Рекомбинантные векторы на основе "живого" вируса оспы домашней птицы и их применение в фармацевтических композициях против вируса гепатита с

Рекомбинантные векторы на основе "живого" вируса оспы домашней птицы и их применение в фармацевтических композициях против вируса гепатита с

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и вирусной вакцинации, а в частности вакцинации рекомбинантным вирусом оспы домашней птицы, экспрессирующим белки вируса гепатита С (HCV), и к фармацевтическим композициям, способным индуцировать клеточный иммунный ответ против HCV.

Предшествующий уровень техники

Вирус HCV впервые был идентифицирован в 1989 г. методами молекулярной биологии как главный этиологический фактор посттрансфузионного не-А, не-В гепатита (Choo Q. L., Kuo G. et al. (1989) Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244:359-62; EP0318216 Chiron Corp). В настоящее время во всем мире этим вирусом инфицированы более 170 миллионов человек. HCV-инфекция присутствует в организме человека в 85% случаев, и в большинстве случаев она вызывает цирроз и гепатоцеллюлярную карциному (Caselmann W. H., Alt M. (1996) Hepatitis C virus infection as a major risk factor for hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 24:61-66). Фактически в 25% случаев через 25 лет после инфицирования у индивидуумов-носителей хронической HCV-инфекции ежегодно регистрируется развитие цирроза, а в 1-4% случаев - развитие гепатоцеллюлярной карциномы (Prince A. M., Shata M. T. (2001) Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection. Clin. Liver Dis. 5:1091-103). Курс лечения HCV-инфекции основан на проведении интенсивной терапии путем введения комбинации ПЭГилированных интерферонов. Однако такое лечение является инвазивным и дорогостоящим и дает эффект только менее чем в 50% случаев (Prince A. M., Shata M. T. (2001) Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection. Clin. Liver. Dis. 5:1091-103).

Различные варианты субъединиц белка, вирусоподобные частицы, синтетические пептиды, рекомбинантные “живые” векторы и ДНК-конструкции для ДНК-иммунизации, основанной на антигенах HCV, оценивали как варианты, которые могут быть использованы в методах вакцинации (US6635257, US6387662, US6235888, US6685944, US2003021805, Lechmann M., Liang T. J. (2000) Vaciine development for hepatitis C. Semin. Liver. Dis. 20:211-26). Было продемонстрировано, что некоторые из этих вариантов обладают способностью вырабатывать специфический иммунный ответ против эпитопов HCV, хотя считается, что этот ответ все же является недостаточным. В настоящее время иммунологические параметры, коррелирующие с защитной функцией против HCV-инфекции, пока еще точно не определены. Тем не менее, несколько проведенных исследований дали основание предположить, что ранний сильный и мультиспецифический цитотоксический Т-клеточный ответ наряду с CD4⁺-Th1-клеточным ответом благоприятствует развитию иммунитета против вируса и способствует эффективному лечению заболевания. В противоположность этому поздний Т-клеточный ответ ассоциируется с развитием хронической иммунопатологии печени (Cerny A., Chisari F.V. (1999) Pathogenesis of chronic hepatitis C: immunological features of hepatic injury and viral persistente. Hepatology. 30:595-601; Cooper S. et al. (1999) Analysis of a successful immune response against hepatitis C virus. Immunity 10:439-49; Lechner F. et al. (2000) Why do cytotoxic T lymphocytes fail to eliminate hepatitis C virus? Lessons from studies using major histocompatibility complex class I peptide tetramers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 355:1085-92; Takaki A. et al. (2000). Cellular immune responses persist and humoral responses decrease two decades after recovery from single-source outbreak of hepatitis C. Nat. Med. 6:578-82).

Рекомбинантные “живые” векторы являются привлекательными кандидатами на вырабатывание клеточного иммунного ответа против HCV. В результате иммунизации мышей рекомбинантным аденовирусом, полученным на основе сердцевины HCV и Е1, вырабатывается специфический цитотоксический Т-клеточный ответ против этих антигенов (Bruna-Romero O. et al. (1997) Induction of cytotoxic T-cell response against hepatitis C virus structural antigens using a defective recombinant adenovirus. Hepatology 25:470-7). Хотя эти результаты являются многообещающими, однако возникшие в настоящее время проблемы, связанные с использованием рекомбинантного аденовируса в генотерапии, вызывают сомнение в возможности их использования для лечения человека. Применение рекомбинантных вирусов коровьей оспы и оспы канареек, содержащих различные гены HCV, как показал анализ антигена, приводит к индуцированию цитотоксических Т-клеточных ответов у мышей в том случае, если они были объединены с вакцинами-кандидатами, полученными на основе ДНК-конструкций (Pancholi P. et al. (2000) DNA prime-canarypox boost with polycistronic hepatitis C virus (HCV) genes generates potent immune responses to HCV structural and nonstructural proteins. J. Infect. Dis. 182:18-27; Pancholi P. et al. (2003) DNA immunization with hepatitis C virus (HCV) polycistronic genes or immunization by HCV DNA priming-recombinant canarypox virus boosting induces immune response and protection from recombinant HCV-vaccinia virus infection in HLA-A2.1-transgenic mice. J. Virol. 77:382-90). Фактически нет никаких свидетельств о том, что in vivo индуцирование клеточного иммунного ответа после введения индивидууму рекомбинантных вирусов оспы канареек, полученных на основе структурных антигенов HCV, будет эффективным, например, у модели, инфицированной рекомбинантным вирусом коровьей оспы. К этой группе вирусов также принадлежит вирус оспы домашней птицы, который до настоящего времени не использовался для индуцирования иммунного ответа против антигенов HCV. Вирус оспы домашней птицы не реплицируется в клетках млекопитающих, но он может проникать в цитоплазму клетки-хозяина и эффективно экспрессировать в этой цитоплазме белки, кодируемые своим геномом. Исходя из этих свойств было высказано предположение о том, что риск, ассоциированный с использованием вектора, полученного на основе рекомбинантного вируса оспы домашней птицы, для лечения человека будет снижаться при использовании векторов, полученных на основе других “живых” вирусов.

В настоящее время на фармацевтическом рынке отсутствует вакцина против HCV-инфекции. Действительно, большинство исследований пока еще находятся на предклиническом этапе. Таким образом, разработка профилактических и/или терапевтических средств, эффективных для лечения HCV-инфекции, все еще остается крайне актуальной.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение несмотря на все ограничения и предшествующий уровень техники позволяет решить вышеупомянутую проблему путем конструирования рекомбинантного вируса оспы домашней птицы, содержащего фрагменты ДНК, происходящие от HCV, в неосновной области генома вируса оспы домашней птицы и способного индуцировать специфический клеточный иммунный ответ против HCV, где указанными областями являются аминокислотные области, соответствующие антигенам HCV, экспрессируемым вирусом оспы домашней птицы.

В соответствии с настоящим изобретением вирус FPCoEl содержит фрагмент ДНК, определенный последовательностью SEQ ID NO:1, кодирующий белок, содержащий аминокислоты 79-338, включая часть корового белка и Е1, а вирус FPBS содержит фрагмент ДНК, определенный последовательностью SEQ ID NO:2, кодирующий химерный белок, включая эпитопы, к которым специфичны CD4⁺- и CD8⁺-T-лимфоциты, соответствующие различным антигенам HCV. В этих вирусах последовательность, кодирующая антигены HCV, происходит от кДНК кубинского изолята HCV (Morales J. et al., WO 98/25960).

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, индуцирующей специфический клеточный иммунный ответ против HCV и содержащей эффективное количество рекомбинантного вируса оспы домашней птицы и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Рекомбинантные вирусы оспы домашней птицы согласно изобретению обладают способностью проникать в человеческие клетки и экспрессировать антигены HCV в цитоплазме. Экспрессия в человеческих клетках регулируется транскрипционной единицей, полученной на основе раннего/позднего синтетического промотора вируса оспы домашней птицы. Эти вирусы также содержат ген ксантин-гуанозин-фосфорибозилтрансферазы, находящийся под контролем промотора 7.5К, происходящего от вируса коровьей оспы. Эти вирусы не способны реплицироваться у человека.

Эта композиция может быть введена внутримышечно, внутрибрюшинно или подкожно. Такое введение может быть осуществлено с помощью шприцов, “дробовика” для выстеливания генов, ингалятора, или с помощью других устройств для иммунизации. Каждому индивидууму вводят дозу, составляющую 2,5×10⁷-1×10⁸ б.о.е./дозу, в определенном объеме. В настоящем изобретении также описаны способы введения рекомбинантных вирусов оспы домашней птицы с применением стратегии первичной иммунизации/бустер-иммунизации ДНК-конструкциями. Рекомбинантные вирусы оспы домашней птицы могут быть также введены с применением стратегий первичной иммунизации/бустер-иммунизации белками или другими вирусами, рекомбинантными по антигенам HCV, или одновременно цитокинами и другими иммуностимулирующими молекулами. Эти комбинации позволяют продуцировать новые специфичные к эпитопам молекулы или усиливать специфический иммунный ответ. Фармацевтические композиции, полученные на основе вирусов оспы домашней птицы, рекомбинантных по антигенам HCV, могут иметь следующие преимущества, а именно:

- они могут индуцировать эффективный специфический клеточный иммунный ответ;

- для достижения нужного эффекта требуется меньшее число процедур иммунизации;

- эти композиции могут быть использованы в качестве основы для получения комбинированных вакцин;

- не требуется введение адъюванта;

- эти композиции могут быть использованы в комбинации с противовирусными средствами.

В некоторых случаях указанные фармацевтические композиции для индуцирования иммунного ответа против HCV могут быть введены до проведения другой терапии или вакцинации либо одновременно с их проведением, либо после их проведения. Указанные фармацевтические композиции могут быть введены для индуцирования профилактического иммунного ответа против HCV-инфекции, а также для индуцирования иммунного ответа у пациентов с хроническим гепатитом С, циррозом и раком печени.

Краткое описание графического материала

Фиг.1: Схематически представлены области, соответствующие антигенам HCV в рекомбинантных вирусах оспы домашней птицы.

Фиг.2: Схема иммунизации различными рекомбинантными вирусами оспы домашней птицы. (А): Вырабатывание антител. (В): Вырабатывание секреторного интерферона гамма. (С): Ответ на инфицирование вирусом коровьей оспы, рекомбинантным по структурным антигенам HCV.

Фиг.3: Схема иммунизации вирусами FPCoE1 и FPBS с применением различных методов инокуляции. Ответ на инфицирование вирусом коровьей оспы, рекомбинантным по структурным антигенам HCV.

Фиг.4: Схема иммунизации различными количествами FPCoE1 и FPBS. Ответ на инфицирование вирусом коровьей оспы, рекомбинантным по структурным антигенам HCV.

Фиг.5: Схема иммунизации на основе комбинаций FPCoE1 и препарата ДНК-вакцины. (А): Вырабатывание антител против сердцевины, Е1 и Е2. (В): Ответ на инфицирование вирусом коровьей оспы, рекомбинантным по структурным антигенам HCV.

Примеры осуществления настоящего изобретения

Используемые в настоящем изобретении термины “вирус гепатита С” или “HCV” означают общее родовое название вируса и не ограничиваются конкретной вирусной последовательностью или конкретным изолятом HCV.

Аналогичным образом следует отметить, что термин “кодирующая последовательность” означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая транслируется в полипептид обычно посредством мРНК, если она находится под контролем “правильной” регуляторной последовательности. В данном случае термин “кодирующая последовательность” может включать, но не ограничивается ими, кДНК и рекомбинантные нуклеотидные последовательности.

Настоящее изобретение более подробно описано в нижеследующих примерах, которые приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение изобретения.

Пример 1: Оценка FPCoE1c, FPCoE1 и FPBS

Для оценки способности вирусов оспы домашней птицы, рекомбинантных по антигенам HCV, индуцировали специфическийклеточный иммунный ответ, получали вирусы FPCoE1c, FPCoE1 и FPBS. На фиг.1 схематически представлена последовательность, соответствующая антигенам HCV. Указанные вирусы получали следующим образом: фибробласты куриных эмбрионов инфицировали вирусом оспы домашней птицы и трансфецировали плазмидами pFPCoE1c, pFPCoE1 или pFPBS с использованием липофектамина (Invitrogen, USA). Эти плазмиды происходили от плазмиды pFP67xgpt (Vazquez-Blomquist D., Gonzalez S., Duarte C.A. (2002) Effect of promoters on cellular immune response induced by recombinant fowlpox virus expressing multi-epitope polypeptides from HIV-1. Biotechnol. Appl. Biochem. 36:171-9) и содержали последовательность (SEQ ID NO:1), кодирующую области, включающие аминокислоты 1-338 и 79-338, или последовательность (SEQ ID NO:2), кодирующую химерный белок, сконструированный на основе эпитопов, к которым специфичны Т-лимфоциты (плазмиды pFPCoE1c, pFPCoE1 и pFPBS соответственно). Затем проводили несколько циклов очистки вируса в селективной среде, содержащей ксантин, гипоксантин и микофеноловую кислоту. После этого вирусный продукт, находящийся в планшете для инфицирования, амплифицировали и присутствие вставки, соответствующей последовательности HCV, подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции.

Иммуногенность вирусов FPCoEic, FPCoEl и FPBS исследовали на 8-недельных самках мышей BALB/c после двух внутрибрюшинных введений (с интервалами в 3 недели) 2,5×10⁷ б.о.е. Каждая группа иммунизации включала десять животных. На фиг.2А показано, что только FPCoE1-иммунизация способна индуцировать детектируемые уровни антител против сердцевины и Е1. Однако на фиг.2В показано, что позитивный ответ, заключающийся в секреции IFN-гамма лимфоцитами животных, иммунизованных вирусами FPCoE1 и FPBS соответственно, является статистически значимым по сравнению с ответом, детектируемым у животных, иммунизованных вирусом, используемым в качестве негативного контроля, FP9 (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Иммунизация вирусом FPCoE1c не индуцировала позитивного ответа, заключающегося в секреции лимфоцитами IFN-гамма. Кроме того, как показано на фиг.2С, у группы животных, иммунизованных вирусами FPCoE1 и FPBS, наблюдалось значимое снижение (т-критерий Стьюдента, р<0,05) вирусной нагрузки в яичниках после их инфицирования 10⁶ б.о.е. вируса коровьей оспы (vvRE), рекомбинантного по структурным антигенам HCV (аминокислоты 1-650 полипротеина HCV) по сравнению с вирусной нагрузкой, наблюдаемой после инфицирования контрольным вирусом коровьей оспы (WR), не являющимся рекомбинантным по антигенам HCV. Кроме того, vvRE-вирусная нагрузка у животных, иммунизованных вирусами FPCoE1 и FPBS, была статистически ниже по сравнению с вирусной нагрузкой, детектируемой у животных, иммунизованных вирусом оспы домашней птицы FP9, используемым в качестве негативного контроля (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Иммунизация вирусом FPCoE1c не приводила к значимому снижению вирусной нагрузки в яичниках. Инфицирование вирусом коровьей оспы осуществляли путем его внутрибрюшинного введения через 2 недели после последней иммунизации вирусами оспы домашней птицы. Через 5 дней после инокуляции вирусом коровьей оспы извлекали яичники. Инфицирование рекомбинантными вирусами коровьей оспы широко применяется в целях иллюстрации способности вакцины-кандидата вырабатывать сильный клеточный иммунный ответ in vivo. В частности, снижение клеточного титра в яичниках ассоциируется, главным образом, с индуцированием сильного CD8⁺-Т-лимфоцитарного ответа.

Пример 2: Способы введения вирусов оспы домашней птицы (внутрибрюшинное, подкожное и внутримышечное)

Для оценки влияния способа инокуляции на иммунный ответ, продуцируемый рекомбинантными вирусами оспы домашней птицы, была проведена иммунизация 8-недельных самок мышей BALB/c. Каждая группа иммунизации включала десять животных. Вирусы (2,5×10⁷ б.о.е.) вводили внутрибрюшинно, внутримышечно или подкожно за две стадии иммунизации с интервалами в 3 недели. На фиг.3 показано, что между этими способами иммунизации не существует какого-либо значимого различия с точки зрения способности рекомбинантных вирусов оспы домашней птицы FPCoE1 и FPBS снижать вирусную нагрузку в яичниках после инфицирования вирусом коровьей оспы vvRE. Эти 2 рекомбинантных вируса индуцировали позитивный ответ, заключающийся в снижении вирусной нагрузки, по сравнению с вирусом оспы домашней птицы, FP9, используемым в качестве негативного контроля (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Инфицирование вирусом коровьей оспы осуществляли путем внутрибрюшинного введения 10⁶ б.о.е. вируса коровьей оспы vvRE через 2 недели после последней иммунизации вирусами оспы домашней птицы. Через 5 дней после инфицирования вирусом коровьей оспы извлекали яичники.

Пример 3: Сравнение доз (0,9×10⁷, 2,5×10⁷, 5×10⁷ и 1×10⁸ б.о.е.)

Самок мышей BALB/C иммунизовали путем внутримышечного введения различных количеств рекомбинантных вирусов оспы домашней птицы на недели 0 и 3. Каждая группа иммунизации включала 10 животных. На фиг.4 показано, что у мышей, иммунизованных 0,9×10⁷ б.о.е., не наблюдалось каких-либо значимых различий в отношении вирусной нагрузки, детектируемой в яичниках после инфицирования 10⁶ б.о.е. vvRE, через 2 недели после последней иммунизации вирусами оспы домашней птицы. В противоположность этому введение 2,5×10⁷, 5×10⁷ и 1×10⁸ б.о.е. FPCoE1 и FPBS приводило к значимому снижению vvRE-вирусной нагрузки в яичниках по сравнению с вирусной нагрузкой, детектируемой у животных, инокулированных аналогичными количествами вируса оспы домашней птицы, FP9, используемого в качестве негативного контроля (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Во всех случаях через 5 дней после инокуляции vvRE извлекали яичники.

Пример 4: Первичная иммунизация/бустер-иммунизация ДНК и вирусами оспы домашней птицы

Для оценки иммунного ответа, индуцированного первичной иммунизацией/бустер-иммунизацией, включающей введение комбинации из полученной на основе ДНК вакцины-кандидата и вируса оспы домашней птицы, рекомбинантного по антигенам HCV, проводили иммунизацию 8-недельных самок мышей BALB/c. Каждая группа иммунизации включала 10 животных. Животных одной группы (Со-pIDKE2) иммунизовали на недели 0, 3, 7 и 12 путем внутримышечного введения смеси 100 мкг плазмиды, экспрессирующей первые 650 аминокислот полипротеина HCV, pIDKE2 (Duenas-Carrera S. et al. (2004). Immunization with a DNA vaccine encoding the hepatitis C virus structural antigens elicits a specific immune response against the capsid and envelope proteins in rabbits and Macaca irus (crab-eating macaque monkeys). Biotechnol. Appl. Biochem. 39:249-55) и 10 мкг рекомбинантного белка сердцевины HCV, Со.120 (Alvarez-Obregon J.C. et al. (2001). A truncated HCV core protein elicits a potent immune response with a strong participation of cellular immunity components in mice. Vaccine 19:3940-46). Животных другой группы (pAEC-K6) иммунизовали в аналогичных условиях плазмидой рАЕС-К6, используемой в качестве негативного контроля (Herrera A.M. et al. (2000) A family of compact plasmid vectors for DNA immunization in human. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:548-51). Животных другой группы иммунизовали на недели 0 и 3 путем внутримышечного введения 2,5×10⁷ б.о.е. вируса FPCoE1. Кроме того, животных этой группы иммунизовали в тех же самых условиях вирусом оспы домашней птицы, FP9, используемым в качестве негативного контроля. Затем животных одной из групп (Co-pIDKE2/FPCoE1) иммунизовали на недели 0 и 3 путем внутримышечного введения смеси Co-pIDKE2, а на недели 9 и 12, их иммунизовали вирусом FPCoE1. Животных другой группы (Co-pIDKE2/FP9) иммунизовали аналогичным образом за исключением того, что этим животным на 6-ю и на 9-ю недели вводили FP9. На фиг.5 показано, что самые высокие уровни антител индуцировались у группы, которой вводили Co-pIDKE2 (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Кроме того, в результате первичной иммунизации/бустер-иммунизации, предусматривающей введение комбинации Co-pIDKE2 и FPCoE1, индуцировались более высокие уровни антител по сравнению с уровнями, наблюдаемыми у группы, которой вводили только FPCoE1 (т-критерий Стьюдента, р<0,05). На фиг.5В можно видеть, что у животных обеих групп, иммунизованных вирусами FPCoE1 или Co-pIDKE2, а также у группы, иммунизованной вирусом Co-pIDKE2 в первых 2 дозах и вирусом FPCoE1 в других 2 дозах, наблюдалось значимое снижение (т-критерий Стьюдента, р<0,05) vvRE-вирусной нагрузки после их инфицирования по сравнению с вирусной нагрузкой у животных, иммунизованных вирусами, используемыми в качестве негативного контроля. Самая низкая вирусная нагрузка наблюдалась у животных, иммунизованных вирусом Co-pIDKE2 в первых 2 дозах и вирусом FPCoE1 в других 2 дозах. Инфицирование вирусом коровьей оспы осуществляли путем внутрибрюшинного введения 10⁶ б.о.е. вируса коровьей оспы vvRE через 2 недели после последней иммунизации. Через 5 дней после инокуляции вирусом коровьей оспы vvRE извлекали яичники.

1. Рекомбинантный вирус оспы домашней птицы, индуцирующий иммунный ответ против вируса гепатита С (HCV), содержащий ДНК-фрагмент, полученный из HCV, где указанный ДНК-фрагмент, определенный последовательностью SEQ ID NO:1, кодирует фрагмент полипротеина сердцевины-El, состоящего из аминокислотной (а.к.) последовательности, соответствующей а.к. 79-338 указанного полипептида.

2. Вирус оспы домашней птицы по п.1, происходящий от pFP67xgpt.

3. Рекомбинантный вирус оспы домашней птицы, индуцирующий иммунный ответ против HCV, где указанный фрагмент ДНК определен последовательностью SEQ ID NO:2, кодирующей химерный белок, содержащий эпитопы HCV, специфичные к хелперным и цитотоксическим Т-клеткам.

4. Вирус оспы домашней птицы по п.3, происходящий от pFP67xgpt.

5. Фармацевтическая композиция, индуцирующая специфический клеточный иммунный ответ против HCV, содержащая эффективное иммуногенное количество рекомбинантного вируса оспы домашней птицы по пп.1-4, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, где указанная эффективная для иммунизации доза составляет от 2,5·10⁷ до 1·10⁸ б.о.е/дозу.

7. Фармацевтическая композиция по пп.5 и 6, индуцирующая профилактический иммунный ответ против HCV-инфекции.

8. Фармацевтическая композиция по пп.5 и 6, индуцирующая иммунный ответ против HCV у пациентов с хроническим гепатитом С, циррозом и раком печени.

9. Фармацевтическая композиция по пп.5 и 6, индуцирующая иммунный ответ против HCV до проведения другой терапии или вакцинации, либо одновременно с ее проведением, либо после ее проведения.