Фармацевтические композиции для улучшенного введения пептидов, происходящих от gp41 вич, и их использование в терапии

Фармацевтические композиции для улучшенного введения пептидов, происходящих от gp41 вич, и их использование в терапии

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, состоящей из полимера смешанного с синтетическими пептидами, происходящих от gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Более конкретно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей смесь полиола и синтетического пептида, имеющего аминокислотную последовательность, происходящую либо от области HR1, либо от области HR2 gp41 ВИЧ-1.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время хорошо известно, что клетки могут быть инфицированы ВИЧ, в соответствии с механизмом, при котором происходит слияние клеточной мембраны и вирусной мембраны. Общепринятая модель такого механизма заключается в том, что гликопротеиновый комплекс вирусной оболочки (gp120/gp41) взаимодействует с рецепторами клеточной поверхности на мембранах клеток-мишеней. После связывания gp120 с клеточными рецепторами (например, CD4 в комбинации с хемокиновым ко-рецептором, таким как CCR-5 или CXCR-4), индуцируется конформационное изменение в комплексе gp120/gp41, которое способствует внедрению gp41 в мембрану клетки-мишени и опосредует слияние мембран.

Аминокислотная последовательность gp41 и ее варианты в различных штаммах ВИЧ хорошо известны. На фиг.1 схематически представлены общеизвестные функциональные домены gp41 (следует отметить, что число аминокислотных последовательностей может слегка варьировать, в зависимости от штамма ВИЧ). Очевидно, что гибридный пептид (фузогенный домен) участвует во внедрении вируса в мембрану клетки-мишени и ее дизрупции. Трансмембранный домен, содержащий трансмембранную якорную последовательность, расположен на С-конце данного белка. Между гибридным пептидом и трансмембранным якорем находятся две различных области, известные как области гептадных повторов (HR), каждая из которых имеет множество гептад. Одна область HR1, более близко расположенная к N-концу данного белка, в основном описана как область, содержащая аминокислотные остатки в положениях примерно от 545 до 595 аминокислотной последовательности gp160 (SEQ ID NO:1). Однако нумерация аминокислот gp160 зависит от штамма, от которого происходит данная аминокислотная последовательность. Аминокислотная последовательность, содержащая область HR1, и аминокислотная последовательность, содержащая область HR2, представляют собой одну из наиболее высококонсервативных областей в белке оболочки ВИЧ-1 (Shu et al., 1999, Biochemoistry, 38:5378-5385; Hanna et al., 2002, AIDS 16:1603-8). Область HR2, которая ближе расположена к С-концу данного белка, чем область HR1, в основном описана как область, содержащая аминокислоты в положениях примерно от 628 до 678 аминокислотной последовательности gp160 (SEQ ID NO:2). Области HR имеют общие структурные и функциональные признаки. Так, например, каждая область HR имеет множество участков, состоящих из 7 аминокислотных остатков, или “гептад” (7 аминокислот в каждой гептаде обозначены “а”-“g”), где аминокислоты в положении “а” и в положении “d” являются в основном гидрофобными. В каждой области HR также присутствует один или несколько мотивов типа “лейциновой молнии” (называемых также повторами типа “лейциновой молнии”), содержащих 8 аминокислотных последовательностей, начинающихся и заканчивающихся изолейцином или лейцином. В большинстве случаев область HR2 имеет только один мотив типа “лейциновой молнии”, тогда как область HR1 имеет пять мотивов типа “лейциновой молнии”. Гептады и мотивы типа “лейциновой молнии” участвуют в образовании суперспирализованной структуры gp41 и суперспирализованной структуры пептидов, происходящих от областей HR. В общих чертах известно, что суперспирали состоят из двух или более спиралей, которые закручены друг относительно друга, образуя олигомеры, причем характерным признаком таких суперспиралей является гептадный повтор, состоящий из аминокислот с преобладанием гидрофобных остатков в первом (“а”) и в четвертом (“d”) положениях, и заряженных остатков, чаще всего локализованных в пятом (“е”) и в седьмом (“g”) положениях, причем аминокислоты в положении “а” и в положении “d” представляют собой детерминанты, влияющие на статус олигомера и ориентацию цепи (см., например, Akey et al., 2001, Biochemistry, 40:6352-60).

Было обнаружено, что синтетические пептиды, происходящие либо от области HR1 (“пептиды HR1”), либо от области HR2 (“пептиды HR2”) gp41 ВИЧ, ингибируют передачу ВИЧ клеткам-хозяевам в in vitro-анализах и в клинических in vivo-исследованиях (см., например, Wild et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9770-9774; патенты США № 5464933 и 5656480, предоставленный по лицензии настоящему правопреемнику; и Kilby et al., 1998, Nature Med. 4:1302-1306). Более конкретно, пептиды HR1, представленные DP107 (также известные как Т-21; SEQ ID NO:3), блокируют инфицирование Т-клеток при 50%-ной эффективной концентрации (ЕС50), составляющей 1 мкг/мл (см., например, Lawless et al., 1996, Biochemistry, 35:13697-13708).

Пептиды HR2, представленные DP178 (также известные как Т-20; SEQ ID NO:4), обычно блокируют инфицирование Т-клеток при 50%-ной эффективной концентрации (ЕС50) в масштабе нг/мл. Первые упоминания о высокоэффективных синтетических пептидах, которые включают в себя одну или несколько энхансерных последовательностей, присоединенных к аминокислотной последовательности корового gp41 ВИЧ, и ингибируют слияние мембраны ВИЧ с клеточной мембраной, предотвращая тем самым передачу вируса клетке-хозяину, уже встречались в литературе (см., например, патенты США №№ 6258782 и 6348568, переуступленные настоящему правопреемнику). В настоящее время для более эффективной доставки количества, эффективного для противовирусной активности, эти синтетические пептиды, подобно другим известным пептидам, требуют частого введения (например, ежедневных инъекций) для достижения и поддержания в кровотоке уровня, достаточного для продуцирования терапевтического эффекта. Кроме того, реакции, продуцируемые в области инъекции, являются наиболее распространенными побочными эффектами у индивидов, которым вводят имеющиеся в настоящее время препараты растворов для инъекций, содержащих ингибиторы слияния ВИЧ [с клеткой]. Так, например, в одной фазе III исследования подкожно вводимого Т20 и использования препарата на основе маннита (без полиола, описанного в настоящем изобретении), побочные реакции на участке инъекции (проявляющиеся одним или несколькими признаками, такими как покраснение, опухание и состояние дискомфорта в месте инъекции) наблюдались у 98% пациентов, проходивших курс лечения, при этом упоминалось, что у 3,3% пациентов такие реакции были причиной постоянного лечения. Другое ограничение, связанное с уже существующим препаратом в виде раствора для инъекций, содержащим ингибиторы слияния ВИЧ [с клеткой], заключается в том, что достаточно трудно получить нужный раствор для инъекций, в котором концентрация синтетического пептида составляла бы не менее 100 мг/мл и использование которого не сталкивалось бы с проблемой вязкости (где такой препарат похож скорее на гель, чем на раствор) и/или нестабильности (например, осаждения синтетического пептида из раствора в течение предварительно определенного периода времени).

Было обнаружено, что полиолы, в частности полиэтиленгликоль (ПЭГ), хорошо переносятся организмом и, как считается, имеют относительно низкий уровень токсичности при его использовании в качестве фармацевтически приемлемого носителя в растворе для инъекций, содержащем лекарственный препарат. Так, например, ПЭГ был использован в качестве фармацевтически приемлемого носителя в препаратах в виде раствора для инъекций, разрешенных к применению и содержащих лекарственное средство, содержащее химические композиции, отличные от пептидов и белков. Количество ПЭГ, присутствующее в таких композициях, обычно составляет примерно от 0,1% до 5% от массы композиции. ПЭГ никогда не был использован в качестве фармацевтически приемлемого носителя для поддержания уровня белков и пептидов в растворе, но он использовался для осаждения белков и пептидов. Так, например, поверхностный антигенный белок вируса гепатита В может быть очищен посредством цикла преципитации с использованием от 1% до 10% ПЭГ (масс./об., см., например, патент США № 5462863); секреторный IgA может быть очищен с использованием ПЭГ в концентрации от 15% до 25% ПЭГ (масс./об.); фибриноген может быть осажден с использованием ПЭГ в количестве 2,5 масс.%; аспаригиназа может быть осаждена раствором 40-60 масс.% ПЭГ; и антигемофилический фактор может быть осажден ПЭГ при конечной концентрации 3-6% ПЭГ (масс./об.). Таким образом, осаждение из раствора белка или пептида, вводимого в препарат в виде раствора для инъекций, при использовании в фармацевтической композиции ПЭГ в качестве фармацевтически приемлемого носителя в концентрации, равной или превышающей 5 масс.%, является очень нежелательным эффектом. В качестве одного из примеров (см., например, патент США № 6004549) описана фармацевтическая композиция, состоящая из суспензии белка в полиоле, то есть кристаллическая форма интерферона, суспендированного в растворе или геле, содержащем 40% водный раствор ПЭГ 8000 (масс./об.) или 50% раствор ПЭГ 3350 (цифра после “ПЭГ” означает приблизительную молекулярную массу стандартного ПЭГ в дальтонах, обсуждаемого более подробно ниже).

Однако до настоящего времени не были описаны фармацевтические композиции, состоящие из раствора, содержащего смесь синтетического пептида (ингибитора слияния ВИЧ [с клеткой]) и полиола, такого как ПЭГ, в конечной концентрации не менее чем 5 массовых процентов (%) (например, процент по массе/объему) и не более чем 75 масс.%. До появления настоящего изобретения существовала давно назревшая необходимость в получении препарата фармацевтической композиции, который (а) мог бы быть использован в виде раствора для инъекций, (b) содержал бы синтетический пептид (ингибитор слияния ВИЧ [с клеткой]) в концентрации не менее чем 100 мг/мл в растворе, обладающего достаточной стабильностью для его применения в нужных целях, в частности в целях снижения, насколько это возможно, числа инъекций, необходимых для введения эффективного количества синтетического пептида для достижения терапевтического эффекта; и (с) позволял бы минимизировать побочные реакции на участке инъекции. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих требований.

Краткое описание изобретения

Указанные выше требования удовлетворяются настоящим изобретением благодаря получению фармацевтической композиции, состоящей из раствора, содержащего синтетический пептид (ингибитор слияния ВИЧ с клетками) в смеси с полиолом, где указанный полиол присутствует в конечной концентрации не менее чем 5 масс.% и не более чем 75 масс.%, и более предпочтительно менее чем 10 масс.% и не более чем 50 масс.% от массы фармацевтической композиции. Указанная фармацевтическая композиция содержит раствор для инъекций, который дает неожиданные результаты и обладает значительно улучшенными свойствами по сравнению с используемыми в настоящее время композициями. В частности, фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит раствор для инъекций, который, по сравнению с композицией на основе маннита или другими известными композициями, (а) позволяет значительно снизить время разведения при получении фармацевтической композиции; (b) позволяет значительно снизить вязкость фармацевтической композиции; (с) обеспечивает подходящую микросреду, окружающую синтетический пептид (ингибитор слияния ВИЧ [с клеткой]), что позволяет, помимо других преимуществ, вводить в раствор синтетический пептид (ингибитор слияния ВИЧ [с клеткой]) в более высокой концентрации (например, равной или превышающей 100 мг/мл), и сохранять этот раствор стабильным, что может оказаться желательным для длительного хранения продукта; и который (d) позволяет заметно снизить частоту возникновения и интенсивность побочных реакций на участке инъекции при использовании указанной композиции в виде раствора для инъекций.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу получения фармацевтической композиции настоящего изобретения, предусматривающему получение смеси синтетического пептида с полиолом, где указанный полиол присутствует в конечной концентрации не менее чем 5 масс.% и не более чем 75 масс.%, и более предпочтительно менее чем 10 масс.% и не более чем 50 масс.% от массы фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения ВИЧ-инфекции (предпочтительно ВИЧ-1-инфекции), предусматривающему введение ВИЧ-инфицированному индивиду фармацевтической композиции настоящего изобретения. Предпочтительно, чтобы указанная фармацевтическая композиция была введена в количестве, эффективном для ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, и/или в количестве, эффективном для ингибирования gp41-опосредованного слияния ВИЧ с клеткой-мишенью.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей синтетический пептид (ингибитор слияния ВИЧ [с клеткой]) и используемой в виде стандартной дозы, где указанная фармацевтическая композиция включает водную композицию, содержащую: (а) полиол, присутствующий в качестве фармацевтически приемлемого носителя в количестве не менее чем 5 масс.% и не более чем 75 масс.% от массы фармацевтической композиции, используемой в виде стандартной дозы, и более предпочтительно полиол, присутствующий в качестве фармацевтически приемлемого носителя в количестве не менее чем 10 масс.% и не более чем 50 масс.% от массы фармацевтической композиции, используемой в виде стандартной дозы, и (b) синтетический пептид в количестве не менее чем 70 мг/мл и не более чем 500 мг/мл, и более предпочтительно в количестве не менее чем 100 мг/мл и не более чем 250 мг/мл. Настоящее изобретение также относится к способу лечения ВИЧ-инфекции (предпочтительно ВИЧ-1-инфекции), предусматривающему введение ВИЧ-инфицированному индивиду фармацевтической композиции настоящего изобретения, содержащей синтетический пептид (ингибитор слияния ВИЧ [с клеткой]) и используемой в виде стандартной дозы. Предпочтительно, чтобы такая фармацевтическая композиция была введена в количестве, эффективном для ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, и/или в количестве, эффективном для ингибирования gp41-опосредованного слияния ВИЧ с клеткой-мишенью.

Вышеуказанные и другие цели, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения со ссылками на прилагаемый графический материал.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 схематически представлен gp41 ВИЧ-1, где показана область 1 гептадного повтора (HR1) и область 2 гептадного повтора (HR2) вместе с другими функциональными областями gp41. Примеры пептидных последовательностей, соответствующих HR1 (SEQ ID NO:1) и HR2 (SEQ ID NO:2) штамма LAI ВИЧ-1, приводятся лишь в целях иллюстрации. Аминокислотные остатки пронумерованы в соответствии с их положениями в gp160 штамма ВИЧ_IIIB.

Подробное описание изобретения

Определения:

Термин “индивид”, используемый в описании и в формуле изобретения, относится к млекопитающему, предпочтительно к человеку.

Термин “клетка-мишень”, используемый в описании и формуле изобретения, означает клетку, которая может подвергаться ВИЧ-инфицированию. Такой клеткой предпочтительно является клетка или клетки человека, и более предпочтительно клетки человека, которые могут подвергаться ВИЧ-инфицированию по определенному механизму, включая мембранное слияние.

Термин “фармацевтически приемлемый носитель”, используемый в описании и формуле изобретения, означает среду-носитель, которая не оказывает значительного влияния на биологическую активность активного ингредиента (например, конъюгата настоящего изобретения или соединения, полученного способом настоящего изобретения) при его добавлении в данную среду. В соответствии с настоящим изобретением, фармацевтически приемлемым носителем в фармацевтической композиции, содержащей водный раствор для инъекций согласно изобретению, является полиол. Такая фармацевтическая композиция может включать в себя один или несколько других дополнительных фармацевтически приемлемых носителей (то есть один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, помимо полиола). Как известно специалистам в данной области, для использования в растворе для инъекций или в водном препарате подходящий фармацевтически приемлемый носитель может содержать одно или несколько веществ, включая, но не ограничиваясь ими, воду, забуференную воду, физиологический раствор, 0,3% глицин, водные спирты, изотонический водный буфер; и, кроме того, он может включать в себя одно или несколько веществ, таких как глицерин, масла, соли, такие как соли натрия, калия, магния и аммония, фосфонаты, сложные эфиры карбоновых кислот, жирные кислоты, сахариды (например, маннит), полисахариды, эксципиенты и консерванты и/или стабилизаторы (предназначенные для увеличения срока хранения, если это необходимо, и подходящие для изготовления и коммерческого распределения данной композиции). Предпочтительно, чтобы данный носитель был подходящим для внутривенного, внутримышечного, подкожного или парентерального введения (например, путем инъекции).

Термин “аминокислота”, используемый в описании и в формуле изобретения и относящийся к синтетическим пептидам согласно изобретению, означает молекулу, которая имеет по меньшей мере одну свободную аминогруппу и по меньшей мере одну свободную карбоксильную группу. Такая аминокислота может иметь более чем одну свободную аминогруппу или более чем одну свободную карбоксильную группу, либо, кроме того, она может содержать одну или несколько свободных химических реакционноспособных групп, не являющихся аминогруппой или карбоксильной группой (например, гидроксил, сульфгидрил и т.п.). Аминокислотой может быть природная аминокислота (например, L-аминокислота), неприродная аминокислота (например, D-аминокислота), синтетическая аминокислота, модифицированная аминокислота, аминокислотное производное, предшественник аминокислоты и ее консервативная замена. Каждому специалисту в данной области известно, что выбор аминокислот, включенных в пептид, отчасти зависит от конкретных физических, химических или биологических свойств противовирусного пептида. Такие свойства, отчасти, определяются, структурой и функцией (например, противовирусной активностью, более подробно описанной ниже). Так, например, из приводимого описания изобретения каждому специалисту в данной области будет очевидно, что аминокислоты в синтетическом пептиде могут представлять собой одну или несколько природных (L)-аминокислот и неприродных (D)-аминокислот. Аминокислоты, не являющиеся предпочтительными, могут быть заменены предпочтительными аминокислотами.

Термин “консервативная замена”, относящийся к аминокислотной последовательности синтетического пептида, полученного в соответствии с настоящим изобретением, и используемый в описании и в формуле настоящего изобретения, означает одну или несколько аминокислотных замен в последовательности синтетического пептида, а именно таких замен, при которых противовирусная активность остается в основном неизменной (т.е. если она ингибирует gp41-опосредованное слияние ВИЧ [с клетками] при концентрации в наномолярном масштабе, как до осуществления такой замены, так и после ее осуществления). Как известно в данной области, “консервативная замена”, которая определяется указанными выше функциями, предусматривает замены аминокислот, имеющих в основном тот же самый заряд и размер и такую же гидрофильность и/или ароматичность, что и замененная аминокислота. Такими консервативными заменами, известными специалистам в данной области, являются, не ограничиваясь ими, замены глицин-аланин-валин; изолейцин-лейцин; триптофан-тирозин; аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота; аргинин-лизин; аспарагин-глутамин и серин-треонин. Такие аминокислотные замены могут также содержать полиморфизмы в различных положениях аминокислот в соответствующей области HR1 gp41, обнаруженные в лабораторных и/или в клинических изолятах ВИЧ, могут быть легко получены из общедоступных баз данных и хорошо известных специалистам в данной области.

Термин “нативная последовательность”, используемый в описании и в формуле изобретения и относящийся к аминокислотной последовательности области HR1 или области HR2 gp41 ВИЧ-1, означает природную последовательность, обнаруженную в лабораторных штаммах ВИЧ и/или в клинических изолятах ВИЧ. Такие последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных генов, таких как GenBank, и представляют собой последовательности с заменами (например, в результате полиморфизма), обнаруженные в различных положениях аминокислотной последовательности области HR1 и области HR2 gp41 ВИЧ.

Термин “полиол”, используемый в описании и в формуле изобретения, означает полимер, который применяется в качестве фармацевтически приемлемого носителя и представляет собой водорастворимый многоатомный спирт, и примерами такого полимера являются, не ограничиваясь ими, полиолы, полиэтиленгликоль (“ПЭГ”), полипропиленгликоль (“ППГ”), диэтиловый спирт, триэтиленгликоль, этиленгликоль, дипропиленгликоль, сополимеры, содержащие ППГ (например, сополимер этиленгликоля/ППГ), сополимеры, содержащие ПЭГ (например, ПЭГ/ППГ) и т.п. Термин “полиолы” включает как гомополимеры, так и сополимеры, и, кроме того, они могут иметь структуру, включающую разветвленную структуру или линейную структуру, известную специалистам в данной области. Предпочтительно, чтобы используемый полимер был в основном нетоксичным при его введении индивиду in vivo. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полимер имеет молекулярную массу в пределах примерно от 200 дальтон до 20000 дальтон, и в более предпочтительном варианте указанный полимер имеет молекулярную массу в пределах примерно от 300 дальтон до 10000 дальтон. Предпочтительный полимер, используемый в целях настоящего изобретения, содержит полиэтиленгликоль, и более предпочтительный полимер, используемый в целях настоящего изобретения, содержит полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу в пределах примерно не менее чем 1000 дальтон и не более чем 10000 дальтон. Так, например, полиэтиленгликоль состоит из ряда повторяющихся оксиэтиленовых групп, где среднее число повторяющихся оксиэтиленовых групп в основном коррелирует со средней молекулярной массой полиэтиленгликоля. Кроме того, в этом примере полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ6000) описан как полимер, имеющий молекулярную массу в пределах от 5000 дальтон до 7000 дальтон (например, молекулярную массу в пределах примерно не менее чем 1000 дальтон и не более чем 10000 дальтон). Аналогичным образом, ПЭГ1500 описан как полимер, имеющий молекулярную массу в пределах от 1430 дальтон до 1570 дальтон. Полимер, не являющийся предпочтительным, может быть заменен предпочтительным полимером согласно изобретению.

Используемые в описании и в формуле изобретения термины “синтетический пептид” и “ингибитор слияния ВИЧ [с клеткой]”, являющиеся синонимами и относящиеся к пептиду, используемому в настоящем изобретении, означают пептид, (а) полученный путем химического синтеза, рекомбинантной экспрессии, биохимической или ферментативной фрагментации более крупной молекулы, химического расщепления более крупной молекулы или их комбинацией; либо, в общих чертах, полученный и выделенный другими известными в данной области методами; (b) имеющий аминокислотную последовательность, содержащую не менее чем примерно 15 аминокислотных остатков и не более чем примерно 60 аминокислотных остатков и состоящую из не менее чем 10 смежных аминокислот, принадлежащих либо к области HR1, либо к области HR2 gp41 ВИЧ (более предпочтительно ВИЧ-1); и (с) способный ингибировать передачу ВИЧ клетке-мишени (предпочтительно путем образования комплекса с любой из областей HR gp41 ВИЧ и/или предотвращения слияния между ВИЧ-1 и клеткой-мишенью), как может быть определено путем оценки противовирусной активности in vitro и/или in vivo и как будет более подробно описано ниже. Термин “выделенный”, относящийся к пептиду, означает, что синтетический пептид в основном не содержит компонентов, которые не являются частью целой структуры самого пептида, например в основном не содержит клеточный материал или культуральную среду, в которые используются при продуцировании рекомбинантными методами, или основном не содержит химических предшественников или других химических веществ, используемых при химическом синтезе или продуцируемых в биохимических или химических реакциях. Аминокислотная последовательность синтетического пептида может включать в себя одну или несколько аминокислотных замен и/или одну или несколько полиморфизм, обнаруженных в последовательности в релевантной области gp41 ВИЧ, либо она может включать в себя одну или несколько аминокислотных замен, которые вводят для стабилизации спиральной структуры и/или для воздействия на олигомеризацию так, чтобы происходила самосборка пептидов в тример, при условии, что при этом будет сохраняться противовирусная активность, направленная против ВИЧ-1. Кроме того, аминокислотная последовательность, в дополнение к имеющемуся коровому пептиду, происходящему от gp41 ВИЧ, может содержать один или несколько энхансерных пептидов, связанных с коровым пептидом, например, у N-конца, у С-конца или же как у N-, так и у С-концов, либо она может содержать коровый пептид, происходящий от одного или нескольких ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV (см., например, патент США № 6258782). В зависимости от того, какой синтетический пептид используется в фармацевтической композиции, этот синтетический пептид может присутствовать в виде мономера или в олигомерной форме, включая, но не ограничиваясь ими, димер, тример, тетрамер или гексамер. Так, например, синтетические пептиды, содержащие модифицированные пептиды HR1, предпочтительно подвергаются самосборке в тримеры (например, в тример, состоящий из трех молекул синтетического пептида). Предпочтительно, чтобы синтетический пептид, используемый в настоящем изобретении, содержал последовательность, имеющую длину примерно не менее чем 15 аминокислотных остатков и не более чем 60 аминокислотных остатков, предпочтительно примерно не менее чем 36 аминокислотных остатков и не более чем 51 аминокислотный остаток, и более предпочтительно примерно не менее чем 41 аминокислотный остаток и не более чем 51 аминокислотный остаток. Предпочтительно, чтобы синтетический пептид, содержащий последовательность, происходящую от области HR1 gp41 ВИЧ, включал в себя непрерывную последовательность, состоящую по меньшей мере из 15 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, поскольку было обнаружено, что ключевые детерминанты в этой части области HR1 (например, последовательность, обозначенная однобуквенными кодами, NNLLRAIEAQQHLL QLTVWGIKQLQARI LAVERYLKD, которая представляет собой последовательность SEQ ID NO:1, простирающуюся от аминокислотного остатка 18 до аминокислотного остатка 54) влияют на структурные биохимические и противовирусные параметры, описанные в настоящем изобретении. При этом предпочтительно, чтобы последовательность синтетического пептида, происходящая от области HR2 gp41 ВИЧ, включала в себя непрерывную последовательность, состоящую по меньшей мере из 15 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и более предпочтительно включала в себя последовательность QQEKNEQEL (которая представляет собой последовательность SEQ ID NO:2, простирающуюся от аминокислотного остатка 43 до аминокислотного остатка 51), поскольку было обнаружено, что ключевые детерминанты в этой части области HR2 влияют на структурные биохимические и противовирусные параметры, описанные в настоящем изобретении. Большое число таких синтетических пептидов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, были описаны ранее (например, в патентах США № 5656480, 6133418 и 6258782). Иллюстративными примерами синтетических пептидов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, не ограничиваясь ими, синтетические пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:3-95. В описании и в формуле изобретения термин “синтетический пептид”, используемый вместе с “полиолом” или “ПЭГ” в качестве компонентов (например, в виде растворенных твердых веществ) в фармацевтической композиции согласно изобретению, означает, что указанный синтетический пептид и полимер не являются конъюгированными друг с другом (например, не связаны друг с другом ковалентной связью).

В описании и формуле изобретения термин “массовый процент”, масс.%, известен в данной области и может быть использован как синоним термина процент по массе/объему, и этот термин означает миллиграммы (мг) ингредиента (например, полиола), присутствующего в фармацевтической композиции, на миллилитр (мл) раствора, умноженный на 0,1, как будет более понятно из нижеследующего описания.

В описании и формуле изобретения термин “раствор”, известный в данной области и относящийся к водной жидкости, в которой растворены одно или несколько твердых веществ, означает водный раствор, содержащий синтетический пептид и полиол, растворенные в этом растворе в реально используемых концентрациях и температуре, как более подробно будет описано ниже и как известно в данной области по приготовлению лекарственных средств для инъекций. В данной области известны различные пути определения образования раствора, в отличие от образования суспензии, а именно путем визуальной оценки чистоты раствора (раствор обычно бывает прозрачным, в отличие от суспензии, которая является мутной), по пропусканию света и т.п.

Настоящее изобретение проиллюстрировано в следующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение ими настоящего изобретения.

Пример 1

В этом примере проиллюстрирована фармацевтическая композиция согласно изобретению, где в нескольких вариантах, проиллюстрированных в этом примере, используется Т1249 (SEQ ID NO:5, см. патент США № 6258752). Однако следует понимать (и показано примерами данного описания), что синтетический пептид, не являющийся Т1249 (SEQ ID NO:5), также может быть использован в фармацевтической композиции согласно изобретению, в частности, потому, что синтетические пептиды такого класса (пептиды-ингибиторы слияния ВИЧ [с клеткой]) имеют общие структурные биохимические и функциональные признаки. Более конкретно, синтетические пептиды такого класса содержат суперспирализованные гептадные повторы, которые могут участвовать в молекулярных взаимодействиях, приводящих к растворимости в водном растворе, содержащем полиол, как будет более подробно описано ниже. Другими общими структурными, биохимическими и функциональными признаками являются, не ограничиваясь ими, наличие аминокислотной последовательности, содержащей один или несколько мотивов типа лейциновой молнии, способность образовывать суперспирализованную структуру, способность подвергаться олигомеризации и способность ингибировать передачу ВИЧ клетке-мишени.

Пептиды, используемые в этих примерах, синтезировали на пептидном синтезаторе стандартными методами твердофазного синтеза и стандартными методами химии пептидов, с использованием FMOC или пептидной фрагментации и сборки, как описано в патенте США № 6281331. В этих примерах синтетические пептиды дополнительно содержали реакционноспособные функциональные группы, то есть были блокированы по N-концу ацетильной группой и по С-концу - амидной группой. После отщепления от смолы синтетические пептиды осаждали и осадок лиофилизовали. Затем пептиды очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой, и идентичность пептидов подтверждали с помощью масс-спектрометрии электрораспылением.

Фармацевтическая композиция, проиллюстрированная в этом примере, состояла из раствора, содержащего синтетический пептид в конечной концентрации не менее чем 100 мг/мл и полиол в конечной концентрации не менее чем 5 масс.% и не более чем 75 масс.%, и более предпочтительно в конечной концентрации не менее чем 10 масс.% и не более чем 50 масс.% от массы фармацевтическая композиции. В данном примере также описана фармацевтическая композиция, содержащая синтетический пептид (ингибитор слияния ВИЧ [с клеткой]) и используемая в виде стандартной дозы, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой водный препарат, содержащий полиол, присутствующий в качестве фармацевтически приемлемого носителя в количестве не менее чем 5 масс.% от массы фармацевтической композиции, используемой в виде стандартной дозы, и более предпочтительно не менее чем 10 масс.% от массы фармацевтической композиции, используемой в виде стандартной дозы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полиол составляет не более чем 75 масс.%, и более предпочтительно не более чем 50 масс.% от массы фармацевтической композиции. Предпочтительно, чтобы конечная концентрация синтетического пептида в фармацевтической композиции составляла не менее чем 70 мг/мл и не более чем 500 мг/мл, и более предпочтительно не менее чем 100 мг/мл и не более чем 250 мг/мл. Кроме того, была предоставлена фармацевтическая композиция в виде стандартной дозы, содержащая синтетический пептид (пептид-ингибитор слияния ВИЧ [с клеткой]), где указанная фармацевтическая композиция содержит водный препарат, содержащий полиол в качестве фармацевтически приемлемого носителя и в количестве не менее чем 10 масс.% и не более чем 50 масс.% от массы фармацевтической композиции, используемой в виде стандартной дозы. При этом предпочтительно, чтобы конечная концентрация синтетического пептида в данной фармацевтической композиции составляла не менее чем 70 мг/мл и не более чем 500 мг/мл, и более предпочтительно не менее чем 100 мг/мл и не более чем 250 мг/мл.

Используемые ранее в клинической практике композиции в виде растворов для инъекций, содержащие Т1249 (SEQ ID NO:5), изготавливались в дозах 12,5 мг/мл, 25 мг/мл или 48 мг/мл, на основе препарата, называемого “препаратом на основе маннита”. Так, например, разовая лекарственная форма 48 мг/мл содержала лиофилизованную композицию, содержащую 55 мг Т1249 и 40 мг маннита, рН которой был предварительно скорректирован, и которую затем разводили 1,1 мл стерильной воды и инъецировали в виде разовой лекарственной формы. В настоящее время давно назрела необходимость в получении препаратов в виде растворов для инъекций, содержащих более высокие дозы Т1249 (SEQ ID NO:5) (наиболее предпочтительно, чтобы такая доза составляла не менее чем примерно 100 мг/мл на стандартную дозу). Для удовлетворения этих требований были изготовлены различные фармацевтические композиции, которые более подробно описаны ниже. В таблице 1 показано сравнение препарата в виде раствора, содержащего стандартное количество ПЭГ (например, примерно 0,5 масс.%) и синтетический пептид (“препарат А”), с фармацевтической композицией согласно изобретению (содержащей, например, не менее чем 10 масс.% ПЭГ) (“препарат В”), каждый из которых разводили 1,1 мл стерильной воды. Неожиданно было обнаружено, что для разведения фармацевтической композиции, содержащей 10% масс.% ПЭГ (препарат В), требовалось значительно меньше времени, чем для разведения препарата А, до создания раствора, который можно было бы вводить через шприц (термин “введение шприцем” означает введение иглой 27-го калибра, что дает возможность использовать раствор для инъекций в качестве лекарственного препарата). Содержание измеряли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления стандартными методами, известными в данной области.

Таблица 1
	Препарат А	Препарат В
Т-1249 (SEQ ID NO:5)	118 мг/мл	118 мг/мл
Содержание ПЭГ 1500	5,5 мг/мл	110 мг/мл
Содержание маннита	27,5 мг/мл	27,5 мг/мл
Время разведения	19 минут	12 минут
Возможность введения шприцом	да	да
рН	6,8	6,8

Были представлены дополнительные примеры фармацевтических композиций (см., например, таблицу 2, препараты “1”, “2”, “3”, “4” и “5”), где количество ПЭГ 1500 б