Вакцинная композиция и способ индуцирования иммунологического ответа у животного

Вакцинная композиция и способ индуцирования иммунологического ответа у животного

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка претендует на приоритет относительно US Provisional App. No.60/490345 от 24 июля 2003 г., содержание которой включено путем ссылки во всей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается эмульсий типа «масло в воде», их применения в качестве адъювантов и содержащих их фармацевтических, иммунологических или вакцинных композиций.

Уровень техники

Применение адъювантов в вакцинах хорошо известно. Адъювант - это соединение, которое, в сочетании с антигеном вакцины, повышает иммунный ответ на вакцинный антиген по сравнению с ответом, вызванным одним только антигеном. Среди подходов, усиливающих иммуногенность антигенов, есть такие, при которых вакцинные антигены становятся корпускулярными, при которых вакцинные антигены подвергаются полимеризации или эмульгированию, к ним также относятся методы инкапсулирования вакцинных антигенов, способы повышения присущих организму реакций цитокинов и способы доставки вакцинных антигенов на антиген-презентирующие клетки (Nossal, 1999, In: Fundamental Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.; Vogel and Powell, 1995, In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.), Plenum Press, NY, N.Y., p.141). Поскольку адъюванты играют важную роль в усилении иммуногенности вакцинных антигенов, применение адъювантов при составлении вакцин стало фактически повсеместным (Nossal, 1999, supra; Vogel and Powell, 1995, supra; см. также РСТ publication WO 97/18837, основные положения которой включены в настоящее изобретение путем ссылки). Традиционные адъюванты, хорошо известные в данной области, разнообразны по природе. Например, они могут состоять из водонерастворимых неорганических солей, липосом, мицелл или эмульсий, как адъювант Фрейнда. Другие адъюванты можно найти в работе Vogel and Powell, 1995, приведенной выше. Несмотря на то, что единого механизма действия адъювантов не существует, основной характеристикой является их способность к значительному усилению иммунного ответа на антиген вакцины по сравнению с ответом, вызванным одним только антигеном (Nossal, 1999, supra; Vogel and Powell, 1995, supra). В этом отношении некоторые адъюванты более эффективно усиливают гуморальные иммунные ответы, другие адъюванты более эффективно повышают клеточные иммунные ответы (Vogel and Powell, 1995, supra), а еще одна группа адъювантов повышает как гуморальные, так и клеточные иммунные ответы на вакцинные антигены (Vogel and Powell, 1995, supra).

Обычно используемые в составе вакцин эмульсии включают смесь из масла, водного раствора и детергентов. Некоторые эмульсии содержат липофильный детергент типа Span 80 и гидрофильный детергент типа Tween 80. Эти эмульсии могут содержать и такие соединения, как лецитин или сапонин, которые, как известно, обладают свойствами ионных детергентов.

Однако с эмульсиями, используемыми в качестве адъювантов, могут наблюдаться проблемы стабильности, в частности, при хранении или транспортировке. Это особенно верно в том случае, когда эти композиции содержат концентрированные иммуногены, в особенности неочищенные концентрированные иммуногены. Как правило, это случается с адъювантами, используемыми в инактивированных (убитых) вакцинах. Эта проблема еще более значительна для мультивалентных вакцинных композиций, так как в них иммуногены более сконцентрированы в том же объеме разбавителя.

Другая проблема применения адъювантов связана с риском неблагоприятных случаев, таких как токсичность или местное воспаление на месте инъекции. Например, после инъекции может возникнуть местная воспалительная реакция и/или гранулема. Для того чтобы ограничить такие неблагоприятные реакции, можно уменьшить содержание детергентов и других компонентов в эмульсии, однако такое уменьшение может привести к снижению стабильности вакцинной композиции. Следовательно, существует потребность в новых адъювантах и вакцинных композициях, содержащих такие адъюванты, обладающих повышенной безопасностью и устойчивостью.

Сущность изобретения

В первом воплощении настоящее изобретение предусматривает новые эмульсии типа «масло в воде» (М/В) с повышенной устойчивостью в присутствии бактериальных или вирусных суспензий, особенно концентрированных и неочищенных, или слабо очищенных.

Другое воплощение настоящего изобретения предусматривает устойчивые, безопасные и легко вводимые, в частности, пригодные для инъекций эмульсии типа М/В, действующие как носители для доставки фармацевтической композиции, включающей, по меньшей мере, один активный ингредиент, которым, в частности, может быть иммуноген.

Следующее воплощение настоящего изобретения предусматривает устойчивые, безопасные и пригодные для инъекций эмульсии типа М/В, действующие как адъюванты, для повышения иммунного ответа, вызванного иммуногеном. В частности, настоящее изобретение предусматривает новые адъюванты, которые при использовании их в вакцинной композиции, содержащей иммуноген, повышают у вакцинированных клеточный иммунный ответ, гуморальный иммунный ответ или, предпочтительно, оба ответа на иммуноген.

Следующее воплощение настоящего изобретения предусматривает устойчивые, безопасные и иммуногенные композиции или вакцины, включающие эмульсию М/В.

Следующее воплощение настоящего изобретения предусматривает способ получения вакцинной композиции с использованием адъюванта настоящего изобретения; полученную при этом вакцинную композицию; и способы ее применения.

Следующее воплощение настоящего изобретения предусматривает набор, включающий иммуноген или иной фармацевтический продукт в первом флаконе, и адъювант, полученный в соответствии с настоящим изобретением, во втором флаконе, причем адъювант должен быть смешан с иммуногеном или иным вакцинным продуктом перед применением.

В одном предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает эмульсию для инъекций типа «масло в воде» (М/В), включающую:

(1) водный раствор, содержащий иммуноген;

(2) минеральное масло;

(3) неионный липофильный детергент;

(4) неионный гидрофильный детергент с низким значением гидрофильно-липофильного баланса (HLB, hydrophilic-lipophilic balance), который включает этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита (обычно имеющие значение HLB между 11 и 13).

В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает эмульсию для инъекций типа «масло в воде» (М/В), включающую:

(1) водный раствор, содержащий иммуноген;

(2) неионный гидрофильный детергент с высоким значением HLB - больше 13 и меньше 40, в особенности HLB≥13,5 и предпочтительно HLB≥14;

(3) минеральное масло;

(4) неионный липофильный детергент;

(5) неионный гидрофильный детергент с низким значением HLB (значение HLB от 9 до 13).

В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает вакцинную композицию, включающую новую эмульсию, содержащую, по меньшей мере, один иммуноген, пригодный для запуска иммунологической реакции у вакцинированных. Изобретение также предусматривает такие композиции, в которых эмульсия действует как адъювант для повышения иммунного ответа, вызванного иммуногеном, в частности, для повышения клеточного ответа, гуморального ответа или, предпочтительно, обоих ответов.

В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает вакцинную композицию, в которой иммуноген, в особенности иммуноген в лиофилизованном виде или в водном растворе, смешивают с адъювантом по настоящему изобретению. Иммуноген можно выбрать из группы, состоящей из инактивированных патогенов, ослабленных патогенов, субъединичных антигенов, рекомбинантных экспрессионных векторов, в том числе плазмид, и т.п. Патоген может иметь бактериальное, вирусное, протозойное или грибковое происхождение, либо же иммуноген может представлять собой антитоксин.

В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает способ индуцирования иммунного ответа у вакцинированных против патогена, который включает введение вакцинной композиции настоящего изобретения вакцинируемым.

В следующем предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает наборы, включающие, по меньшей мере, два флакона, причем в первом флаконе содержится иммуноген, в особенности иммуноген в лиофилизованном виде или в растворе в водной среде, а во втором флаконе - адъювант или эмульсия по настоящему изобретению.

Следует отметить, что в данном описании, в частности, в формуле изобретения, такие термины, как «включает», «включающий» и им подобные могут иметь значение, придаваемое таким терминам в патентном законодательстве США, например, они могут означать «включает в себя», «заключает в себе» и т.п.; а такие термины, как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из» имеют значение, приписываемое им в патентном законодательстве США, например, они разрешают элементы, не указанные явным образом, но исключают элементы, входящие в предшествующий уровень техники или затрагивающие фундаментальную или новую особенность изобретения.

Эти и другие воплощения изобретения раскрыты в или вытекают из и охвачены нижеследующим подробным описанием.

Краткое описание фигур

Полное и всестороннее раскрытие настоящего изобретения, включая наилучший способ его осуществления, для рядовых специалистов в этой области изложено более конкретно в остальной части описания, в том числе с привлечением прилагаемых чертежей.

На фиг.1 представлены показатели повреждения легких у поросят, которым делали провоцирующую пробу через 28 дней после вакцинации в соответствии с Примером 3. Среднее значение указано крестиком, нижняя квартиль (зона, где расположено менее 25% наблюдаемых значений переменной) и верхняя квартиль - рамкой, статистическая медиана - горизонтальной линией в рамке, размах от минимального до максимального значения - вертикальной линией.

На фиг.2 представлены показатели повреждения легких у поросят, которым делали провоцирующую пробу через 20 недель после вакцинации в соответствии с Примером 4. Среднее значение указано крестиком, нижняя квартиль и верхняя квартиль - рамкой, статистическая медиана - горизонтальной линией в рамке, размах от минимального до максимального значения - вертикальной линией.

На фиг.3 представлен график, отображающий прогрессирование клинического заболевания по клиническому показателю после провоцирующей пробы в соответствии с Примером 6.

На фиг.4 представлены результаты полевого испытания эффективности, в котором поросята (n=889), рожденные от свиноматок, вакцинированных однократно до опороса вакцинной композицией, полученной в соответствии с настоящим изобретением, проявляли значительное снижение смертности (на 75%) от мультисистемного синдрома истощения после отлучения (PMWS, postweaning multisystem wasting syndrome) no сравнению с контрольными поросятами (n=713), рожденными от не вакцинированных свиноматок.

Осуществимость изобретения

Другие задачи, особенности и аспекты настоящего изобретения раскрыты в или вытекают из следующего подробного описания. Рядовой специалист в этой области должен понимать, что настоящее описание является всего лишь описанием типичных воплощений и не имеет целью ограничение более широких аспектов настоящего изобретения, которые воплощены в типичной конструкции. В самом деле, специалистам в этой области должно быть ясно, что в настоящем изобретении можно производить различные модификации и разновидности, не выходящие за рамки или не отходящие от духа изобретения. Например, особенности, раскрытые или описанные как часть одного воплощения, могут быть использованы в другом воплощении для получения еще одного воплощения. Подразумевается, что настоящее изобретение охватывает такие модификации и разновидности как входящие в область действия прилагаемой формулы и ее эквивалентов. Содержание всех ссылок, опубликованных патентов и патентов, цитируемых в настоящей заявке, включены в настоящее изобретение путем ссылки во всей полноте.

Для удобства определенные термины, применяемые в описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения, собраны в одном месте.

В настоящем изобретении термин «животное» включает всех позвоночных животных, в том числе человека. Он также включает индивидуальных животных на всех стадиях развития, включая эмбриональные и зародышевые стадии. В частности, термин «позвоночное животное» включает, не ограничиваясь этим, человека, собачьих (например, собак), кошачьих (например, кошек), лошадиных (например, лошадей), коровьих (например, крупный рогатый скот), свиных (например, свиней), а также птиц. Термин «птицы» в настоящем изобретении относится к любым видам или подвидам таксономического класса Aves, таким как куры (бридеры, бройлеры и несушки), индейки, утки, гуси, перепелки, фазаны, попугаи, зяблики, ястребы, вороны и бескилевые, в том числе страусы, эму и казуары, но не ограничивается этим.

В настоящем изобретении термин «свинья» или «поросенок» означает животное из числа свиных, тогда как «свиноматка» означает самку репродуктивного возраста и способности.

В настоящем изобретении термин «вирулентный» означает изолят, сохраняющий способность к заражению животного-реципиента.

В настоящем изобретении термин «инактивированная вакцина» означает вакцинную композицию, содержащую заразный организм или патоген, который больше не способен к репликации или росту. Патоген может иметь бактериальное, вирусное, протозойное или грибковое происхождение. Инактивация может осуществляться различными методами, включая замораживание-оттаивание, химическую обработку (например, обработку тимеросалом или формалином), обработку ультразвуком, облучение, нагревание или любой другой общепринятый способ, достаточный для прекращения репликации или роста организма с сохранением его иммуногенности.

В настоящем изобретении термин «иммуногенность» означает способность вызвать иммунный ответ у животного-реципиента против антигена или антигенов. Такой иммунный ответ лежит в основе защитного иммунитета, индуцируемого вакциной против конкретного заразного организма.

В настоящем изобретении термин «иммунный ответ» означает ответ, вызванный у животного. Иммунный ответ может относиться к клеточному иммунитету, гуморальному иммунитету либо, или он может включать обе разновидности. Настоящее изобретение также предусматривает ответ, ограничивающийся лишь частью иммунной системы. Например, вакцинная композиция настоящего изобретения может специфически индуцировать повышение ответа γ-интерферона.

В настоящем изобретении термин «антиген» или «иммуноген» означает вещество, вызывающее специфический иммунный ответ у животного-реципиента. Антиген может включать целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент ДНК, способный вызвать иммунный ответ после презентации животному-реципиенту; белок, полипептид, пептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. С другой стороны, иммуноген или антиген может включать токсин или антитоксин.

В настоящем изобретении термин «мультивалентная» означает вакцину, содержащую более одного антигена как из одного и того же вида (например, различных изолятов Mycoplasma hyopneumoniae), так из разных видов (например, изолятов Pasteurella hemolytica и Pasteurella multocida), или же вакцину, содержащую комбинацию антигенов из разных родов (например, вакцину, включающую антигены из Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus и Clostridium).

В настоящем изобретении термин «адъювант» означает вещество, добавляемое в вакцину для повышения ее иммуногенности. Механизм того, как действует адъювант, не вполне известен. Полагают, что некоторые адъюванты усиливают иммунный ответ путем медленного выделения антиген, тогда как другие адъюванты сильно иммуногены сами по себе и действуют синергически. К известным вакцинным адъювантам относятся, не ограничиваясь этим, эмульсии из масла и воды (например, полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда), Corynebacterium parvum, бацилла Calmette-Guerin (БЦЖ), гидроокись алюминия, глюкан, декстрансульфат, окись железа, альгинат натрия, адъювант Bacto, определенные синтетические полимеры типа полиаминокислот и сополимеры аминокислот, сапонин, «Regressin» (Vetrepharm, Athens, Ga.), «Avridine» [N,N-диоктадецил-N′,N′-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин], парафиновое масло, мурамиловый дипептид и др.

В настоящем изобретении термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к жидкому носителю для содержания вакцинных антигенов, который можно вводить реципиенту без вредных эффектов. К подходящим фармацевтически приемлемым носителям, известным в этой области, относятся, не ограничиваясь этим, стерильная вода, физраствор, глюкоза, декстроза или буферные растворы. Носители могут включать вспомогательные вещества, в том числе, но не ограничиваясь этим, разбавители, стабилизаторы (например, сахара и аминокислоты), консерванты, смачивающие вещества, эмульгирующие вещества, рН-буферы, добавки, повышающие вязкость, красители и др.

В настоящем изобретении термин «вакцинная композиция» включает, по меньшей мере, один антиген или иммуноген в фармацевтически приемлемом носителе, применимом для индуцирования иммунного ответа у реципиента. Вакцинные композиции можно вводить в таких дозах и такими способами, которые хорошо известны специалистам в области медицины или ветеринарии, с учетом таких факторов, как возраст, пол, вес, биологический вид и состояние животного-реципиента, а также способ применения. Способ применения может быть через кожу, через слизистые оболочки (например, перорально, назально, анально, вагинально) или парентерально (интрадермально, внутримышечно, подкожно, внутривенно или внутрибрюшинно). Вакцинные композиции могут вводиться по отдельности либо совместно или поочередно с другими средствами терапии. Лекарственные формы могут включать суспензии, сиропы или эликсиры, препараты для парентерального, подкожного, интрадермального или внутривенного введения (например, путем инъекции) типа стерильных суспензий или эмульсий. Вакцинные композиции могут вводиться в виде аэрозоля или вместе с пищей и/или водой, либо вводиться в смеси с соответствующим носителем, разбавителем или наполнителем типа стерильной воды, физиологического раствора, глюкозы и т.п. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие вещества, рН-буферы, адъюванты, желатинизирующие или повышающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы, красители и др., в зависимости от способа применения и требуемого препарата. Для получения соответствующих препаратов без излишнего экспериментирования можно обратиться к стандартным пособиям по фармацевтике, таким как «Remington′s Pharmaceutical Sciences», 1990.

Настоящее изобретение предусматривает новый адьювант или эмульсию типа «масло в воде» (М/В), включающую:

(1) водный раствор, содержащий вакцинный антиген или иммуноген, способный вызвать иммунный ответ у реципиента;

(2) неионный гидрофильный детергент со значением гидрофильно-липофильного баланса (HLB) больше 13 и меньше 40 (HLB≥13, в особенности HLB≥13,5 и предпочтительно HLB≥14);

(3) минеральное масло;

(4) неионный липофильный детергент; и

(5) неионный гидрофильный детергент с низким значением HLB (значение HLB между 9 и 13).

Эмульсии, полученные по настоящему изобретению, основываются на комбинации, по меньшей мере, из 3 детергентов, выбранных из представителей трех разных групп детергентов, причем можно использовать один или несколько детергентов, принадлежащих к одной группе.

В предпочтительном воплощении концентрация неионного гидрофильного детергента (5) в эмульсии (в настоящем описании это означает конечную эмульсию, включающую все ингредиенты, если не указано иначе) составляет от 1% до 8%, в частности от 1,5% до 6%, предпочтительно от 2% до 5%, более предпочтительно от 2,5% до 4% при выражении в процентах по массе на объем эмульсии («мас.%» или «% мас.» при перечислении значений).

Данная группа детергентов включает неионные гидрофильные детергенты с низким значением HLB (значение HLB между 9 и 13). К этой группе относятся, не ограничиваясь этим, этоксилированные жирнокислотные моноэфиры сорбита (в особенности 5 этоксигрупп) (например, этоксилированный моноолеат сорбита типа Tween 80), этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита, этоксилированные жирнокислотные триэфиры сорбита (в особенности 20 этоксигрупп) (например, этоксилированный триолеат сорбита типа Tween 85, этоксилированный тристеарат сорбита типа Tween 65), этоксилированные жирные спирты (в особенности 5-10 этоксигрупп) (например, Brij 76, Brij 56, Brij 96), этоксилированные жирные кислоты (в особенности 5-10 этоксигрупп) (например, Simulsol 2599, Myrj 45), этоксилированное касторовое масло (в особенности 25-35 этоксигрупп) (например, Arlatone 650, Arlatone G) и их комбинации.

Предпочтительны этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита и этоксилированные жирнокислотные триэфиры сорбита, а также комбинации из обеих разновидностей. Жирную кислоту предпочтительно выбирают из группы, состоящей из олеата, пальмитата, стеарата, изостеарата, лаурата и их комбинаций. К предпочтительным этоксилированным жирнокислотным триэфирам сорбита относятся этоксилированный триолеат сорбита типа Tween 85 или этоксилированный тристеарат сорбита типа Tween 65.

В предпочтительном воплощении концентрация неионного гидрофильного детергента (2) обычно составляет от 0,1% до 1,5%, в частности от 0,2% до 1,4%, предпочтительно от 0,3% до 1,3%, более предпочтительно от 0,4% до 1,2% при выражении в процентах по массе на объем эмульсии (мас.%).

Данная вторая группа детергентов включает неионные гидрофильные детергенты с высоким значением HLB (HLB>13, в особенности HLB≥13,5 и предпочтительно HLB≥14). К этой группе относятся этоксилированные жирнокислотные моноэфиры сорбита (в особенности 20 этоксигрупп) (например, этоксилированный монолаурат сорбита типа Tween 20, этоксилированный монопальмитат сорбита типа Tween 40, этоксилированный моностеарат сорбита типа Tween 60, этоксилированный моноолеат сорбита типа Tween 80), этоксилированные жирные спирты (в особенности 15-30 этоксигрупп) (например, Brij 78, Brij 98, Brij 721), этоксилированные жирные кислоты (в особенности 15-30 этоксигрупп) (например, Myrj 49, Myrj 51, Myrj 52, Myrj 53), неионные блок-сополимеры [например, сополимер полиоксиэтилен/полиоксипропилен (РОЕ/РОР) типа Lutrol F127, Lutrol F68] и их комбинации.

Для неионных блок-сополимеров содержание может быть ниже, в частности от 0,1% до 0,5%, более предпочтительно от 0,2% до 0,4% мас.

К предпочтительным детергентам (2) относятся этоксилированные жирнокислотные моноэфиры сорбита типа тех, которые описаны выше.

В предпочтительном воплощении концентрация неионного липофильного детергента (4) составляет от 0,1% до 2,5%, в частности от 0,2% до 2%, предпочтительно от 0,2% до 1,5%, более предпочтительно от 0,2% до 1,2% при выражении в процентах по массе на объем эмульсии (мас.%).

Данная группа детергентов включает жирнокислотные эфиры сорбита (например, монолаурат сорбита типа Span 20, монопальмитат сорбита типа Span 40, моностеарат сорбита типа Span 60, тристеарат сорбита типа Span 65, моноолеат сорбита типа Span 80, триолеат сорбита типа Span 85, моноизостеарат сорбита типа Arlacel 987, изостеарат сорбита типа Crill 6), жирнокислотные эфиры маннита (например, Montanide 80, моноолеат маннита типа Arlacel А, диолеат маннита, триолеат маннита, тетраолеат маннита), этоксилированные жирнокислотные эфиры маннита (2, 3 или 4 этоксигруппы) (например, Montanide 888, Montanide 103, этоксилированный моноолеат маннита, этоксилированный диолеат маннита, этоксилированный триолеат маннита, этоксилированный тетраолеат маннита) и их комбинации.

Жирную кислоту предпочтительно выбирают из группы, состоящей из олеата, пальмитата, стеарата, изостеарата, лаурата и их комбинаций.

К предпочтительным детергентам (4) относятся жирнокислотные эфиры сорбита, в частности те, что описаны выше, и их комбинации.

У детергентов по изобретению жирные кислоты могут иметь животное или растительное происхождение. Замена одного источника другим (например, животного Tween 80 на растительный Tween 80) может осуществляться всего лишь с небольшим изменением состава эмульсии.

В эмульсии по изобретению общая концентрация детергентов может составлять, по массе на объем эмульсии, от 1,2% до 10%, в частности от 2% до 8%, предпочтительно от 3% до 7%, более предпочтительно от 4% до 6%.

В общем случае у эмульсии по изобретению температура инверсии фаз (PIT, phase inversion temperature) может составлять ≥33°С, в частности от 33°С до 65°С, в особенности от 36°С до 60°С, предпочтительно от 37°С до 55°С, более предпочтительно от 38°С до 50°С.

Температура инверсии фаз (PIT) - это температура, при которой эмульсия типа «вода в масле» превращается в эмульсию типа «масло в воде», т.е. дефазирует (распад эмульсии и разделение на две фазы). Значение PIT можно измерить различными способами, к примеру, по внешнему виду (например, см. Пример 2) или по электропроводимости. Эмульсию помещают на водяную баню при температуре ниже значения PIT эмульсии, к примеру, при 25°С. Температуру постепенно повышают. Наблюдают за изменением внешнего вида эмульсии по сравнению с контрольной эмульсией, отмечая текучесть, вязкость, разделение на две фазы, изменение состояния поверхности вследствие выхода масляной фазы на поверхность. Температура, при которой наблюдается это изменение внешнего вида эмульсии, и дает значение PIT эмульсии. В качестве альтернативы значение PIT определяют по быстрому переходу от значения электропроводимости около 5-8 миллисименсов/сантиметр (мСм/см) (эмульсия типа «масло в воде») до значения около 0 мСм/см (эмульсия типа «вода в масле») при измерении зондом, помещенным в эмульсию вблизи от поверхности. Температура, при которой наблюдается этот переход, и дает значение PIT эмульсии. Рядовой специалист в этой области в состоянии определить комбинации детергентов и масла, включая их концентрации, для получения эмульсий по изобретению, в частности эмульсий со значением PIT в указанных выше пределах, без излишнего экспериментирования.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения, описанные в нем эмульсии, не содержат каких-либо ионных детергентов или соединений, обладающих свойствами ионных детергентов, таких как лецитин или сапонин. В общем случае эмульсии по настоящему изобретению могут содержать, по объему на объем эмульсии, от 3% до 55% масла, в частности от 5% до 50% масла, предпочтительно от 10% до 40% масла, более предпочтительно от 20% до 40% масла. По определению интервалы значений в настоящем описании всегда включают границы интервала, если не указано иначе.

Используемое масло может представлять собой минеральное масло, включая, но не ограничиваясь этим, парафиновое масло типа изопарафинового масла и/или нафтенового масла, сквалан, пристан, полиизобутеновое масло, гидрогенированное полиизобутеновое масло, полидеценовое масло, полиизопреновое масло, полиизопропеновое масло и др. Одно из предпочтительных минеральных масел, применимых в настоящем изобретении, может включать масло, содержащее линейную или разветвленную углеродную цепь с числом атомов углерода более 15, предпочтительно от 15 до 32, и свободное от ароматических соединений. К таким маслам можно отнести, к примеру, масла, выпускаемые под маркой «Marcol 52» или «Marcol 82» (фирмы Esso, Франция) либо «Drakeol 6VR» (фирмы Penreco, США).

Масло может представлять собой и смесь масел, включающую, по меньшей мере, 2 масла, выбранные из описанных выше масел, и в любой пропорции. Смесь масел также может включать, по меньшей мере, одно масло, выбранное из описанных выше масел, и, по меньшей мере, одно растительное масло, причем это растительное масло составляет от 0,1% до 33% масляной фазы, предпочтительно от 10 до 25 об.% Такие растительные масла представляют собой ненасыщенные масла, богатые олеиновой кислотой, которые подвержены биодеградации и предпочтительно жидкие при температуре хранения (около +4°С) или, по крайней мере, дают возможность получить эмульсии, которые будут жидкими при этой температуре. Например, растительное масло может представлять собой арахисовое масло, ореховое масло, подсолнечное масло, сафлоровое масло, соевое масло, онагровое масло и др.

В предпочтительном воплощении гидрофильные детергенты (2) и (5) предпочтительно включают детергенты, имеющие одинаковую гидрофильную часть молекулы. Например, применяются этоксилированные жирнокислотные эфиры сорбита для каждого из гидрофильных детергентов (2) и (5). Так, если в качестве неионного гидрофильного детергента с низким значением HLB выбран Tween 85, то неионный гидрофильный детергент с высоким значением HLB должен будет иметь гидрофильную часть, в состав которой входит этоксилированный сорбит типа Tween 80.

В общем случае, настоящее изобретение предусматривает использование водных растворов, включающих подходящий ветеринарный или фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель, в том числе, но не ограничиваясь этим, стерильную воду, физиологический раствор, глюкозу, буфер и т.п. Носитель, наполнитель или разбавитель может также включать полиоли, глюкозиды и рН-буферные вещества. Носитель, наполнитель или разбавитель, к примеру, может также включать аминокислоты, пептиды, антиоксиданты, бактерицидные и бактериостатические соединения. Водный раствор добавляют в масло и детергенты в таком количестве, чтобы получить 100% объема эмульсии по изобретению.

Гидрофильно-липофильный баланс (HLB) эмульсии позволяет оценить гидрофильность или липофильность детергента. Значение HLB амфифильной молекулы обычно рассчитывают следующим образом:

Значение HLB может колебаться от 0 (для наиболее липофильных молекул) до 20 (для наиболее гидрофильных молекул). В соответствии с химическим составом детергента (к примеру, добавлением этоксигрупп или алкеноксидов) эта оценка может меняться, и область значений HLB может возрасти (например, у Lutrol F68 значение HLB равно 29). Для смеси детергентов значение HLB смеси определяется сложением значений HLB каждого из детергентов, нормализованных по массе:

В одном воплощении эмульсии согласно настоящему изобретению конечное значение HLB эмульсии составляет от 9 до 12, предпочтительно от 9,5 до 11,5, более предпочтительно от 10 до 11,5.

Настоящее изобретение предусматривает эмульсию, включающую парафиновое масло (в частности, в концентрации от 10% до 40%, предпочтительно от 20% до 40% при выражении по объему на объем эмульсии - «об.%» или «% об.» при перечислении значений); жирнокислотный моноэфир сорбита (в качестве неионного липофильного детергента); этоксилированный жирнокислотный триэфир сорбита (в качестве неионного гидрофильного детергента с низким значением HLB); и этоксилированный жирнокислотный моноэфир сорбита (в качестве неионного гидрофильного детергента с высоким значением HLB). В частности, жирнокислотный моноэфир сорбита представляет собой моноолеат сорбита (в частности, в концентрации от 0,2% до 1,5%, предпочтительно от 0,2% до 1,2% при выражении по массе на объем эмульсии - мас.%); этоксилированный жирнокислотный триэфир сорбита представляет собой этоксилированный триолеат сорбита (в частности, в концентрации от 2% до 5%, предпочтительно от 2,5% до 4 мас.%); и этоксилированный жирнокислотный моноэфир сорбита представляет собой этоксилированный моноолеат сорбита (в частности, в концентрации от 0,3% до 1,3%, предпочтительно от 0,4% до 1,2 мас.%). Например, эмульсия включает парафиновое масло в количестве 29,3% по объему на объем эмульсии, моноолеат сорбита в количестве 0,6% по массе на объем эмульсии, этоксилированный триолеат сорбита в количестве 3,4% по массе на объем эмульсии и этоксилированный моноолеат сорбита в количестве 0,75% по массе на объем эмульсии.

Во втором воплощении, в соответствии с настоящим изобретением эмульсия включает парафиновое масло (в частности, в концентрации от 10% до 40%, предпочтительно от 20% до 40 об.%); жирнокислотный моноэфир сорбита (в качестве неионного липофильного детергента); этоксилированный жирнокислотный триэфир сорбита (в качестве неионного гидрофильного детергента с низким значением HLB); и неионный блок-сополимер (в качестве неионного гидрофильного детергента с высоким значением HLB). В частности, жирнокислотный моноэфир сорбита представляет собой моноолеат сорбита (в частности, в концентрации от 0,2% до 1,5%, предпочтительно от 0,2% до 1,2 мас.%); этоксилированный жирнокислотный триэфир сорбита представляет собой этоксилированный триолеат сорбита (в частности, в концентрации от 2% до 5%, предпочтительно от 2,5% до 4 мас.%); и неионный блок-сополимер представляет собой полимер полиоксиэтилен/полиоксипропилен (РОЕ-РОР) (в частности, в концентрации от 0,1% до 0,5%, предпочтительно от 0,2% до 0,4 мас.%). Например, эмульсия включает парафиновое масло в количестве 29,3 об.%, моноолеат сорбита в количестве 0,6 мас.%, этоксилированный триолеат сорбита в количестве 3,4 мас.% и этоксилированный моноолеат сорбита в количестве 0,25 мас.%.

В предпочтительном воплощении изобретение предусматривает эмульсию для инъекций типа «масло в воде» (М/В), включающую:

(1) водный раствор, содержащий активный ингредиент типа лекарственного препарата или иммуногена, предпочтительно иммуноген;

(2) минеральное масло;

(3) неионный липофильный детергент; и

(4) неионный гидрофильный детергент с низким значением HLB, который включает этоксилированный жирнокислотный диэфир сорбита (который может обладать значением HLB между 11 и 13).

Эмульсия по этому воплощению включает этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита, которые могут содержать до 20 этоксигрупп. Жирные кислоты могут иметь животное или растительное происхождение, и они могут быть выбраны из группы, состоящей из олеата, пальмитата, стеарата, изостеарата, лаурата и их комбинаций. В одном воплощении этоксилированная жирная кислота предпочтительно представляет собой олеат. Остальные ингредиенты, а также общие свойства эмульсии, такие как PIT, могут иметь такие же характеристики, как у тех, что описаны выше.

Предпочтительно детергент (4) включает этоксилированные жирнокислотные диэфиры сорбита, такие как этоксилированный диолеат сорбита, этоксилированный дистеарат сорбита или этоксилированный диизостеарат сорбита, этоксилированный дипальмитат сорбита, этоксилированный дилаурат сорбита и их комбинации.

Необязательно в эмульсию можно добавлять и другие соединения в качестве коадъювантов, в том числе, но не ограничиваясь этим, квасцы, олигонуклеотиды CpG (ODN), в частности ODN 2006, 2007, 2059 или 2135 (Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath., 2002, 84: 43-59; Weraette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath., 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath., 2003, 91: 89-103), полиА-полиU («Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach», edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6:03), диметилдиоктадециламмоний бромид (DDA) («Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach», edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6:157), N,N-диоктадецил-N′,N′-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин типа Avridine (ibid, p.148), карбомер, хитозан (к примеру, см. US Patent Serial No. 5980912).

Настоящее изобретение также предусматривает способ получения вакцинной композиции или иммунологической композиции, включающей, по меньшей мере, один антиген или иммуноген и адъювант или эмульсию, полученную согласно настоящему изобретению. Иммуноген может быть включен в состав при образовании эмульсии либо, в альтернативном воплощении, иммуноген может быть добавлен в эмульсию позже, например, непосредственно перед применением.

Все количество используемого водного раствора может находиться в эмульсии с самого начала. Или же только часть этого водного раствора используется для получения эмульсии, а остальное количество водного раствора добавляется после внесения иммуногена. Иммуноген или антиген может находиться в лиофилизованном виде или в каком-либо ином надлежащем твердом виде, а затем его смешивают с эмульсией или, альтернативно, антиген может находиться в растворе, в частности в водном растворе, и этот раствор смешивают с эмульсией.

Детергенты предпочтительно добавляют либо в масло, либо в водный раствор в соответствии с их растворимостью. Например, неионные липофильные детергенты добавляют в масло по изобретению, тогда как неионные гидрофильные детергенты с высоким значением HLB добавляют в водный раствор.

Эмульгирование может осуществляться традиц