42,3	59,9
26	1285,3	146,5	24,4	102,1
Ср. зн.	550,18	427,32	56,8	106,38

Как видно из таблицы 4, у 15 из 26 крыс (57,6%) значения КК и ЛДГ соответствуют условиям отбора: одновременно показатель КК выше среднего и показатель ЛДГ ниже среднего значения (№5, 7, 9-11, 14-17, 19-24).

Дополнительные критерии оценки по значениям АЛТ и ACT выявили, что у одних животных отобранной группы уровень активности АЛТ ниже среднего (№9, 14, 16, 17, 20-23), у других уровень активности ACT - выше среднего (№7, 10, 11), а у третьей - одновременно уровень активности АЛТ ниже среднего и активности ACT выше среднего (№5, 15, 19).

Все крысы были также подвергнуты экспериментальному заражению туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis. Отобранные 15 крыс, кровь которых удовлетворяла критерию устойчивости, не заболели, остальные заболели.

Из 100 крыс, всего использованных в эксперименте, 75 удовлетворяли необходимому условию, из них при экспериментальном заражении животных 68 крыс не заболели (90%). Из оставшихся 25 при экспериментальном заражении заболели все животные.

Пример 5.

Исследования проводились на кроликах. Определяли активность ЛДГ, КК, ACT и АЛТ.

Результат представлен в таблице 5.

Таблица 5
Биохимические показатели плазмы крови кроликов
№ животного	ЛДГ (Е/л)	КК (Е/л)	АЛТ (Е/л)	АСТ (Е/л)
1	277,0	568,0	25,4	39,2
2	487,0	871,0	25,3	38,5
3	399,0	771,0	35,1	44,4
4	963,0	958,0	36,3	46,2
5	631,0	609,0	39,7	21,8
6	963,0	487,0	163,9	358,1
7	587,0	450,0	28,7	37,2
8	299,0	245,0	35,2	41,8
9	509,0	718,0	29,1	29,7
10	465,0	656,0	19,8	12,1
11	399,0	529,0	33,2	38,1
12	819,0	972,0	80,3	458,2
13	252,31	690,0	43,73	51,75
14	498,85	310,0	100,17	235,72
Ср. зн.	539,23	631,0	49,71	103,77

Как видно из таблицы 5, у 5 кроликов из 14 (35,7%) одновременно показатель КК выше среднего и показатель ЛДГ ниже среднего значения - животные №2, 3, 9, 10, 13. Дополнительные критерии оценки по значениям ACT и АЛТ выявили у всех 5 животных данной отобранной группы уровень активности АЛТ ниже среднего.

Из 30 кроликов, использованных в эксперименте, только 10 удовлетворяли критерию отбора на устойчивость.

Кролики также подвергались экспериментальному заражению туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.bovis.

Животные, кровь которых удовлетворяла критерию отбора, не заболели, а остальные 20 кроликов заболели.

Пример 6.

Исследования проводились на цыплятах - кросса «Родонит-2» в возрасте до 110 дней (яйценоские) и кросса «Иза» (бройлеры) в возрасте до 45 дней.

Из 100 цыплят кросса «Родонит-2» и 50 цыплят-бройлеров кросса «Иза» необходимому условию не удовлетворял никто. Все цыплята при экспериментальном заражении туберкулезом путем подкожного введения 0,1 мл суспензии, содержащей 1 мг/мл культуры M.avium, заболели.

В таблицах 6 и 7 представлены результаты исследований.

Таблица 6
Биохимические показатели плазмы крови цыплят кросса «Родонит-2»
№ животного	ЛДГ (Е/л)	КК (Е/л)	АЛТ (Е/л)	АСТ (Е/л)
1	955,5	1634,8	11,4	171,5
2	800,0	1488,0	14,8	194,4
3	713,3	1262,0	9,6	177,8
4	692,5	1178,8	2,2	142,5
5	885,6	1594,7	8,9	175,6
6	738,7	1438,7	6,6	168,0
7	1278,9	2322,8	4,4	192,2
8	787,8	1501,0	3,3	183,3
Ср. зн.	856,54	1552,6	7,65	175,66

Таблица 7
Биохимические показатели плазмы крови цыплят кросса «Иза»
№ животного	ЛДГ (Е/л)	КК (Е/л)	АЛТ (Е/л)	АСТ (Е/л)
1	3104,0	4407,0	9,4	155,2
2	3059,0	4466,0	10,7	161,0
3	2894,0	3936,0	10,8	144,7
4	3232,0	4751,0	10,2	190,1
5	2846,0	3988,0	11,4	149,8
6	3604,0	5694,0	9,8	156,7
7	3392,0	5224,0	10,1	154,2
8	2559,0	3327,0	7,8	139,1
9	3628,0	4680,0	11,8	162,7
10	2768,0	4484,0	8,7	141,2
11	2856,0	3284,0	10,2	127,7
12	3371,0	5258,0	12,9	179,3
13	4528,0	6113,0	7,8	185,6
14	3211,0	4810,0	11,4	177,4
15	3321,0	4483,0	2,4	184,1
16	2557,0	4525,0	12,7	236,0
Ср. зн.	3183,13	4589,38	9,88	165,3

Таким образом, заявляемый метод позволяет эффективно выявлять среди здоровых животных (как лабораторных, так и сельскохозяйственных) устойчивых к заболеванию туберкулезом.

1. Способ оценки устойчивости организма животного к туберкулезу путем исследования крови, отличающийся тем, что формируют группу клинически здоровых животных одного вида, исследуют активность креатинкиназы и лактатдегидрогеназы, определяют среднее значение каждого из этих показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение показателя каждого животного со средней величиной этого же показателя для конкретной группы животных, при повышении активности креатинкиназы и одновременном понижении активности лактатдегидрогеназы относительно среднего значения каждого показателя для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.

2. Способ оценки устойчивости организма животного к туберкулезу по п.1, отличающийся тем, что дополнительно исследуют активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, определяют среднее значение каждого из показателей для конкретной группы животных, сравнивают значение аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы только у животных с повышенной активностью креатинкиназы и пониженной активностью лактатдегидрогеназы со средней величиной аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы соответственно для конкретной группы животных, при понижении активности аланинаминотрансферазы и/или повышении активности аспартатаминотрансферазы относительно среднего значения каждого из этих показателей для конкретной группы животных судят об устойчивости организма животного к туберкулезу.