Адъювант
Изобретение относится к вирусологии. Предложено применение экстракта бересты в качестве адъюванта. Экстракт бересты повышает иммуногенность целевого антигена при совместном введении. Изобретение может быть использовано в ветеринарии и медицине. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.
Реферат
Настоящее изобретение относится к области медицины и ветеринарии, более конкретно к вирусологии.
Угроза вирусных эпидемий продолжает волновать человечество. При выработке стратегии борьбы с вирусными возбудителями вирусологи единодушны во мнении, что главенствующее место должны занять вакцины, как наиболее эффективные медицинские средства профилактики и снижения смертности населения.
Поэтому последние несколько лет во всем мире ведутся интенсивные разработки вакцинных препаратов, поскольку вакцины (живые и инактивированные) показали себя как безвредные, безопасные для окружающих иммуногенные препараты, хотя, в ряде случаев, их эффективность оставляет желать лучшего.
Применительно к инактивированным вакцинам наибольшую эффективность можно прогнозировать в случае использования в качестве основы вирулентного вирусного штамма, но при этом резко возрастает сложность производства, обусловленная, опасностью работы и необходимостью строгого контроля за полнотой инактивации возбудителя.
Отличительной особенностью инактивированных вакцин является включение в их состав адъювантов. Адъювант - это субстанция, добавляемая в вакцинный препарат для увеличения выработки организмом антител. Наиболее часто в этих целях используют гидроокись алюминия. Последние исследования показали, что помимо увеличения времени нахождения антигена в месте введения и его адсорбции, она повышает экспрессию HLA-антигенов II класса, молекул В 7-2 (CD 86 и CD 83), экспрессию костимулирующих молекул, молекул адгезии и продукцию интерлейкина - 4, что сопровождается изменением морфологии в сторону дендритных клеток.
В результате исследований последних лет разработаны и другие, более активные адъюванты. В экспериментах на животных показана эффективность использования при иммунизации GpG-олигодезоксинуклеотидов, выделенных из бактериальных ДНК и синтетически созданных. Эффективность мукозальной риппозной вакцинации повышается при использовании токсинов холерного вибриона и энтеротоксинов кишечной палочки, кораубазидана (полисахарида, продуцируемого внеклеточно апатогенным грибом), хитозана (полисахарида, полученного из оболочки ракообразных), бакуловируса и синтетического агониста TLR4, синтетической двуцепочечной РНК-поли (1:С). Профилактическая активность инактивированных вакцин с новым адъювантом MF 59 при иммунизации пожилых людей, особенно с хроническими заболеваниями, оказалась выше, чем обычных сорбированных препаратов.
Применяемые в медицинской практике адъюванты, в частности адъювант Фрейнда, дороги, содержат остатки клеточных структур, способных вызвать выработку посторонних антител. Их высокая вязкость затрудняет работу на мелких животных.
Задачей настоящего изобретения является поиск нового адъюванта, лишенного в значительной степени указанных недостатков. Проведенные авторами настоящего изобретения исследования привели к обнаружению возможности использования в качестве такого адъюванта экстракта бересты (белой части березовой коры) с преобладающим содержанием бетулина. Предпочтительным является использование указанного препарата в виде наночастиц.
Объектом исследования являлись экспериментальные образцы инактивированных вирусных антигенов в комплексе с адъювантом на основе наночастиц «Бересты экстракта сухого» с преобладающим содержанием (65%) бетулина (далее по тексту бетулин). Указанный экстракт производится заявителем настоящей заявки - ООО «Березовый мир» и используется в качестве БАД.
Осуществлялось сравнительное изучение иммуногенных свойств рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В и инактивированного антигена клещевого энцефалита (КЭ) в комплексе с адъювантами на основе наночастиц бетулина.
Для иммунизации животных использовали следующие препараты:
- Рекомбинантный поверхностный антиген вируса гепатита В (полуфабрикат вакцины), концентрация HBsAg - 50 мкг/мл;
- Инактивированный антиген вируса клещевого энцефалита (цельновирионный полуфабрикат вакцины), концентрация белка Е-10 мкг/мл;
- Адъювант 1 (АД-1): экстракт бересты сухой с содержанием бетулина 65%, (БЭС-65);
- Адъювант 2 (АД-2): высушенный препарат наночастиц БЭС, (РЯ);
- Адъювант 3 (АД-3): 0,5% водный раствор наночастиц бетулина (ГИПХ).
- Известный адъювант (гидроксид алюминия, ГАл): 0,5% водный раствор.
Адъюванты АД-2 и АД-3 готовились следующим образом. Адъювант АД-3 (0,5% водный раствор наночастиц):
- растворение бересты экстракта сухого (БЭС-65) в органическом растворителе при концентрации 2,5-5 г/л;
- добавление (впрыскивание) к указанному раствору большого количества воды (до 25 объемов воды по отношению к объему раствора);
- удаление растворителя и основной части воды.
Адъювант АД-2 (высушенный препарат наночастип):
- к полученному водному раствору наночастип (см. получение АД-3) добавляют криопротектор (например, сорбит) и лиофилизируют.
Перед иммунизацией адъюванты АД-1 и АД-2 растворяли в фосфатном буфере (рН 7,5), обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут, после чего охлаждали.
В опытах изучали препараты следующего состава:
На основе рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В
Препарат 1, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, ГАл - 500 мкг/мл
Препарат 2, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-1 - 500 мкг/мл
Препарат 3, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-2 - 500 мкг/мл
Препарат 4, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-3 - 500 мкг/мл
Препарат 5, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-1 - 100 мкг/мл
Препарат 6, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-2 - 100 мкг/мл
Препарат 7, состав: HBsAg - 10 мкг/мл, АД-3 - 100 мкг/мл
На основе инактивированного антигена клещевого энцефалита (ВКЭ)
Препарат 8, состав: ВКЭ белок Е -1 мкг/мл, ГАл - 500 мкг/мл
Препарат 9, состав: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл, АД-1 - 500 мкг/мл
Препарат 10, состав: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл, АД-3 - 500 мкг/мл
Препарат 11, состав: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл, АД-1 - 100 мкг/мл
Препарат 12, состав: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл, АД-3 - 100 мкг/мл
В качестве референс препаратов использовали:
Реф. 1: HBsAg - 10 мкг/мл
Реф. 2: ВКЭ белок Е - 1 мкг/мл
Реф. 3: АД-1 - 500 мкг/мл
Реф. 4: Физраствор
Титры специфических антител в сыворотках крови иммунизированных мышей определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) и торможения гемагглютинации (РТГА). Для количественного определения вируса КЭ применяли экспериментальную тест-систему с использованием моноклональных антител к поверхностному гликопротеину Е.
Протективную активность препаратов с вирусом КЭ определяли введением внутрибрюшинно 300-400 летальных доз референс-штамма «Абсеттаров» через неделю после последней иммунизации. В течение 14 дней после заражения вели учет на специфичность умерших животных.
Пример 1
Иммуногенные и протективные активности различных вирусных препаратов оценивали при подкожной иммунизации беспородных белых мышей массой 14-16 г. Препараты вводили однократно и двукратно с интервалом 14 дней. В качестве контроля белым мышам подкожно однократно и двукратно вводили референс препараты.
Через 21 день после окончания цикла иммунизации у животных из каждой группы брали кровь и готовили объединенный пул сывороток крови для определения титра AT в ИФА и РТГА.
Результаты, характеризующие иммунологическую эффективность различных препаратов, представлены в таблице 1.
Таблица 1 | |||||
Препарат № | Антиген | Титр при однократном введении | Титр при двукратном введении | ||
ИФА | РТГА | ИФА | РТГА | ||
1 | HBsAg | 1:320 | 1:640 | ||
2 | HBsAg | 1:640 | 1:1280 | ||
3 | HBsAg | 1:320 | 1:2560 | ||
4 | HBsAg | 1:640 | 1:1280 | ||
5 | HBsAg | 1:80 | 1:320 | ||
6 | HBsAg | 1:160 | 1:160 | ||
7 | HBsAg | 1:80 | 1:320 | ||
8 | КЭ | 1:80 | 1:40 | 1:320 | 1:80 |
9 | КЭ | 1:80 | 1:40 | 1:640 | 1:80 |
10 | КЭ | 1:160 | 1:40 | 1:1280 | 1:160 |
11 | КЭ | 1:40 | 1:20 | 1:320 | 1:40 |
12 | КЭ | 1:20 | <1:20 | 1:160 | 1:80 |
Реф.1 | HBsAg | 1:40 | 1:160 | ||
Реф.2 | КЭ | 1:20 | 1:10 | 1:40 | 1:40 |
Реф.3 | <1:20 | <1:10 | 1:10 | <1:10 | |
Реф.4 | <1:10 | <1:10 | <1:10 | <1:10 |
По иммуногенности препараты, содержащие адъюванты, мало отличались друг от друга, за исключением титров ИФА при иммунизации HBs Ag с АД-2.
Как следует из полученных данных, в условиях одно- и двукратной иммунизации экспериментальные образцы антигенов при введении с адъювантами на основе наночастиц экстракта бересты проявляли более высокую иммуногенность, чем сам антиген и антиген, адсорбированный на гидроокиси алюминия.
Наибольшую иммуногенную эффективность показал препарат HBs Ag, введенный с адъювантом АД-2. Данный адъювант повышал эффективность иммунизации как для HBs Ag, так и для инактивированного КЭ. Разница заключалась в том, что для инактивированного КЭ более выраженные результаты были получены после второй иммунизации.
Пример 2
Для приготовления опытной вакцины адъювант АД-2 Сбэс=2% смешивали с антигеном вируса ньюкаслской болезни в соотношении 1:1. Смесь тщательно встряхивали и вводили цыплятам в грудную мышцу в объеме 0,5 мл. Другую группу цыплят привили инактивированной вакциной против ньюкаслской болезни, изготовленной в ФГУ "ВНИИЗЖ" на основе адъюванта ISA-70 (соотношение Аг:Ад 30:70). Третья группа цыплят оставалась невакцинированной.
Сыворотки крови отбирались на 14, 21 и 31 сутки после вакцинации и исследовались в РТГА эритроцитов петуха вирусом ньюкаслской болезни.
Результаты испытания представлены в таблице 2.
Таблица 2 | ||||||
Название препарата | Кол-во голов в группе | Доза препарата | Средний по группе титр антител в лог2 | |||
До вакцинации | Через 14 сут после вакцинации | Через 21 сут после вакцинации | Через 31 сут после вакцинации | |||
Образец №2 Сбэс=2% с антигеном вируса ньюкаслской болезни 1:1 | 10 | 0,5 мл | 2 | 7,8 | 8,6 | 7,9 |
Вакцина против ньюкаслской болезни инактивированная эмульсионная на основе ISA-70 | 10 | 0,5 мл | 2 | 7,7 | 8,7 | 8,8 |
Невакцинированные цыплята | 10 | 0 | 2 | 2 | 4 | 4 |
Пример 3
Опытный образец вакцины с адъювантом АД-2 готовили смешиванием препарата с инактивированным антигеном реовируса птиц в соотношении 1:1 и тщательным их перемешиванием. Одновременно с этим используя тот же антиген готовили образец на основе адъюванта ISA 70 в соотношении антиген-адъювант 30:70, который использовали для сравнения иммунного ответа.
Цыплят 45-суточного возраста вакцинировали опытным образцом с препаратом наночастиц и контрольным образцом на основе ISA 70 в дозе 0,5 мл в область груди. Группу цыплят оставили невакцинированными.
Сыворотки крови отбирались через 15 и 30 суток после вакцинации и исследовались в ИФА с использованием соответствующего набора для определения уровня антител.
Результаты исследований представлены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3 | |||||
Название препарата | Кол-во голов в группе | Доза препарата | Средний титр по группе | ||
До вакцинации. | Через 15 сут после вакцинации | Через 30 сут после вакцинации | |||
Образец 1.Антиген реовируса птиц с препаратом наночастиц №2 Сбэс=2% в соотношении 1:1 | 10 | 0,5 мл | 1125 | 2473 | 3104 |
Образец 2.Антиген реовируса птиц с адъювантом ISA-70 (30:70) | 9 | 0,5 мл | 1034 | 3233 | 4026 |
Невакцинированные цыплята | 10 | 0 | 1164 | 1235 | 1267 |
Пример 4
Опытный образец вакцины с адъювантом АД-2 готовили смешиванием его с инактивированным антигеном метапневмовируса птиц в соотношении 1:1 и тщательным перемешиванием. Как и в опыте 2 готовили контрольный образец на основе адъюванта ISA 70.
Цыплят 45-суточного возраста вакцинировали опытными с препаратом наночастиц и контрольными образцами на основе ISA 70 в дозе 0,5 мл в область груди. Группу цыплят оставили невакцинированными.
Сыворотки крови отбирались через 15 и 30 суток после вакцинации и исследовались в ИФА с использованием соответствующего набора для определения уровня антител.
Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таблица 4 | |||||
Название препарата | Кол-во голов в группе | Доза препарата | Средний % блокирования по группе | ||
До вакцинации | Через 15 сут после вакцинации | Через 30 сут после вакцинации | |||
Образец 3.Антиген метапневмовируса птиц с препаратом наночастиц №2 Сбэс=2% в соотношении 1:1 | 9 | 0,5 мл | 22,5 (отрицательный) | 46,2 (положительный) | 43,1 (положительный) |
Образец 4.Антиген метапневмовируса птиц с адъювантом ISA-70 (30:70) | 7 | 0,5 мл | 24,3 (отрицательный) | 63,9 (положительный) | 66,5 (положительный) |
Невакцинированные цыплята | 10 | 0 | 27,6 (отрицательный) | 25,4 (отрицательный) | 27,8 (отрицательный) |
Результаты исследований показывают, что использование препарата наночастиц экстракта бересты совместно с антигенами вируса ньюкаслской болезни, реовируса птиц и мета пневмовируса птиц в соотношении 1:1 и внутримышечном применении в дозе 0,5 мл на цыпленка имеет выраженное адъювантное действие, проявляющееся в повышении титра антител против соответствующего антигена и не уступающего по значению с действием адъюванта ISA70 для вируса ньюкаслской болезни и реовируса птиц.
1. Применение экстракта бересты в качестве адъюванта.
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт бересты используют в виде наночастиц.
3. Применение по п.2 в виде водного раствора наночастиц.